Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
FORTALEZA
2009
2
FORTALEZA
2009
3
BANCA EXAMINADORA
____________________________
Profª Drª Andrelina Noronha Coelho de Souza
Universidade Estadual do Ceará
____________________________
Profª Drª Crystianne Calado Lima
Universidade Estadual do Ceará
____________________________
Prof° Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães
Universidade Federal do Ceará
4
Agradecimentos
Ao meu orientador, Profº Dr. José Henrique Leal Cardoso, por todos os
inestimáveis ensinamentos e por despertar em mim o amor pela ciência. Obrigada
Professor Henrique, pela paciência, pelas oportunidades oferecidas e por acreditar e
confiar em mim, mesmo em momentos adversos.
Aos meus pais, Denizar Lauser Neves e Mara Eliane Peixoto Neves, pelo amor
incondicional e pelo exemplo de dignidade, respeito e educação. Pelo valioso apoio,
pelas palavras de incentivo e motivação que foram fundamentais nos momentos de
desistência. Não tenho palavras para agradecer por tudo o que vocês representam
na minha vida.
À minha irmã, Francielle Peixoto Neves, pela paciência e apoio durante toda esta
jornada.
À minha linda amiga Maria Diana Moreira Gomes que, com sua alegria e vontade
de viver, tornou a minha vida mais colorida. Obrigada pela amizade e cumplicidade,
pelas palavras de incentivo, por estar sempre ao meu lado em todos os momentos
da minha vida, sempre com muita paciência aguentando o meu mau humor.
Obrigada por você existir na minha vida, pelo carinho e atenção dispensados a mim.
Ao professor Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães, pela gentileza em ceder algumas
drogas e, principalmente, por contribuir com sua experiência e sabedoria para
melhorar o meu trabalho.
5
Ao professor Dr. Saad Lahlou, pela dedicação e por aperfeiçoar o meu trabalho com
sua experiência e sabedoria.
Aos amigos Francisco Walber Ferreira da Silva e Kerly Shamyra da Silva Alves,
pela amizade, companheirismo e palavras de incentivo. Obrigada Kerly, pela
disposição e pelo tempo dispensado aos meus experimentos no setup intracelular.
Ao colega Francisco José Ferreira dos Santos (Franck), pela convivência e pela
dedicação com que cuida dos nossos animais.
À Deus, por permitir que eu alcance todos os meus objetivos e sonhos, por me dar
força e coragem para enfrentar todas as adversidades e obstáculos.
6
Sumário
Página
Lista de Figuras 9
Lista de Tabelas 11
Lista de Abreviaturas 12
Resumo 14
Abstract 15
INTRODUÇÃO 16
CONSIDERAÇÕES GERAIS 16
Mecanismo de contração 18
PRODUTOS NATURAIS 24
Timol e Carvacrol 25
RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA 32
OBJETIVOS 34
MATERIAL E MÉTODOS 35
MATERIAL 35
Sais e fármacos 35
Soluções 35
Animais 36
MÉTODOS 36
Preparação in vitro 36
Protocolos experimentais 38
8
Tratamento estatístico 45
RESULTADOS 46
CONCLUSÃO 82
REFERÊNCIAS 83
9
Lista de Figuras
Figura Página
Lista de Tabelas
Tabela Página
Lista de Abreviaturas
Resumo
Timol e carvacrol são extraídos de alguns óleos essenciais de plantas dos gêneros
Origanum, Thymus e Lippia. Esses monoterpenóides apresentam, dentre outras
atividades biológicas, importante efeito relaxante no músculo liso. Este estudo visa
avaliar o efeito vasorrelaxante do timol e carvacrol em aorta isolada de rato e seus
possíveis mecanismos de ação. Foram utilizadas preparações de anéis de aorta
isolada mantidas em Tyrode modificado aerado, pH 7,4, a 37° C, para registro
isométrico das contrações musculares. Utilizaram-se também anéis de aorta isolada
mantidos em temperatura ambiente para registros eletrofisiológicos pela técnica do
microeletrodo intracelular. Em 1000 µM, o tônus foi aumentado de forma significante
somente pelo timol. Timol e carvacrol inibiram contrações de anéis de aorta
induzidas por KCl (60 mM) (CE50: 203,9±48,92 e 195,6±6,94 µM, respectivamente) e
por fenilefrina (FE, 0,1 µM) (CE50:115,2±18,47 e 105,5±13,90 µM, respectivamente).
Além disso, relaxaram de forma dependente de concentração preparações de anéis
de aorta pré-contraídas por KCl (80 mM) (CE50: 64,4±4,4 e 78,8±11,9 µM,
respectivamente) ou por FE (0,1 µM) (CE50: 106,4±11,3 e 145,4±6,0 µM,
respectivamente). Todos esses efeitos permaneceram inalterados pela remoção do
endotélio ou em presença de L-NAME. Em 1000 mM, timol e carvacrol relaxaram a
contração de KCl de forma similar ao relaxamento produzido pelo inibidor de Rho
cinase, Y27632. Em 400 µM, timol e carvacrol reduziram significativamente
contrações induzidas por CaCl2 em meio isento de Ca2+. Em meio isento de Ca2+
contendo EGTA (2 mM), a concentração de 1000 mM de timol e carvacrol aboliu
completamente a contração induzida por FE, bem como reduziu significativamente a
contração sustentada por dibutirato de forbol (1 µM). Em presença de tapsigargina (1
µM), a magnitude deste ultimo efeito relaxante foi aumentado. Entretanto, 1000 µM
de timol e carvacrol não alterarou o potencial de repouso das células de músculo liso
vascular. Em conclusão, timol e carvacrol induziram um relaxamento independente
do endotélio que parece ser mediado por mecanismos intracelulares. Estes
mecanismos envolvem provavelmente a liberação de Ca2+ do retículo
sarcoplasmático e/ou a regulação da sensibilidade ao Ca2+ do sistema contrátil do
músculo liso vascular.
