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DEPARTAMENTO DE QUIMICA
ACADEMIA DE BIOQUIMICA
1er. SEMESTRE
• Antes de asistir a la práctica deberás leer el texto completo y traer por escrito o en un
diagrama el planteamiento del experimento a realizar.
• Usar guantes de látex desechables y cubre boca cuando se trabaje con muestras
biológicas y/o material patológico.
• La mayoría de los disolventes orgánicos son volátiles e inflamables, al trabajar con ellos
deberá hacerse en lugares ventilados y nunca cerca de la flama. Los recipientes que los
contienen deben mantenerse cerrados, en lugares frescos y secos.
• Si es necesario inhalar algún gas se provocará una corriente de aire con la mano entre la
boca del recipiente y la nariz.
• No deberá verterse nunca agua a los ácidos, sino al contrario, teniendo precaución,
asimismo deberá tenerse mucho cuidado cuando se vierta amoniaco a un líquido caliente,
ó a un ácido concentrado a una base fuerte y viceversa.
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OBJETIVO GENERAL
METODOLOGIA
• Una semana después de concluida la práctica, el alumno entregará un reporte que deberá
contener:
Presentación 5%
Objetivos 5%
Introducción 5%
Planteamiento 10%
Resultados 10%
Discusión de Resultados 25%
Cuestionario 10%
Conclusiones 25%
Bibliografía 5%
• Para la elaboración del reporte, el alumno deberá consultar al menos dos fuentes de
información bibliográfica, y cuando menos una de ellas deberá ser un libro.
CRITERIOS DE EVALUACION
Los requisitos que debe reunir el alumno para poder aprobar el laboratorio son los
siguientes:
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INDICE
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PRACTICA No. 1
OBJETIVO:
INTRODUCCION:
Entre las sustancias delicadas se encuentran los ácidos y las bases, que deben de ser
manipulados con mucho cuidado, el alumno debe de seguir las indicaciones que el maestro señale,
así como tener un comportamiento cuidadoso y de disciplina mientras permanezca en el
laboratorio. Si no se tienen los suficientes cuidados se pueden tener accidentes en el laboratorio
que pueden manifestarse como lesiones el alumno o daño al material. Para evitar peligros en el
laboratorio es necesario evitar:
Es importante que cada estudiante ejecute todos los experimentos por si mismo, es decir que
tenga una participación en la practica.
La limpieza es esencial en todo trabajo bioquímico, por lo tanto todas las precauciones que se
tomen en un análisis cualitativo y cuantitativo deberá ser tomado en este curso. Frecuentemente,
restos de algún compuesto químico en el material de laboratorio dan resultados erróneos en el
experimento que se esta realizando, por lo tanto, todo el material de vidrio deberá lavarse después
de ser utilizado. Todo material biológico deberá ser desechado de acuerdo a las especificaciones
especiales que les sean dadas por el maestro o instructor de laboratorio tan pronto se haya
terminado de usar. Además las mesas deberán limpiarse antes y después de llevar a cavo la
practica.
En las tarjas no deberán ser arrojados papel filtro, vidrio o material parcialmente insoluble. Cuando
se tenga duda de cómo desechar un material, se debe de preguntar al maestro de laboratorio o al
instructor. Los mecheros deben de apagarse si no se están utilizando.
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MATERIAL: REACTIVOS:
Balanza Agua
Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml Sacarosa
Bureta cloruro de sodio
Soporte
Pinzas para bureta
Vasos de precipitado
Espátula
Matraz Erlenmeyer
METODO:
CUESTIONARIO:
Material de vidrio.
• Varilla.
• Agitador.
• Pipetas.
• Tubos de ensaye.
• Vasos de precipitado.
• Matraces.
• Probetas.
• Refrigerantes.
• Vidrio de reloj.
• Otros.
Material de porcelana.
• Cápsula.
• Crisol
• Mortero.
• Embudo Bucher.
• Otros.
Otros materiales.
• Conexiones.
• Mangueras de hule.
• Tubos de vidrio.
• Soporte
Aparatos:
• Balanza.
• Centrífuga.
• Estufa.
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PRACTICA No. 2
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
OBJETIVO:
Al finalizar la práctica el alumno sera capaz de:
1.- Definira: molaridad, molalidad, normalidad y porcentualidad.
2.- Preparar los tipos de soluciones más frecuentemente empleadas en el laboratorio de
bioquímica.
INTRODUCCIÓN:
Las mezclas son de dos tipos: heterogéneas y homogéneas. Una mezcla heterogénea no
es completamente uniforme y sus componentes son distinguibles, en ocasiones a simple vista
(ejemplo: una mezcla de azúcar y arena). Una mezcla homogénea tiene apariencia uniforme; las
llamadas soluciones son ejemplos de mezclas homogéneas.
A. El mol.
Nos ocuparemos en primer lugar del mol. La razón de su existencia es que los átomos de
los diferentes elementos no tienen la misma masa.
Para expresar la masa de los átomos se recurre a una unidad que no es el gramo ni el
miligramo, sino que es la masa de uno de ellos: el átomo de hidrógeno por ser el más sencillo. A su
masa se le da el valor convencional de 1 (uno). Las masas relativas de los demás elementos son
múltiples de este número; así, la masa del átomo de sodio es 23 veces la del átomo de hidrógeno;
la del cloro, 35.5 veces la del hidrógeno, etc. A estas cifras, por referirse a relaciones de masa
entre los átomos, se les denomina masas atómicas.
Teniendo presente esta relación constante entre las masas de los diferentes átomos, se
pueden utilizar cualquiera de las habituales unidades de masa ya que siempre que mantengamos
dicha proporción de 1 para el hidrógeno por 39 para el potasio estaremos poniendo en contacto el
mismo número de átomos. Así, 1 kilogramo de hidrógeno tendrá el mismo número de átomos que
23 kilogramos de sodio o que 39 kilogramos de potasio o que 35.5 kilogramos de cloro. Lo mismo
se puede afirmar de 1 gramo de hidrógeno con respecto a 23 gramos de sodio, o de 39 miligramos
de potasio con respecto a 35.5 miligramos de cloro. De todas estas unidades, la perteneciente al
Sistema Internacional de unidades es el gramo y por ello es la que debe utilizarse.