Palavras-chave: Acoplamento excitação-contração; aorta isolada; carvacrol;
músculo liso; timol; vasorrelaxante.
15
Abstract
Thymol and carvacrol are extracted of essential oils obtained from various genera
such as Origanum, Thymus, and Lippia. The present study was undertaken to
assess the vasorelaxant effects of thymol and carvacrol in rat isolated thoracic aorta
and the putative mechanisms underlying these effects. Isolated aortic rings
preparations were maintained in aerated modified Tyrode solution, pH 7,4 at 27°C,
for isometric recordings of smooth muscle contractions. Eletrofisiologic recordings
were done in aortic rings preparations at room temperature through intracellular
microeletrode technique. At 1000 µM, thymol significantly increased the resting tonus
of vascular smooth muscle. Thymol and carvacrol inhibited contractions induced by
KCl (60 mM) (CE50: 203,9 ± 48,92 and 195,6 ± 6,94 µM, respectively) and by
phenylephrine (PHE, 0,1 µM) (CE50:115,2±18,47 and 105,5±13,90 µM, respectively).
Also, both terpenoids produced a concentration-dependent relaxation aortic ring
preparations pre-contracted by KCl (80 mM) (EC50 value of 64.40±4.41 and
78.80±11.91 µM, respectively) or by PHE (0,1 µM) (IC50 value of 106.40±11.37 and
145.40±6.07 µM, respectively). All these effects remained unaltered by vascular
endothelium removal and L-NAME presence. At 1000 µM, thymol and carvacrol
relaxed the KCl-induced contraction similarly to the relaxation produced by Rho
kinase inhibitor, Y27632. In Ca2+-free medium with EGTA (2 mM), thymol and
carvacrol, both at 1000 µM, completely abolished the phasic component of PHE-
induced contractions. At 400 µM, thymol and carvacrol significantly reduced the
CaCl2-induced contractions in a Ca2+-free medium. Furthermore, both thymol and
carvacrol (300 and 1000 µM) significantly reduced the contraction evoked by phorbol
dibutyrate (1 µM), an activator of protein kinase C. Magnitude of this inhibitory effect
was enhanced in the presence of the Ca2+ pump inhibitor, thapsigargin (1 µM). At
1000 µM, neither thymol nor carvacrol altered the resting potential of vascular
smooth muscle cells. In conclusion, thymol and carvacrol induced an endothelium-
independent relaxation in rat isolated aorta. This effect seems mediated through an
intracellular mechanism probably involving a transduction pathway between Ca2+
release from sarcoplasmic reticulum and/or regulation of the Ca2+ sensitivity of the
contractile system of vascular smooth muscle.
Keywords: Carvacrol; Excitation-contraction coupling; Isolated aorta; Thymol;
Vasorelaxant
16
INTRODUÇÃO
CONSIDERAÇÕES GERAIS
Mecanismo de contração
Agonistas
(norepinefrina, angiotensina II,
entotelina, etc.)
Ca2+
Fosfolipase
C diacilglicerol Canais de Ca2+
trifosfato de proteina operados por
voltagem
inositol cinase C
Ca2+
Ca2+ retículo
sarcoplasmático
Ca2+
Calmodulina
(CaM)
MLCK
rMLC rMLC fosforilada
(relaxamento) + actina
MLCP (contração)
Figura 1. Via de sinalização molecular envolvendo a contração do músculo liso induzida por
agonista ou por ativação de canais de Ca2+. Ca2+: cálcio; MLCK: cinase da cadeia leve da
miosina; MLCP: fosfatase da cadeia leve da miosina; PIP2: bifosfato de fosfotidilinositol
(Fonte: Hilgers e Webb, 2005).
20
Influxo
de Ca2+
liberação
de Ca2+
Via dependente do
Ca2+ rMLC
(MLCK)
(MLCP ativa)
Via independente
do Ca2+ rMLC P
(RhoK) (MLCP inativa)
Contração
PRODUTOS NATURAIS
Timol e Carvacrol
Características físico-químicas
bem como, pouca solubilidade em água. Seu ponto de fusão é de 2°C e seu ponto
de ebulição é de 234 – 236°C.
a b
Utilidades na indústria
Uma mistura de carvacrol, timol e eugenol (25 µl de cada um), foi adicionada
em uma gordura estéril e aplicada em embalagens termoseladas com dois tipos de
filmes de permeabilidade diferentes contendo uva da variedade Aledo. Os resultados
mostraram que as uvas tratadas com essa mistura possuem retardos significativos
no processo de maturação e com menores perdas de firmeza, acidez e menor perda
de cor. A contagem de aeróbios mesófilos foram inferiores nas uvas tratadas,
demonstrando que essa mistura de componentes garantiu a segurança do produto
sem alterar a qualidade sensorial (Valverde et al., 2006).
29
Ainda com uma possível ligação à atividade antioxidante, foi descoberto que
timol, carvacrol e seus derivados, timoquinona e timohidroquinona, são capazes de
inibir a atividade da acetilcolinesterase (Jukic et al., 2007).
Alguns estudos mostram que canais da membrana também são afetados por
esses terpenóides. Correntes de potássio foram suprimidas pelo timol (Magyar et al.,
2002) em cardiomiócitos de vários mamíferos. Timol e carvacrol suprimiram
correntes de cálcio do tipo L em cardiomiócitos de caninos e humanos. Essa
supressão foi influenciada pelos substituintes do anel benzeno dos terpenóides e o
efeito bloqueador dessas substâncias pode envolver interações com a maquinaria
de inativação do canal (Magyar et al., 2004).
Por outro lado, a ação direta do timol sobre as proteínas contráteis de células
cardíacas foi sugerida (Szentandrássy et al., 2004) e posteriormente confirmada por
Tamura e Iwamoto (2004). Neste estudo, foi reportado que o timol possui uma ação
peculiar sobre a miosina do músculo esquelético: potencializa a sua atividade
ATPase, mas reduz os parâmetros da cinética da contração.
RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL
Sais e fármacos
Soluções
Animais
MÉTODOS
Preparação tecidual
Protocolos experimentais
K60 K60 K60 K60
Doses crescentes e não cumulativas (1, 3, 10, 30, 100, 200, 300, 400, 600 e
1000 µM) de timol ou carvacrol foram administradas ao banho cinco minutos antes
da exposição da aorta a substâncias contraturantes nas suas concentrações
submáximas, KCl (60 mM) ou FE (0.1 µM), para avaliar o seu efeito
antiespasmódico.
TM
1 3 (...)
600
1000
K60 K60 K60 K60
Timol/Carvacrol
1 3 10 (...) 1000 2000 TM
K60 K60 K60 K60
TM 0Ca2+ TM 0Ca2+
K60 K60 FE FE FE K60 FE FE
K80/0Ca2+/EGTA K80/0Ca2 TM
CaCl2
10 20
0.3
1
0.1 0.3
K60 K60 FE FE K60 K60
0Ca 2+
TM
K60 K60 DBF K60 K60
Para avaliar a atuação do timol e carvacrol pela via da Rho cinase, foi
promovida uma contração sustentada por solução isotônica de KCl (80 mM) e, sobre
o platô, foi administrado Y27632 (1 µM), um inibidor da proteína Rho cinase. Em
experimentos similares, timol ou carvacrol (1000 µM) foram administrados sobre a
contração de KCl (80 mM) para comparação com o efeito do Y27632.
TM
/
K60 K60 K80 K80 K60 K60
por cinco minutos. Finalmente, o tecido por exposto novamente à solução de Tyrode,
procedendo-se com a fase de recuperação, e registrou-se novamente o potencial
transmembrana por cinco minutos.
Tratamento estatístico
Resultados
0,2
Timol E+
Carvacrol E+
Controle
*
0,1
Tensão (g)
0,0
-0,1
1 10 100 1000 10000
[µ
µM]
Figura 13. Efeito do timol e carvacrol sobre o tônus basal de anéis de aorta em
presença de endotélio. Gráfico representativo das alterações induzidas pelo timol e
carvacrol no tônus basal de aorta com endotélio. Controle; • Timol; Carvacrol. Os
valores estão expressos como média ± E.P.M. * p < 0.05 Timol vs. veículo (two way ANOVA
seguido de Holm-Sidak).
48
a
0.5 g Controle (TM + DMSO) Recuperação
10 min
⁄⁄
K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60
1 3 10 30
100
300 600 1000
⁄⁄
K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60
1 3 10 30 100
200 300 400 600 1000
⁄⁄
K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60 K60
b 120
% Contração de KCl (60 mM)
100
80 *
60
40
E+ (n = 10)
E- (n = 7)
20
0
1 10 100 1000 10000
Timol [µ
µM]
c
120
% Contração de KCl (60 mM)
100
*
80
60
40
E+ (n = 6)
E- (n = 7)
20
Figura 14. Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre as contrações induzidas por
potássio em aorta isolada de rato. a) Traçados de experimentos originais mostrando o
efeito inibitório de concentrações crescentes não cumulativas de timol e carvacrol sobre
contrações induzidas por KCl (60 mM) em preparações de aorta com endotélio. O primeiro
painel mostra o efeito do veículo em preparações controle, enquanto o segundo e terceiro
mostram o efeito inibitório do timol e carvacrol, respectivamente. TM (lavagem). b) Gráfico
representativo do efeito inibitório do timol sobre as contrações induzidas por 60 mM de KCl
no músculo liso aórtico com e sem endotélio. • E+ (com endotélio); E- (sem endotélio). c)
Gráfico representativo do efeito inibitório do carvacrol sobre as contrações induzidas por 60
mM de KCl no músculo liso aórtico com e sem endotélio. E+ (com endotélio); E- (sem
endotélio). As linhas contínuas representam o ajuste da função logística sigmoidal para os
valores do timol e carvacrol. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa
o número de experimentos. *, primeiro efeito significante (P < 0,05, one-way ANOVA
seguido de Holm-Sidak).
51
Tabela 1
Timol Carvacrol
Nota: E+, aorta com endotélio intacto; E-, aorta com endotélio removido.*P < 0,05; **P < 0,001,
relaxamento do KCl vs. inibição do KCl; Os valores são expressos em µM (média ± E.P.M.).