Así pues, un átomo-gramo es la masa atómica expresada en gramos. Por ello se tiene que
un átomo-gramo de hidrógeno es 1 gramo de hidrógeno; un átomo-gramo de sodio son 23 gramos
de sodio; un átomo-gramo de potasio son 39 gramos de potasio; y, un átomo-gramo de cloro son
35.5 gramos de cloro.
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Ahora bien, los átomos se unen para formar moléculas. Por ejemplo, el carbono, el oxígeno
y el hidrógeno se unen para formar, entre otras sustancias, glucosa (fórmula: C6H12O6). La masa
molecular de la glucosa es la suma de las masas de los átomos constituyentes, a
saber:(12x6)+(1x12)+(16x6) = 72+12+96 = 180. Esta masa puede ser expresada en gramos y, si
cuando se habla de átomos se le llamaba átomo-gramo, cuando se refiere a moléculas, se le
denomina molécula-gramo o mol. Por el mismo razonamiento se podría hablar de ión-gramo.
Todas las moléculas-gramo tendrán el mismo número de moléculas y así se cuenta con
una unidad que expresa la proporción de moléculas en una sustancia. En consecuencia, como la
masa molecular de la glucosa es 180, un mol de glucosa pesa 180 gramos, 2 moles de glucosa
pesan 360 gramos, etc.
y, despejando:
Para usos biológicos la unidad mol es muy grande y entonces se utiliza el milimol (mmol),
unidad mil veces menor. Por lo tanto, un milimol es igual a la masa molecular expresado en
miligramos. Así,
Comprendidos los conceptos anteriores, se puede pasar a definir qué es una solución
molar.
Para ilustrar más este punto, supongamos que se quieren preparar 500 mililitros de una
solución 0.4 M de cloruro de sodio (NaCl). ¿Cuantos gramos de NaCl deben prepararse, sabiendo
que la masa "molecular" de la sal es de 58.5? El problema puede abordarse siguiendo este
razonamiento: si 1 litro de solución 1.0 M contiene 58.5 gramos de NaCl y 1 litro de solución 0.4 M
contiene “x” gramos de NaCl, entonces x = (0.4)(58.5)/1 = 23.4g de NaCl.
Estos 23.4 gramos de NaCl sirven para preparar 1 litro (1000 ml) de solución; pero
solamente se requiere 0.5 litro (500 ml). Entonces, como 1 litro de solución 0.4M contiene 23.4
gramos de NaCl , 0.5 litro de solución 0.4 M contiene “x” gramos de NaCl, esto es, x =
(0.5)(23.4)/1 = 11.7 gramos de NaCl. Por lo tanto, se requieren 11.7 gramos de NaCl y disolverlos
en agua hasta completar un volumen de 0.5 litro (500 ml).
En el ejemplo anterior, como se pudo ver, se multiplicó la molaridad del problema (0.4) por
la masa "molecular" (peso fórmula) del NaCl (58.5) y por el volumen del problema (0.5 litro).
Posteriormente se dividió entre 1 litro.
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C. El equivalente (Eq).
Desde el punto de vista electroquímico existen dos clases de substancias: unas, que al
estar en solución permiten el paso de la corriente eléctrica, reciben el nombre de electrolitos; las
otras, que no lo permiten, son llamadas no electrolitos. Ejemplos de electrolitos son el cloruro de
sodio, el fosfato de potasio, etc. La glucosa y la urea son ejemplos de no electrolitos.
Se sabe que una propiedad de los átomos es la de poderse combinar. En términos
químicos esta capacidad de combinación se denomina valencia.
La valencia no guarda relación con la masa atómica, sino con el número de electrones
combinables; en otras palabras, existen átomos con gran poder combinatorio cuya masa ("peso
atómico") es menor que la de otros átomos con valencia menor. Por ejemplo, el sodio tiene un
peso atómico de 23 y una valencia de 1; el oxigeno tiene un peso atómico de 16 y una valencia de
2; el carbono tiene un peso atómico de 12 y una valencia de 4, etc.
Se requiere, pues, contar con una unidad que evite la dificultad de que los átomos no
tengan la misma masa y que permita comparar "actividades" (cargas) por número y no por peso.
Por ejemplo, si se tratara de un regimiento de soldados, se hablaría del número de soldados y no
del peso corporal del pelotón. Pero esto no es todo: los soldados pueden estar armados de manera
diferente, valer cada uno por dos o tres, y es esta razón del valor diferente, de diferente valencia o
actividad química la que lleva a la introducción de una nueva unidad: el equivalente (Eq).
Por tratarse de una unidad demasiado grande para usos biológicos, se utiliza una unidad
1000 veces menor: el miliequivalente (mEq). Otra comparación que ayuda a ilustrar la importancia
de determinar equivalentes en lugar de gramos es la siguiente: si se invita a una fiesta 1000 Kg. de
niños y 1000 Kg. de niñas, no se puede estar seguro de que se invitó a cantidades equivalentes de
niños y niñas. Pero si se invita a 10 niños y a 10 niñas sin tener en cuenta su peso, se puede tener
la seguridad de que en la fiesta la cantidad de niños será equivalente a la de las niñas.
Para obtener la actividad química se divide la cantidad necesaria de sustancia (en gramos)
entre la valencia. Por lo tanto, teniendo en cuenta ambas características de peso y valencia, se
puede generalizar el concepto para todos los elementos, diciendo que las cantidades que
representan la masa atómica ("peso atómico") dividido por su valencia, son químicamente
equivalentes. Así, 1 gramo de H/1 = 1 g; 23 gramos de Na /1 = 23 g; 39 gramos de K/1 = 39 g; 40
gramos de Ca /2 = 20 g; 16 gramos de O/2 = 8 g; y, 12 gramos de C/4 = 3 g, son equivalentes; en
otras palabras, químicamente valen igual y son capaces de neutralizarse exactamente. De lo
expuesto se deduce que es fácil convertir gramos en equivalentes y viceversa.