52
Conforme pode ser verificado na figura 15a, o timol (1-2000 µM) foi capaz de
inibir completamente, de forma concentração-dependente (P < 0,001, one-way
ANOVA), as contrações induzidas por FE (0,1 µM) em aorta isolada com endotélio
presente e ausente. Em ambas as preparações, com e sem endotélio, essa inibição
foi significativa a partir da concentração de 30 µM (P < 0,05, one-way ANOVA
seguido de Holm-Sidak) (Fig. 15 b). Os valores de CE50, cujas diferenças não foram
estatisticamente significantes, foram iguais a 115,2 ± 18,47 (n = 10) e 113,5 ± 20,65
µM (n = 10), respectivamente em preparações com endotélio intacto e removido
(tabela 1).
a
0.5 g
Controle (TM + DMSO) Recuperação
10 min
⁄⁄
FE FE FE FE FE FE FE FE FE FE FE FE
⁄⁄
FE FE FE FE FE FE FE FE FE FE FE FE
1 3 10
30 100
200 300 400 600 1000
⁄⁄
FE FE FE FE FE FE FE FE FE FE FE FE
b
120
% Contração de FE (0,1 µM)
100
*
80
60
40
E+ (n = 10)
E- (n = 10)
20
c
120
% Contração de FE (0,1 µM)
100
*
80
60
40
E+ (n = 6)
E- (n = 9)
20
Figura 15. Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre as contrações induzidas por
fenilefrina em aorta isolada de rato. a) Traçados de experimentos originais mostrando o
efeito inibitório de concentrações crescentes não cumulativas de timol e carvacrol sobre
contrações induzidas por FE (0,1 µM) em preparações de aorta com endotélio. O primeiro
painel mostra o efeito do veículo sobre as contrações de FE em preparações controle,
enquanto o segundo e terceiro mostram o efeito inibitório do timol e carvacrol,
respectivamente. TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito inibitório do timol
sobre as contrações induzidas por 0,1 µM de FE no músculo liso aórtico com e sem
endotélio. • E+ (com endotélio); E- (sem endotélio). c) Gráfico representativo do efeito
inibitório do carvacrol sobre as contrações induzidas por 0,1 µM de FE no músculo liso
aórtico com e sem endotélio. E+ (com endotélio); E- (sem endotélio). As linhas contínuas
representam o ajuste da função logística sigmoidal para os valores do timol e carvacrol. Os
valores estão expressos como média ± E.P.M; n representa o número de experimentos. *,
primeiro efeito significante (P < 0,05, one-way ANOVA seguido de Holm-Sidak).
55
a
0.5 g Controle(TM+ DMSO)
10 min
▲ ▲
K60 K80 Timol (µM)
1 3 10
30
100
200
300 400 600 1000 2000
▲ ▲
K60 K80
Carvacrol (µM)
1 3 10 30
100
200
300
400 600 2000
1000
▲ ▲
K60 K80
120
% Contração de KCl (80 mM)
100
*
80
60
40
20 Timol E+ (n = 13)
Carvacrol E+ (n = 10)
0
-20
Figura 16. Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração mantida por
potássio em aorta isolada de rato. a) Traçados de experimentos originais mostrando o
efeito relaxante de concentrações crescentes cumulativas de timol e carvacrol sobre a
contração induzida por KCl (80 mM) em preparações de aorta com endotélio. Os painéis
superior, intermediário e inferior mostram o efeito do veículo (DMSO), timol e carvacrol,
respectivamente, sobre a contração mantida por KCl (80 mM) em aorta isolada com
endotélio. TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito relaxante do timol e carvacrol
sobre a contração induzidas por 80 mM de KCl no músculo liso aórtico com endotélio. •
Timol E+ (com endotélio); Carvacrol E+ (com endotélio). As linhas contínuas representam
o ajuste da função logística sigmoidal para os valores do timol e carvacrol. Os valores estão
expressos como média ± E.P.M. n representa o número de experimentos. *, primeiro efeito
significante (P < 0.001, one-way ANOVA seguido de Dunn).
58
▲ ▲
K60 FE Timol (µM)
1 3 10 30
100
200
300
400 600 1000 2000
▲ ▲
K60 FE
Carvacrol (µM)
1 3 10 30
100
200
300
400 600
1000
2000
▲ ▲
K60 FE
b
120
% Contração de FE (0,1 µM)
100
80 *
60
40
20 E+ (n = 11)
E- (n = 10)
0 L-NAME (n = 12)
-20
c
120
%Contração de FE (0,1 µ M)
100
80 *
60
40
20 E+ (n = 9)
E- (n = 5)
0 L-NAME (n = 6)
-20
Figura 17. Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração mantida por
fenilefrina em aorta isolada de rato e a influência do endotélio. a) Traçados de
experimentos originais mostrando o efeito relaxante de concentrações crescentes
cumulativas de timol e carvacrol sobre contrações mantidas por FE (0,1 µM) em
preparações de aorta com endotélio. Os painéis superior, intermediário e inferior mostram os
efeitos do veículo (DMSO), timol e carvacrol, respectivamente, sobre a contração mantida
por FE (0,1 µM). TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito relaxante do timol
sobre a contração induzida por 0,1 µM de FE no músculo liso aórtico com endotélio intacto e
removido e em presença de L-NAME (100 µM). • E+ (com endotélio); E- (sem endotélio);
L-NAME. c) Gráfico representativo do efeito relaxante do carvacrol sobre a contração
mantida por 0,1 µM de FE no músculo liso aórtico com endotélio intacto e removido e em
presença de L-NAME (100 µM). E+ (com endotélio); E- (sem endotélio); L-NAME. As
linhas contínuas representam o ajuste da função logística sigmoidal para os valores do timol
e carvacrol. Os valores estão expressos como média ± E.P.M; n representa o número de
experimentos. *, primeiro efeito significante (P < 0.001, one-way ANOVA seguido de Dunn).