Si se quiere saber cuántos equivalentes son 69 gramos de Na, como el peso atómico de
Na = 23 y un equivalente de Na = peso atómico en gramos/ valencia = 23 g/1 = 23 gramos de Na,
entonces, 3 equivalentes tienen (3)(23) = 69 gramos de Na.
Si se quiere saber cuántos mEq son 69 gramos de Ca, dado que el peso atómico de Ca =
40 y un equivalente de Ca = (peso atómico en gramos)/valencia = 40 g/2 = 20 gramos de Ca,
entonces 69 gramos de Ca son
x = 69 x 1/20 = 3.45 Eq = 3450 mEq.
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Soluciones normales (N).
Para calcular la cantidad en gramos de una sustancia, necesaria para preparar un volumen
determinado de una solución de cierta normalidad, se pueden usar las fórmulas siguientes:
1. De volumen en volumen.
Para preparar una solución porcentual se considera que las substancias "químicamente
puras" están formadas sólo por soluto; es decir, están al 100%. Para fines prácticos se usan 100 ml
como volumen total de solución; la cantidad de mililitros de soluto empleados en dicha dilución
(v/v), es expresa en forma porcentual. Así, si se tiene una solución de etanol al 96% (v /v), quiere
decir que por cada 100 ml de solución total, 96 ml corresponden al soluto (alcohol químicamente
puro) y el resto, al agua u otro solvente empleado.
Ejemplo: se desea preparar una solución de fenolftaleina al 0.5% (v/ v) en alcohol al 96%.
En este caso el soluto es la fenolftaleina, y el solvente el alcohol (etanol) al 96%.
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Si sólo se cuenta con alcohol químicamente puro (al 100%), se debe preparar primero una
solución de alcohol al 96% (v/v). El método a seguir es el siguiente: en una probeta de 100 ml se
vierten 96 ml de alcohol absoluto (100%); posteriormente se añade agua destilada suficiente para
completar los 100 ml. Es necesario que el procedimiento se haga en el orden mencionado para que
sea exacto: primero el alcohol y luego el agua. A primera vista, parecería lo mismo añadir primero 4
ml de agua y a continuación 96 ml de alcohol absoluto, obteniendo de este modo 4 + 96 = 100 ml
de solución. Sin embargo, hay que considerar que puede haber un margen de error, ya que se trata
de dos líquidos cuya densidad es diferente: las moléculas de alcohol no mantienen la misma
"distancia" entre ellas cuando el alcohol es químicamente puro que cuando se encuentra mezclado
con agua. Esta pequeña diferencia puede alterar el volumen final de solución (100 ml).
Es importante insistir que los términos porcentuales expresan siempre una relación; es
decir, se pueden variar los volúmenes siempre y cuando no se pierda dicha relación.
El alcohol etílico común tiene 96% de pureza (v /v ). Por lo tanto, si no se cuenta con
alcohol puro y se quiere preparar una solución de alcohol al 24%, el planteamiento es como sigue:
como 100 ml de solución contienen 96 ml de alcohol puro y “x” ml de solución contienen 24 ml de
alcohol puro, entonces:
x = 24 x 100/96 = 25 ml de alcohol al 96% (v/ v)
Resultado: Se necesitan 25 ml de solución de alcohol al 96% y completar con agua un volumen de
100 ml.
Si tan solo se desean 50 ml de esta nueva solución: como 100 ml de alcohol al 24% tienen
25 ml de alcohol al 96%, entonces 50 ml de alcohol al 24% tienen “x” ml de alcohol al 96%,
Resultado: Se requieren 12.5 ml de alcohol al 96% y completar con agua destilada un volumen final
de 50 ml.
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E. Soluciones molales (m).
Una solución molal es la que contiene el peso molecular de una sustancia en 1000 gramos
de solvente; es decir, la cantidad de solvente es fija y a ella se agrega la sustancia por disolver. Por
ejemplo, una solución 1 molal (1 m) de glucosa, cuyo peso molecular es de 180, se prepara
agregando a 1000 g de agua, 180 g de glucosa.
MATERIAL: REACTIVOS:
Balanza Agua
Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml Sacarosa
Vasos de precipitado 50 y 100 ml Cloruro de sodio
Espátula Etanol
Matraces aforados 50 y 100 ml Ácido clorhídrico
Ácido sulfúrico
METODO:
Preparación de soluciones
Procedimientos:
a. Preparar 50 ml de solución de cloruro de sodio al 10% (p /v).
b. A partir de la solución de cloruro de sodio al 10%, preparar 100 ml de una solución
salina al 1%.
c. A partir de una solución de etanol al 96% (v /v), preparar 50 mililitros de una solución
de etanol al 18 % (v/ v) en agua.
B. Soluciones molares.
Material: cloruro de sodio; agua destilada, ácido sulfúrico (H2SO4), ácido clorhídrico (HCl).
Procedimientos:
Preparar 100 ml de una solución de cloruro de sodio 0.5M.
a. A partir de la solución anterior, preparar 100 ml de una solución 0.1 M de cloruro de
sodio.
b. Preparar 100 ml de una solución 0.1 M de ácido clorhídrico.
c. Preparar 100 ml de una solución 0.1 M de ácido sulfúrico.
C. Soluciones normales
Material: cloruro de sodio; agua destilada, ácido sulfúrico (H2SO4), ácido clorhídrico (HCl).
Procedimiento:
a. Preparar 50 ml de una solución de NaCl 0.4 N
b. Prepare 50 ml de los reactivos restantes a una concentración 0.4 N.
D. Soluciones molales.
CUESTIONARIO:
Defina los siguientes términos: mol, equivalente químico, normalidad, molaridad, molalidad,
solución porcentual p/ p, solución porcentual p/ v, solución porcentual v/ v.
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PRACTICA NO. 3
FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS
OBJETIVO:
INTRODUCCIÓN:
La osmolaridad del plasma sanguíneo oscila normalmente entre 290 a 310 miliosmolas por
litro. Una solución con esta osmolaridad es isotónica con respecto al plasma y recibe el nombre de
solución fisiológica.
Ejemplo: Una solución de cloruro de sodio al 0.8 por ciento (p/v) y una solución de glucosa
al 5 por ciento (p/v) son isotónicas con respecto al plasma y, por lo tanto, son soluciones
fisiológicas.
Las soluciones que contienen mayor número de osmolas por litro que el plasma son
hipertónicas, en tanto que las que tienen menor número de osmolas son hipotónicas.
MATERIAL: REACTIVOS:
Tubos de ensayo de 5 ml Tubo con Hepárina sódica
Gradilla NaCl 0.5% (p/v)
Pipetas de 1 y 5 ml Agua destilada
Jeringa
Torunda
Torniquete
Guantes desechables
Parafilm
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METODO:
INTERPRETACIÓN
CUESTIONARIO:
Defina los términos siguientes:
a) osmolaridad
b) ósmosis
c) solución isotónica
d) solución hipertónica
e) solución hipotónica
f) fragilidad osmótica, anemia
g) anemia hemolítica,
h) anemia auto inmune,
i) talasemia,
j) drepanocitosis,
k) dianocito.
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PRACTICA NO. 4
OBJETIVO:
1.-Conocer y aplicar algunos métodos para la determinación de pH.
2.- Determinar el pH de varias sustancias problemas.
INTRODUCCIÓN:
C O N C E P T O D E pH
Para poder comprender qué es pH, es necesario revisar antes algunos conceptos, tales
como: ácido, base, disociación, ionización y concentración. Por otra parte, resulta indispensable
tener una idea precisa acerca de los logaritmos.
En general, se consideran dos tipos de ácidos: fuertes y débiles. Un ácido fuerte es el que
se disocia casi por completo y, por tanto, deja libres a prácticamente todos los hidrogeniones que
posee. Un ácido débil es aquél que se disocia parcialmente, de tal manera que la mayoría de los
protones se encuentran unidos al anión (base conjugada) y sólo una pequeña proporción de ellos
están libres.
Una base o álcali es una sustancia capaz de aceptar o combinarse con protones y/o capaz
-
de incrementar la concentración de iones oxhidrilo (OH ) en solución.
Los ácidos y las bases se neutralizan mutuamente, molécula a molécula, ya que las bases
aceptan los protones de los ácidos cuando ambos son mezclados. Como resultado, se establece
un equilibrio entre las cargas del ácido y las de la base y, por consiguiente, la ausencia de protones
libres.
Las substancias que pueden actuar indistintamente como ácidos o como bases son
conocidas como anfotéricas.
Grado de acidez o alcalinidad. Para poder valorar el grado de acidez o alcalinidad de una
sustancia, se ideó una escala basada en la concentración de hidrogeniones libres obtenidos por la
disociación del agua. La cantidad de moléculas de agua disociadas puede variar conforme a su pu-
reza y a la temperatura, pero la relación entre la concentración de moléculas de agua disociadas y
la concentración de moléculas de agua no disociadas permanece constante. A esta constante se le
denomina constante de disociación del agua (KD).
+ -
KD = [H ][ OH ]/[H2O] (1)
15
El agua pura, a 25 °C, tiene una [H ] = [OH ] = 1.0 x 10 M. La [H2O] = 55.555 M. y, para
+ - -7
fines prácticos, se puede considerar que permanece constante ante el evento de disociación. Por lo
tanto, la ecuación (1) puede rearreglarse definiendo una nueva constante, la KW o constante del
producto iónico del agua, la cual tiene un valor numérico, a 25 °C, de 1.0 x 10-14 (¿por qué?).
+ - -14
[H2O] KD = KW = [H ][ OH ] = 1.0 x 10 (2)
El danés Sörensen inventó una manera abreviada para referirse a la concentración de protones
libres en solución, que denominó pH, el cual se define como:
Así pues, el pH del agua pura a 25 °C es igual a 7, y el pOH = 7.0 (¿por qué?).
Si se aplican logaritmos negativos a cada uno de los miembros de la ecuación (2), se obtiene la
relación siguiente:
pKw = pH + pOH = 14 (6)
En consecuencia, el valor mínimo de pH es 0 y su valor máximo es 14. Asimismo, pOH
puede tener un valor mínimo de 0 y un valor máximo de 14. De la ecuación (6) también se deduce
que al aumentar el valor de pH, disminuye el valor de pOH y viceversa.
Escala de pH.
[H ] [OH− ]
+
pH pOH
-14
1 0 14 1 x 10
-1 -13
1 x 10 1 13 1 x 10
-2 -12
1 x 10 2 12 1 x 10
-3 -11
1 x 10 3 11 1 x 10
-4 -10
1 x 10 4 10 1 x 10
-5 -9
1 x 10 5 9 1 x 10
-6 -8
1 x 10 6 8 1 x 10
-7 -7
1 x 10 7 Sol. NEUTRA 7 1 x 10
-8 -6
1 x 10 8 6 1 x 10
-9 -5
1 x 10 9 5 1 x 10
-10 -4
1 x 10 10 4 1 x 10
-11 -3
1 x 10 11 3 1 x 10
-12 -2
1 x 10 12 2 1 x 10
-13 -1
1 x 10 13 1 1 x 10
-14
1 x 10 14 0 1
*Concentraciones en molas/litro a 25 °C.
7 es ácido, pues predominan los protones sobre los oxhidrilos libres. Finalmente, un pH mayor que
7 es básico o alcalino, ya que predominan los oxhidrilos sobre los protones libres en solución.
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INDICADORES DE pH
Existen varios colorantes orgánicos, sintéticos o de origen natural, que cambian de color
cuando varía el pH de la solución en la que se encuentran disueltos. Ya que la mayoría de los
ácidos y las bases empleados en el laboratorio son incoloros, los indicadores son útiles al hacer
posible que los cambios de pH sean observables por las variaciones en la coloración de las
soluciones.
Los indicadores de pH son usualmente ácidos o bases débiles. En el caso de un ácido, su
disociación puede representarse como sigue:
+ -
HInd H + Ind
Cuando se agrega una base a la forma ácida del indicador (HInd), aquélla reacciona con él
para obtener la forma básica del indicador (Ind-). Se forma de este modo un sistema amortiguador
y, por lo tanto, su pH se puede calcular de la misma forma que en otras soluciones amortiguadoras.