62
TM 0Ca2+ Recuperação
TM 0Ca2+ Recuperação
0.5 g 0.5 g
5 min
5 min
Controle
Controle
⁄⁄ ⁄⁄
FE FE FE FE FE FE
TM TM 0Ca2+ Recuperação
0Ca2+ Recuperação
Carvacrol 100 µM
Timol 100 µM
⁄⁄ ⁄⁄
FE FE FE FE FE FE
⁄⁄ ⁄⁄
FE FE FE FE FE FE
120 FE (Tyrode)
FE (0Ca2+)
FE + Timol
100
% Contração de FE (10 µM)
FE + Carvacrol
80
Ca2+-free
60
40
20
** **
0
100 µM 1000 µM
64
Figura 18. Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração induzida por
fenilefrina em meio isento de Ca2+. a) Traçados de experimentos originais mostrando o
efeito inibitório das concentrações 100 e 1000 µM de timol e carvacrol sobre contrações
induzidas por FE (10 µM) em preparações de aorta com endotélio em Tyrode modificado e
em meio isento de Ca2+ contendo EGTA (2 mM). TM (lavagem). b) Gráfico representativo
do efeito inibitório do timol e carvacrol (100 e 1000 µM) sobre a contração induzida por 10
µM de FE no músculo liso aórtico com endotélio exposto à Tyrode modificado e ao meio
isento de Ca2+ contendo EGTA (2 mM). As colunas mostram a magnitude das respostas
contráteis fásicas induzidas por FE em anéis de aorta mantidas tanto em presença de Ca2+
normal (2 mM, coluna hachurada) ou em meio isento de Ca2+ com EGTA (2 mM) (coluna
branca). Os valores estão expressos como média ± E.P.M; n representa o número de
experimentos. **, timol ou carvacrol vs. contração induzida por FE em meio isento de Ca2+ (P
< 0.001, teste t de Student não pareado).
65
a
K80/0Ca2+
0.5 g
Controle (TM + DMSO)
5 min
CaCl2
▲ ⁄⁄
K60
0.1 0.3 1 3 10 20
K80/0Ca2+
Timol 400 µM
CaCl2
▲
⁄⁄
K60 0.1 0.3 1 3 10 20
K80/0Ca2+
Carvacrol 400 µM
CaCl2
▲ ⁄⁄
K60
0.1 0.3 1 3 10 20
b
120 Controle
Timol 400 mM
%Contração máxima de CaCl2
80
§
60 *
**
40
20
0,1 1 10 100
CaCl2 (mM)
67
Figura 19. Efeito inibitório do timol e carvacrol sobre a contração induzida por Ca2+ em
aorta isolada de rato despolarizada por potássio. a) Traçados de experimentos originais
mostrando o efeito inibitório de timol e carvacrol (400 µM) sobre a curva concentração
resposta de CaCl2 (0,1 - 20 mM) em preparações de aorta com endotélio expostas a solução
isotônica de KCl (80 mM) isenta de Ca2+. Os painéis superior, intermediário e inferior
mostram o efeito do veículo (DMSO), do timol e carvacrol, respectivamente, sobre a curva
concentração resposta de CaCl2. TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito
inibitório do timol e carvacrol (400 µM) sobre a curva concentração resposta de CaCl2 (0,1 -
20 mM) no músculo liso aórtico com endotélio. • Timol (400 µM); Carvacrol (400 µM). Os
valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa o número de experimentos. *e
**, primeiro efeito significante respectivamente para a curva controle e para as curvas
obtidas em presença de timol ou carvacrol (P < 0,05, one way ANOVA seguido de Holm
Sidak); §, timol ou carvacrol vs. controle (P < 0,001, two way ANOVA seguido de Holm-
Sidak).
68
a 0.5 g
5 min
0.5 g 0Ca2+ + EGTA
5 min
0Ca2+ + EGTA Tapsigargina (1 µM)
TM + DMSO TM + DMSO
K60 DBF
K60 DBF
0Ca2+ + EGTA
Tapsigargina (1 µM)
0Ca2+ + EGTA
Timol (1000 µM)
Timol 1000 µM
K60 DBF
K60 DBF
0Ca2+ + EGTA
0Ca2+ + EGTA Tapsigargina (1 µM)
Carvacrol 1000 µM Carvacrol (1000 µM)
K60 DBF K60 DBF
100
* *
80
*
60
*
40
20 **
**
0
100 300 1000 1000 µM
[µM]
70
Figura 20. Efeito relaxante do timol e carvacrol sobre a contração induzida por ester
de forbol em aorta isolada mantida em meio isento de Ca2+ e em presença de
tapsigargina. a) Traçados de experimentos originais mostrando o efeito inibitório timol e
carvacrol (1000 µM) sobre contrações sustentada por DBF (1 µM) em preparações de aorta
sem endotélio mantidas em meio isento de Ca2+ contendo EGTA (2 mM) e em ausência
presença de tapsigargina (1 µM). TM (lavagem). b) Gráfico representativo do efeito
inibitório do timol e carvacrol (100, 300 e 1000 µM) sobre a contração induzida por 1 µM de
DBF no músculo liso aórtico sem endotélio exposto ao meio 0Ca2+ contendo EGTA (2 mM) e
em ausência e em presença de tapsigargina (1 µM). Os valores estão expressos como
média ± E.P.M. * P < 0,05; ** P < 0,001, timol ou carvacrol vs. DBF (teste t de Student não
pareado).