A LG U N O S I ND I C AD O R E S D E p H D E U SO F RE CU E NT E
17
preparacion de una escala colorimÉtrica de pH mediante el uso de buffer estandar e indicadores
Los indicadores son ácidos débiles cuyas formas no disociadas (Hind) y disociada (Ind)
tienen color diferente. Por medio de la preparación de una serie de soluciones amortiguadoras
cuyos valores de pH son conocidos y se agrupan alrededor del pKa del ácido indicador, y que
contienen la misma concentración del mismo, se obtiene una escala colorida estándar en la que la
tonalidad de cada solución depende de su valor de pH particularmente añadiendo la misma
concentración de indicador que la presente en las soluciones estándar. El color de la solución
problema es entonces comparado visualmente o colorimétricamente con los colores de la serie de
los buffers estándar. De esta manera es posible conocer el pH de una solución con una
aproximación de 0.2 unidades de pH.
Este procedimiento esta sujeto a errores. A menudo las soluciones que contienen proteínas
muestran grandes variaciones de pH debido a que las proteínas pueden unirse a una u otra forma
del indicador, por lo que ocurre un desplazamiento en el equilibrio de su disociación. Un segundo
error es causado por la presencia de otras sustancias coloridas en la solución. Este puede
cancelarse, si la interferencia no es muy grande, mediante el empleo de un tubo “blanco” de la
sustancia colorida en el que el indicador esta ausente.
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MATERIAL: REACTIVOS:
15 Tubos de ensayo de CH3COOH 0.2 M.
Gradilla CH3COONa 0.2 M.
2 Pipetas de 10 ml KH3PO4 0.1 M
4 pipetas de 5 ml NaOH 0.1 M
Ácido bórico-KCl 0.1 M
Ácido bórico 0.1 N.
INDICADORES:
Anaranjado de metilo.
Rojo de metilo.
Azul de bromotimol .
Rojo de cresol.
Fenolftaleína.
Azul de timol.
3 soluciones problema de pH desconocido.
METODO:
1.- Para realizar la escala de pH en un rango de 3.6 - 10, se dividirá el grupo en 3 equipos cada
uno de los equipos preparará una serie de pH, en donde tendrán once valores de pH diferentes,
a cada equipo corresponde preparar lo siguiente:
EQUIPO No. 1
A la primera serie de 5 tubos (tubos del 1 al 5) adicionar 5 gotas del indicador anaranjado
de metilo y agitar cada tubo. A los tubos 6 al 11 adicionar 5 gotas del indicador rojo de metilo y
agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores
de pH obtenidos.
Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos
restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparación de sus problemas.
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EQUIPO No. 2
Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos
restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparación de sus problemas.
EQUIPO No. 3
Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos
restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparación de sus problemas.
2.- Reúnanse los 3 equipos con la serie de tubos que prepararon para llevar a cabo la
comparación visual de sus problemas.
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3.- Determinar el pH de las tres soluciones problema por medio de comparación visual.
Para determinar el pH tomar 10 ml de cada solución, colocarlas en su respectivo tubo de ensaye y
agregar 5 gotas del indicador que se le indique. Comparar la coloración de valor de pH medido con
el potenciómetro para realizar la comparación práctica.
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PRACTICA No 5
OBJETIVOS:
es conocida.
INTRODUCCIÓN.
Titulación ácido-básica: Una solución conocida de una base puede utilizarse para
determinar la concentración de un ácido y viceversa. Como es sabido, los ácidos y las bases se
neutralizan mutuamente: ácido + base = sal + agua. Ejemplo: HCl + NaOH = NaCl + H20.
Un mol de base neutraliza exactamente a un mol de ácido, de tal manera que, conociendo
la concentración y el volumen de base empleados para neutralizar un volumen conocido de un
ácido, se puede calcular la concentración del ácido problema. Como no sería posible darse cuenta
de cómo ocurre esta reacción y en cuál momento se ha neutralizado por completo la solución
problema (ésa cuya concentración se desconoce), se requiere el empleo de algo que posibilite su
observación; por ejemplo, una sustancia que cambie de color al variar el pH de la solución que la
contiene (indicador de pH).
La solución tipo debe dejarse caer gota a gota sobre la solución problema, al tiempo que se
agita el matraz. Es conveniente colocar debajo del matraz que contiene la solución problema una
hoja de papel blanco, para observar el cambio de coloración (punto de vire).
Acidez y pH. Existen dos maneras de expresar la acidez de una solución. La primera es la
+
acidez total o titulable. La segunda es la concentración de iones hidrógeno (H ) libres en solución.
Por ejemplo, una solución 1 N de ácido benzoico tiene la misma acidez total que una de ácido
clorhídrico 1 N, pero esta última tiene una concentración de iones hidrógeno libres que es cerca de
100 veces más grande que la primera (¿por qué?).
22
Sörensen (1909) adoptó el término pH como una medida de la concentración de iones
hidrógeno y lo definió como el logaritmo (base 10) negativo de la concentración de iones
hidrógeno, expresada en moles por litro: pH = log10 1/[H ] = - log10 [H ].
+ +
METODOLOGÍA.
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Experimento #2: Titulación de un ácido débil con una base fuerte.
MATERIALES.
PROCEDIMIENTO.
MATERIALES.
PROCEDIMIENTO
RESULTADOS
Calcular la acidez en ácido láctico (partes por 1,000 ml) de cada una de las muestras.
¿Cumple(n) la(s) leche(s) con el reglamento sanitario?
24
PRACTICA NO. 6
OBJETIVO.
INTRODUCCIÓN.
La definición más general de una solución amortiguadora o buffer es que son soluciones
que resisten mucho los cambios de pH cuando se les añaden ácidos o bases. Casi siempre están
formadas por ácidos débiles y sus sales.