71
120
KCl 80 mM (n = 6)
Y27632 1 mM (n = 6)
% Contração de KCl (80 mM)
100
Timol 1000 mM (n = 10)
Carvacrol 1000 mM (n = 11)
80
60
40
20
* *
*
0
Figura 21. Comparação dos os efeitos de timol e carvacrol com o efeito do inibidor de
Rho cinase sobre a contração sustentada de potássio. Gráfico representativo da
comparação entre do efeito relaxante do Y26632 (1 µM) e do efeito da concentração de
1000 µM de timol e carvacrol sobre o potencial de repouso da aorta isolada de rato sem
endotélio. Os valores estão expressos como média ± E.P.M. n representa o número de
experimentos. *, P < 0.001; Y27632, timol ou carvacrol vs. KCl 80 mM (teste t de Student
não pareado).
73
+ - - + - - Controle
- + - - - - Timol 1000 µM
- - - - + - Carvacrol 1000 µM
- - + - - + Recuperação
0
-20
-30
-40
-50
-60
DISCUSSÃO
por FE resulta unicamente do Ca2+ liberado após a ativação dos canais de Ca2+
sensíveis a IP3. Nossos resultados mostram que a concentração de 1000 µM de
timol e carvacrol inibiu totalmente a contração transiente induzida por FE em meio
0Ca2+. Entretanto, a concentração de 100 mM, que é capaz de inibir de forma
significante a contração induzida por FE em solução de Tyrode, não obteve efeito
significativo algum em meio 0Ca2+ (Fig. 18).
GPCR PIP2
PLC
G
RhoA-GDP
DAG IP3
I
RhoGEF
PKC
RhoA-GTP RS
RhoK III
II IV
CPI-17 CPI-17
P Ca2+
CaM
rMLC
VOCC
Ca2+
CONCLUSÃO
O efeito vasorrelaxante do timol e carvacrol pode ser mediado por vias que
envolvem o IP3, a PKC e a Rho cinase.
REFERÊNCIAS
AYDIN, Y.; KUTLAY, O.; ARI, S.; DUMAN, S.; UZUNER, K.; AYDIN, S. Hypotensive
effects of carvacrol on the blood pressure of normotensive rats. Planta Med. 73:
1365-71, 2007.
G.A.C. Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and
thymol against oral pathogens. Brazilian Journal of Medical and Biological Research
40: 349-356, 2007.
CARVALHO, A.F., MELO, V.M., CRAVEIRO, A.A., MACHADO, M.I., BANTIM, M.B.,
RABELO, E.F., Larvicidal activity of the essential oil from Lippia sidoides Cham.
against Aedes aegypti Linn. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 94, 569–571.
DUKE, J.A. Handbook of Medicinal Herbs. CRC Press Inc, Boca Raton, FL 512-513,
1985.
85
FENG, J.; ITO, M.; ICHIKAWA, K.; NISHIKAWA, M.; HARTSHORNE, D.J.; NAKANO,
T. Inhibitory phosphorilation site for Rho-associated kinase on smooth muscle
myosin phosphatase. J Biol Chem 274: 37385-37390, 1999.
FURCHGOTT, R.F; ZAWADZKI, J.V. The obligatory role of endothelial cells in the
relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 288: 373-6, 1980.
FREITAS, O.C.; CARVALHO, F.R.; NEVES, J.M.; VELUDO, P.K.; PARREIRA, R.S.;
GONÇALVES, R.M.; LIMA, S.A.; BESTETTI, R.B. Prevalence of hypertension in the
urban population of Catanduva, in the State of Sao Paulo, Brazil. Arq Bras Cardiol 77
(1): 9-21, 2001.
FUCHS F.D.; MOREIRA L.B.; MORAES R.S.; BREDEMEIER M.; CARDOZO, S.C.
Prevalence of systemic arterial hypertension and associated risk factors in the Porto
Alegre metropolitan area. Populational-based study. Arq Bras Cardiol 63 (6): 473–
479, 1994.
HAI, C.M.; MURPHY, R.A. Ca++ crossbridge phosphorilation and contraction. Ann
Rev Physiol 51: 285-298, 1989.
HARTSHORNE, D.J.; ITO, M.; ERDODI, F. Myosin light chain phosphatase: subunit
composition, interactions and regulation. J Muscle Resp Cell Motil 19: 325-341,
1998.
86
HE, L.; MO, H.; HADISUSILO, H.; QURESHI, A.A.; ELSON, C.E. Isoprenoids
suppress the growth of murine B16 melanomas in vitro and in vivo. J Nutr
127(5):668-74, 1997.