Ejemplo:
Se tiene una solución amortiguadora formada por un ácido débil, ácido acético y su base
conjugada (acetato de sodio) en solución, el ácido acético esta débilmente ionizado y el acetato de
sodio esta fuertemente ionizado:
-
CH3COOH H + CH3COO
-
CH3COONa Na + CH3COO
-
La mayor parte de los iones CH3COO provienen del acetato de sodio si se le añade un
ácido fuerte por ejemplo HCl la reacción que ocurre es la siguiente:
+ - + - + -
Na + CH3COO + H + Cl Na + Cl + CH3COOH
Si a ese sistema se le añade una base fuerte por ejemplo NaOH se le da la siguiente
ecuación:
Las sustancias amortiguadoras o buffers tienen un papel importante para la regulación del
pH en los medios biológicos celulares y extracelulares. Su función es reducir al mínimo los cambios
en la concentración de iones hidrógeno y por lo tanto, también en la concentración de iones
hidroxilo, cuando se agregan pequeñas cantidades de ácidos o bases.
1.- El pH de la solución amortiguadora: El cual indica la región de concentración del ión hidrógeno
en el cual se realiza el efecto amortiguador (alrededor de +/- una unidad de pH amortiguador).
25
2.- La Capacidad Amortiguadora: Es decir, la capacidad de resistir la adición de ácido o base con
poco cambio de pH, lo que se relaciona de manera directa con la concentración de todos los
constituyentes del amortiguador.
Para que los procesos bioquímicos del cuerpo se produzcan en forma adecuada es
necesario que la concentración de iones hidrógeno se controle con extrema precisión. Por ejemplo,
el pH de la sangre se encuentra dentro de los limites de 7.3 - 7.5 siendo regulado por el sistema
amortiguador bicarbonato/ ácido carbónico. Otro sistema importante son los grupos laterales de la
histidina en la hemoglobina. En la saliva el sistema Ácido Carbónico /Bicarbonato y Fosfato.
Amortiguador. PH aproximado.
Fosfato ácido de potasio. Ácido clorhídrico. 1.8 – 3.8
Acetato de sodio. Ácido acético. 3.6 – 5.6
Ftalato ácido de potasio. Hidróxido de sodio. 4.0 – 6.0
Fosfato ácido de potasio. Hidróxido de sodio. 5.8 – 7.8
Ácido bórico. Borato de sodio. 7.5 – 9.5
Ácido bórico. Hidróxido de sodio. 8.2 – 10.2
Fosfato disódico. Hidróxido de sodio. 10.5 – 12.0
MATERIAL Y REACTIVOS.
PROCEDIMIENTO.
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II.- ACCIÓN AMORTIGUADORA DEL BUFFER PREPARADO Y UN BUFFER BIOLÓGICO.
Poner en una gradilla dos series de tubos numerados del 1 al 6, seguir con las indicaciones
dadas por la siguiente tabla:
1.- Realizar primero la medición del pH de las soluciones que se indican en el tubo 1 al 6 antes de
agregar el HCl y el NaOH.
2.- Después con el mismo potenciómetro determinar la capacidad amortiguadora de cada solución
midiendo el pH final después de la adición del ácido y la base fuerte.
PRESENTACION DE RESULTADOS.
CUESTIONARIO.
2.- ¿Por qué considera que la albúmina de huevo debe tener propiedades amortiguadoras?.
3.- ¿Que papel desempeñan las soluciones buffer dentro de la bioquímica? (En general.
4.- Qué sucede cuando en un sistema amortiguador la concentración molar de la sal y el ácido que
integran la solución son iguales?.
27
PRACTICA NO. 7
OBJETIVO
INTRODUCCIÓN.
Los azúcares se comportan como ácidos débiles y tienen las características químicas de
aldehídos o cetonas. Por ello, los álcalis aumentan la enolización de los azúcares.
Otra reacción importante es la que ocurre entre el grupo carbonilo y un alcohol, formando
hemiacetales y acetales.
PARTE EXPERIMENTAL
A. PRUEBA DE MOLISH.
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B. PRUEBA DE BENEDICT.
C. PRUEBA DE BARFOED.
D. PRUEBA DE SELIWANOFF.
RESULTADOS
Construya una tabla con los resultados obtenidos con las diferentes soluciones (incluyendo
la solución problema) en las diferentes pruebas.
DISCUSIÓN
Para cada una de las soluciones problema conteste las siguientes preguntas
1. ¿Contiene carbohidratos?
2. Si la respuesta anterior es afirmativa,
a. ¿Se trata de un carbohidrato reductor?
b. ¿Es un monosacárido?
c. ¿Es una cetosa?
29
PRACTICA NO. 8
OBJETIVOS
INTRODUCCIÓN
Bases químicas:
Al hacer reaccionar glucosa (agente reductor) con hidróxido cúprico en medio alcalino, se
forma oxido cuproso (color rojo). El óxido cuproso es insoluble y se precipita, por lo que no puede
valorarse colorimétricamente. Cuando se añade a esta solución fosfomolibdato, éste se reduce a
un ión de color azul cuya absorbencia puede medirse con un colorímetro.
Oxido cuproso
+
Fosfomolibdato
agua destilada
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MATERIAL Y REACTIVOS:
PROCEDIMIENTO
TUBO 1 2 3 4 5 6
blanco. problema.
Patrón de 0 0.25 0.50 0.75 1.0 0
glucosa (ml)
Agua 1.0 0.75 0.50 0.25 0 0
destilada
(ml)
Reactivo de 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
cobre (ml)
Sol. 0 0 0 0 0 1.0
problema
(ml)
Agitar e incubar durante 20 minutos a ebullición, permita que los tubos se enfríen.
RESULTADOS
CUESTIONARIO
31
PRACTICA NO.9
OBJETIVO:
INTRODUCCION:
En 1903 el botánico ruso M. T. Sweet elaboró la primera técnica para separar distintos
componentes coloreados de un extracto vegetal. A esta técnica se la ha dado el nombre de
cromatografía debido a que la separación de las sustancias dan diferentes colores.
MATERIAL Y REACTIVOS:
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PROCEDIMIENTO:
1.- En un extremo del papel filtro, hacer dos pequeñas marcas con lápiz a un extremo del borde y
separarlas entre sí una distancia de un centímetro.
2.- Poner una gota en una de las marcas señaladas del aminoácido No. 1.
4.- En otro papel colocar una gota de una mezcla de los aminoácidos.