HILL, M.A.; ZOU, H.; POTOCNIK, S.J.; MEININGER, G.A.; DAVIS, M.J. Signal
transduction in smooth muscle: arteriolar smooth muscle mechano-transduction:
Ca++ signaling pathways underlying myogenic reactivity. J Appl Physiol 91: 973-983,
2001.
aortic rings from DOCA-salt hypertensive rats. Fundam Clin Pharmacol 21(5):497-
506, 2007.
JENNER, P.M.; HAGAN, E.C.; TAYLOR, J.M.; COOK, E.L.; FITZHUGH, O.G. Food
flavourings and compounds of related structure. I. Acute oral toxicity. Food and
Cosmetics Toxicology. 2: 327±343, 1964.
JNC VII. The Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention,
Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure. The JNC 7 Report.
JAMA 289(19):2560-72, 2003.
JUKIC, M.; POLITEO, O.; MAKSIMOVIC, M.; MILOS, M.; MILOS, M. In vitro
acetylcholinesterase inhibitory properties of thymol, carvacrol and their derivatives
thymoquinone and thymohydroquinone. Phytother Res 21(3):259-61, 2007.
KAMM, K.E.; STULL, J.T. Myosin phosphorilation, force and maximal shortening
velocity in neutrally stimulated tracheal smooth smooth muscle. Am J Physiol 249,
C238-C247, 1985a.
KAMM, K.E.; STULL, J.T. The function of myosin and myosin light chain kinase
phosphorilation in smooth muscle. Annu Rev Pharmacol Toxicol 25: 593-620,
1985b.
KIBERTIS, P. AND ROBERTS, L. It’s not just the genes. Science 296, 685, 2000.
KIM, S.H.; KANG, K.W.; KIM, K.W.; KIM, N.D. Procyanidins in crataegus extract
evoke endothelium-dependent vasorelaxation in rat aorta. Life Sci 67:121-131, 2000.
88
KIMURA, I. Medical benefits of using natural compounds and their derivatives having
multiple pharmacological actions. Yakugaku Zasshi 126(3):133-43, 2006.
KIMURA, K.; ITO, M.; AMANO, M.; CHIHARA, K.; FUKATA, Y.; NAKAFUKU, M.;
YAMAMORI, B.; FENG, J.; NAKANO, T.; OKAWA, K.; IWAMATSU, A.; KAIBUCHI,
K. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho
kinase) Science 273:245-248, 1996.
KITAZAWA, T.; ETO, M.; WOODSOME, T.P.; BRAUNTINGAM, D.L. Agonists trigger
G-protein mediated activation of the CPI-17 inhibitor phosphoprotein of myosin light
chain phosphatase to enhance vascular smooth muscle contractility. J Biol Chem
275: 9897-9900, 2000.
KOSTYUK, P.G.; BELAN, P.V.; TEPIKIN, A.V. Free calcium transients and
oscillations in nerve cells. Exp Brain Res 83: 459-464, 1991.
LEE SP, BUBER MT, YANG Q, CERNE R, CORTÉS RY, SPROUS DG, BRYANT
RW. Thymol and related alkyl phenols activate the hTRPA1 channel. Br J Pharmacol
153(8):1739-49, 2008.
LEE, S.; UMANO, K.; SHIBAMOTO, T.; LEE, K. Identification of volatile components
in basil (Ocimum basilicum L.) and thyme leaves (Thymus vulgaris L.) and their
antioxidant properties. Food Chem 91: 131–137, 2005.
LEWINGTON, S.; CLARKE, R.; QIZILBASH, N.; PETO, R.; COLLINS, R.; Age-
specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of
individual data for one million adults in 61 prospective studies. Lancet 360:1903–13,
2002.
MAGYAR, J.; SZENTANDRÁSSY, N.; BÁNYÁSZ, T.; FÜLÖP, L.; VARRÓ, A.;
NÁNÁSI, P.P. Effects of thymol on calcium and potassium currents in canine and
human ventricular cardiomyocytes. Br J Pharmacol 136(2):330-8, 2002.
MAGYAR, J.; SZENTANDRÁSSY, N.; BÁNYÁSZ, T.; FÜLÖP, L.; VARRÓ, A.;
NÁNÁSI, P.P. Effects of terpenoid phenol derivatives on calcium current in canine
and human ventricular cardiomyocytes. Eur J Pharmacol. 487(1-3):29-36, 2004.
MANOHAR, V.; INGRAM, C.; GRAY, J.; TALPUR, N.A.; ECHARD, B.W.; BAGCHI,
D.; PREUSS, G. Antifungal activities of origanum oil against Candida albicans. Mol
Cell Biochem 228, 111–117, 2001.
MASUO, M.; REARDON, S.; IKEBE, M.; KITAZAWA, T. A novel mechanism for the
Ca(2+)-sensitizing effect of protein kinase C on vascular smooth muscle: inhibition of
myosin light chain phosphatase. J Gen Physiol. 104(2):265-86, 1994.
MITA, M.; YANAGIHARA, H.; HISHINUMA, S.; SAITO, M.; WALSH, M.P. Membrane
depolarization-induced contraction of rat caudal arterial smooth muscle involves Rho-
associated kinase. Biochem J 364: 431–440, 2002.
MOLINA, C.B.; CUNHA, R.S; HERKENHOFF, F.L.; MILL, J.G. Hypertension and salt
intake in an urban population. Rev. Saúde Pública 37 (6): 743–750, 2003.