5.- Introduzca las tiras de papel filtro en un frasco o vaso que contenga la mezcla del solvente
(utilice un frasco para cada tira).
6.- Deje avanzar el frente del solvente hasta aproximadamente 1 cm antes de que llegue al borde
superior.
7.- Una vez seco el papel, rociar con solución de ninhidrina (revelador específico) para aminoácido.
Dejar secar nuevamente.
8.- Calentar las hojas de papel filtro en una parrilla eléctrica (tener cuidado de no quemarlas) hasta
la aparición de manchas coloreadas. Ellas representan el sitio donde se encuentran los
aminoácidos que reaccionaron con la ninhidrina.
RESULTADOS:
1.- Medir la distancia desde el punto de colocación de la solución de los aminoácidos al centro de
las manchas (d).
2.- Medir la distancia del sitio de colocación de los aminoácidos al sitio donde llegó el solvente (D).
Rf = d/ D
4.- El Rf se calculará para cada uno de los aminoácidos individuales y para la mezcla.
33
PRACTICA NO.10
OBJETIVO:
FUNDAMENTO:
ESPECTROFOTOMETRÍA DE BIOMOLÉCULAS.
t
Tomado de: Boyer, R.F.: Modern Experimental Biochemistry, 1s ed., Benjamin/Cummings, Menlo
Park, CA, 1986, pp. 145-157.
Otra técnica que involucra las moléculas y la luz es la polarimetría. En este caso se estudia
la interacción de la luz polarizada en un plano con moléculas ópticamente activas.
λ = c/v (1)
E = hv (2)
Cuando un fotón de cierta energía interacciona con una molécula, puede ocurrir uno de dos
procesos. El fotón puede ser desviado (dispersado), o puede transferir su energía a la molécula,
produciendo un estado de excitación de la misma.
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de la luz eran utilizadas para determinar las masas moleculares ("pesos" moleculares) de
macromoléculas. Las técnicas de difracción de rayos X, microscopía electrónica, dispersión de luz
láser, y dispersión de neutrones dependen en alguna medida del proceso de dispersión de la luz.
E2 - E1 = hc/ λ (3)
Puede ocurrir una transición desde cualquier nivel vibracional en B a algún otro estado
vibracional en S1. Empero, no todas las transiciones tienen la misma probabilidad. La probabilidad
de absorción es descrita por la mecánica cuántica.
Un espectro UV-visible se obtiene midiendo la luz absorbida por una muestra como función
de la longitud de onda. Como las moléculas de la muestra sólo pueden absorber "paquetes"
discretos de energía (longitudes de onda específicas) teóricamente el espectro debe estar formado
por líneas discretas. Sin embargo, los numerosos niveles vibracionales de cada nivel energético
electrónico incrementa el número de transiciones posibles. Esto da como resultado un espectro de
picos amplios.
A = EBC (4)
Como la absorbencia, A, deriva de un cociente (-log I/I0), no tiene unidades; por lo tanto,
las unidades de E dependen de las unidades de b y c. E es más convenientemente utilizado en
forma de coeficiente de extinción molar, ε, definido como la absorbencia de una solución 1.0 M de
35
la sustancia absorbente pura en una celdilla de 1 cm bajo condiciones específicas de longitud de
onda y solvente.
Antes de que la luz monocromática incida sobre la muestra, pasa a través de una serie de
hendiduras, lentes, filtros y espejos. Este sistema óptico concentra la luz, aumenta la pureza
espectral y la enfoca hacia la muestra. El operador de un espectrofotómetro tiene poco control
sobre la manipulación óptica del haz luminoso, excepto en el ajuste de la anchura de la rejilla. La
luz que pasa del monocromador a la muestra encuentra una "ventana" o hendidura. En algunos
instrumentos ésta está ajustada para que pase un haz de luz de cierta anchura. Los instrumentos
más costosos tienen hendiduras variables, lo que permite al operador controlar su anchura. La
anchura de la rejilla determina la intensidad de la luz que incide sobre la muestra y su pureza
espectral. Al disminuir la anchura de la hendidura, aumenta la pureza espectral de la luz, pero
disminuye la cantidad de luz dirigida hacia la muestra. En este caso, el factor limitante es la
eficiencia o sensibilidad del detector. Establecer la anchura apropiada de la hendidura requiere un
equilibrio entre la pureza espectral y la sensibilidad del detector.
Los espectrofotómetros más baratos son instrumentos de "un solo haz" que permiten la
inserción de una sola cubeta a la vez en el porta cubetas. Este es el caso del Coleman Modelo
6/35, del Bausch & Lomb Modelo 20 o del Seqoia-Turner Modelo 340. Los instrumentos más
sofisticados son de "doble haz" y aceptan dos cubetas a la vez: una que contiene la muestra
disuelta en el solvente y otra que contiene solvente puro.
36
Con frecuencia los espectrofotómetros son usados para monitorear velocidades de
reacciones químicas. Cuando se efectúan estas mediciones la cubeta que contiene la muestra
debe tener una temperatura constante. Muchas cámaras de muestra permiten la circulación de un
líquido cuya temperatura es constante, alrededor del porta cubetas.
Registrador. Los instrumentos menos costosos dan una lectura directa de absorbencia y/o
transmitencia en forma análoga o digital. Estos instrumentos son apropiados para mediciones a
una sola longitud de onda; sin embargo, si se desea un "barrido" de absorbencia vs. longitud de
onda, entonces debe utilizarse un registrador. Algunos espectrofotómetros están equipados con un
registrador de pluma. El rango de absorbencia de la mayoría de los registradores es de 0 a 1, pero
los instrumentos más costosos pueden ser utilizados a niveles superiores de absorbencia (1-2) o
niveles inferiores, de mayor sensibilidad (0-0.1, 0-0.01, etc.).
Para las mediciones de absorbencia a una longitud de onda fija con un instrumento de "un
haz", se coloca una cubeta que contiene el solvente puro y se ajusta la absorbencia a "cero". Una
cubeta que contenga solvente más muestra se coloca entonces en la cámara, y su absorbencia es
leída directamente del registrador. El ajuste a cero con el solvente puro ("blanco") permite obtener
la lectura directa de la absorbencia de la muestra.