NOSTRO, A.; ROCCARO, A.S.; BISIGNANO, G.; MARINO, A.; CANNATELLI, A.;
PIZZIMENTI, F.C.; CIONI, P.L.; PROCOPIO, F.; BLANCO, A.R. Effects of oregano,
carvacrol and thymol on Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis
biofilms. Journal of Medical Microbiology 56, 519–523, 2007.
OGUT, O.; BROZOVICH, F.V.; Regulation of force in vascular smooth muscle. J Mol
Cell Cardiol 35: 347-355, 2003.
SAKAI, T.; FUJII, K.; TAKEMOTO, N. Thymol contracture and rapid cooling
contraction of thymol-treated muscle fibres. Nippon Seirigaku Zasshi 29(10):600-1,
1967.
SAKURADA, S.; TAKUWA, N.; SGIMOTO. N.; WANG, Y.; SETO, M.; SASAKI, Y.;
TAKUWA, Y. Ca2+-dependent ctivation of Rho and Rho kinase in membrane
depolarizationinduced and receptor stimulation-induced vascular smooth muscle
contraction. Circ. Res. 93: 548–556, 2003.
SÁRKÖZI, S.; ALMÁSSY, J.; LUKÁCS, B.; DOBROSI, N.; NAGY, G.; JÓNA I. Effect
of natural phenol derivatives on skeletal type sarcoplasmic reticulum Ca2+ -ATPase
and ryanodine receptor. J Muscle Res Cell Motil 28:167-74, 2007.
SCHIMIDT, A.; HALL, A. Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases:
turning on the switch. Genes Dev 16: 1587-1609, 2002.
SIEGEL, G.; WALTER, A.; ENGEL, S.; WALPER, A.; MICHEL, F. Pleiotropic effects
of garlic. Wien Med Wochenschr 1999;149:217-224.
SOLARO, R.J. Myosin light chain phosphatase: a Cinderella of cellular signaling. Circ
Res 87: 173-175, 2000.
SOMLYO, A.P.; SOMLYO, A.V. Signal transduction and regulation in smooth muscle.
Nature 372:231-6, 1994.
SOMLYO, A.P.; SOMLYO, A.V. Signal transduction by G-proteins, Rho kinase and
protein phosphatase to smooth muscle and non smooth muscle myosin II. J Physiol
522: 177-185, 2000.
SOMLYO, A.P.; SOMLYO, A.V. Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle
myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase. Physiological
reviews 83(4): 1325-58, 2003.
SZENTANDRÁSSY, N.; SZIGETI, G.; SZEGEDI, C.; SÁRKÖZI, S.; MAGYAR, J.;
BÁNYÁSZ, T.; CSERNOCH, L.; KOVÁCS, L.; NÁNÁSI, P.P.; JÓNA, I. Effect of
thymol on calcium handling in mammalian ventricular myocardium. Life Sci
74(7):909-21, 2004.
93
TASDEMIR, D.; KAISER, M.; DEMIRCI, F.; BASER, K.H.C. Essential oil of Turkish
Origanum onites L. and its main components, carvacrol and thymol show potent
antiprotozoal activity without cytotoxicity. Planta Med. 72: 1006, 2006.
TIAN, H.; LAI, D.M. Analysis on the volatile oil in Origanum vulgare. Zhongyaocai. 29
(9): 920–921, 2006.
URBAN, N.H.; BERG, K.M.; RATZ, P.H. K+ depolarization induces RhoA kinase
translocation to caveolae and Ca2+ sensitization of arterial muscle. Am J Physiol Cell
Physiol 285: C1377–C1385, 2003.
VALVERDE, J.M., GUILLÉN, F., BAILÉN, G., ZAPATA P., CASTILLO, S.,
SERRANO M., MARTÍNEZ-ROMERO D., VALERO D. Diseño de un envase activo
para mantener la calidad y seguridad de uva de mesa. In: VIII Simposio Nacional y V
Ibérico de Maduración y Post-recolección, Orihuela (Alicante) Espanha, 2006.
VOKOU, D.; KOKKIMI, S.; BESSIERE, J.M. Origanum onites (Lamiaceae) in Greece:
distribution, volatile oil yield and composition. Econ Bot 42: 402-412, 1988.
WANG, Y.; YOSHIOKA, K.; AZAM, M.A.; TAKUWA, N.; SAKURADA, S.; KAYABA,
Y.; SUGIMOTO, N.; INOKI, I.; KIMURA, T.; KUWAKI, T.; TAKUWA, Y. Class II
94
WU, X.; HAYSTEAD, T.A.J.; NAKAMOTO, R.K.; SOMLYO, A.V.; SOMLYO, A.P.
Acceleration of myosin light chain dephosphorylation and relaxation of smooth
muscle by telokin: synergism with cyclic nucleotide-activated kinase. J Biol Chem
273:11362–11369, 1998.
YANAGITA, T.; KOBAYASHI, H.; YAMAMOTO, R.; TAKAMI, Y.; YOKOO, H.; YUHI,
T.; NAKAYAMA, T.; WADA, A. Protein kinase C and the opposite regulation of
sodium channel alpha- and beta1-subunit mRNA levels in adrenal chromaffin cells. J
Neurochem. 73(4):1749-57, 1999.
ZARZUELO, A.; DUARTE, J.; JIMENEZ, J.; GONZÁLEZ, M.; UTRILLA, M.P.
Vasodilator effect of olive leaf. Planta Med 57:417-419, 1991.