Ambos tipos de mediciones (longitud de onda fija y espectro de absorción) son comunes en
la bioquímica, y deberíamos ser capaces de interpretar los resultados de ambas.
37
concentraciones de la especie absorbente y midiendo la absorbencia correspondiente a cada
concentración. Si la ley de Beer-Lambert es válida, la gráfica de absorbencia vs. concentración
debe ser lineal.
Cuando un compuesto que contiene dos o más grupos carbamilo, unidos directamente o
separados por un solo átomo de C o N, es colocado en una solución alcalina con sales de cobre,
se forma un complejo de color violeta. Esta reacción constituye la base de un método cuantitativo
de determinación de proteína. esta determinación debe hacerse en ausencia del ión NH4, el cual
produce un color que causa interferencia.
REACTIVOS:
APARATOS:
METODO:
TUBO 1 2 3 4 5 6
blanco. problema.
Sol. 0 0 0 0 0 1.0
problema
(ml)
Patrón de 0 0.25 0.50 0.75 1.0 0
proteínas
(ml)
NaCl 0.9 % 3.0 2.75 2.50 2.25 2.0 2.0
(ml)
Reactivo de 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Biuret (ml)
38
2.- Caliente los tubos en el baño (50 ºC) durante 10 minutos.
3.- Enfríe los tubos en agua corriente.
4.- Determine en el espectrofotómetro la absorbancia a 540 nm; ajuste a cero con el “blanco” (tubo
# 1).
5.- Dibuje la curva patrón (absorbencia vs. concentración de proteína).
6.- Determine la concentración de proteína (mg/ml) de la solución problema interpolando la curva
patrón.
39
PRACTICA NO. 11
OBJETIVOS
FUNDAMENTO
MATERIAL
1. Reflectómetro.
2. Escala de colores y concentraciones.
3. Recipiente para colecta de orina.
4. Tubos para análisis de orina.
5. Tiras reactivas para orina.
6. Gradilla.
7. Papel sanitario.
8. Guantes.
MUESTRA
METODOLOGÍA
Fabricante:
Modelo del reflectómetro:
Carta de colores y concentraciones.
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RESULTADOS.
Valor de Densidad:
Valor de pH:
Valor de Leucocitos:
Valor de Nitritos:
Valor de Proteína:
Valor de Glucosa:
Valor de Cetonas:
Valor de Urobilonógeno:
Valor de Bilirrubina:
Valor de Sangre:
Valor de Hemoglobina:
Valores normales:
Densidad: 1.010 – 1.020
Leucocitos, nitritos, proteína, cetonas, bilirrubinas y sangre: Negativo.
pH: 5 – 6.5
Glucosa y urobilinógeno: Negativo
CUESTIONARIO.
1. ¿Cómo influye en el pH, el hecho de que las muestras de orina sean procesadas mucho
tiempo después (aprox. 4 horas) en el resultado?
2. ¿Por qué razón la tira reactiva debe de ser leída en un tiempo especifico?
3. ¿Cuál es el fundamento de la prueba para la determinación de Cetonas, Bilirrubina y
Urobilinógeno?
41
PRACTICA No. 12
OBJETIVO
INTRODUCCION
FUNDAMENTO
MATERIALES Y REACTIVOS
PROCEDIMIENTO
1. Marcar un tubo de ensaye como control (c) y otro como desconocido (d).
2. Agregar 1 ml de sustrato a cada tubo.
o
3. Dejar 5 min en baño de agua a 37 C
4. Agregar 0.02 ml de la muestra al tubo marcado como desconocido
o
5. Incubar a 37 C por 7 minutos y medio
6. Agregar 1 ml del reactivo de yodo a cada uno de los tubos
7. Mezclar y agregar 8 ml de agua destilada a ambos tubos
8. Mezclar por inmersión y leer la absorbancia en el espectrofotometro a 640 nm ajustando a cero
con agua destilada.
Nota: El color de la reacción es estable durante 1 hr.
o
Si la temperatura ambiente es superior a 25 C, la lectura deberá efectuarse dentro de los 20 min
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CALCULO DE LOS RESULTADOS
Unidades: Una unidas Amilolítica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra,
que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 min, en las condiciones de la reacción. En esta
técnica se incuban 0.02 ml de muestra con 0.5 mg de almidón contenidos en 1 ml de sustrato
durante 7 min y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de suero con 10.000 mg de almidón
durante 30 min. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la muestra sería de
1000 UA/ dl. Para las unidades de actividad amilásica, la fracción de almidón digerido se multiplica
por 1000.
VALORES DE REFERENCIA
CUESTIONARIO
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PRACTICA NO. 13
ANÁLISIS DE LÍPIDOS
OBJETIVO:
INTRODUCCIÓN.
Los lípidos son moléculas orgánicas que se caracterizan generalmente por ser insolubles en agua
y muy solubles en solventes orgánicos. Esta propiedad física refleja la naturaleza hidrofóbica de su
estructura hidrocarbonada. En esta práctica se van a realizar una serie de pruebas cualitativas para
poner de manifiesto algunas propiedades de los lípidos como son: solubilidad, detección de
peróxidos y saponificación.
MATERIALES Y REACTIVOS.
7 Tubos de ensayo Aceite vegetal.
2 Pipetas de 1 ml. Agua.
4 Pipetas de 2 ml. Etanol.
Baño María. Eter etílico.
Soporte completo Tetracloruro de carbono
Gradilla Mezcla de Acido acético y Cloroformo.
KI al 5 %.
NaOH 2 N o al 10 %.
PROCEDIMIENTO.
A) PRUEBA DE SOLUBILIDAD.
TUBO 1 2 3 4
Aceite Vegetal. 1 ml. 1 ml. 1 ml. 1 ml.
Agua 2 ml.
Etanol 2 ml.
Tetracloruro de 2 ml.
carbono.
Eter etílico. 2 ml.
B) DETECCIÓN DE PERÓXIDOS.
1.- Colocar en un tubo de ensayo 1 ml. de aceite vegetal y 2 ml. de mezcla de ac. Acético l
cloroformo.
44
C) SAPONIFICACIÓN.
CUESTIONARIO.
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