Universidad De Los Andes

Facultad De Ingeniería
Escuela De Ingeniería Química
Departamento De Química Industrial Y Aplicada
Laboratorio De Análisis Instrumental
Mérida Edo. Mérida

SEPARACION DE PIGMENTOS NATURALES POR

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Carrero Greyson; CI: 20.142.142

López Jesús; CI. 19.286.792

Enero de 2015.

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RESUMEN

Las técnicas cromatográficas son de mucha utilidad en la industria y es que a través

de ellas se puede separar e identificar una sustancia o compuesto químico. En la
cromatografía preparativa por columna en fase líquida se determinaron compuestos
carotenoides como β-caroteno y licopeno de los pigmentos orgánicos de un extracto de
zanahoria y tomate; la fase estacionaria (alúmina) se confinó en una columna de vidrio, y la
fase móvil se hizo fluir por gravedad a través de su seno, resultando en todos los casos
efectiva. En nuestro caso se usó como eluyente 1 una mezcla de éter de petróleo/hexano
70:30, con la cual se realizó la elución del β-caroteno, y luego se llevó a cabo la elución del
licopeno empleando como eluyente 2 éter de petróleo/hexano/diclorometano en
proporciones volumétricas 56:24:20 , obteniéndose los mayores tiempos de elución con
respecto a los demás grupos que realizaron el estudio, por lo que se determinó que los
mejores eluyentes fueron una mezcla éter de petróleo/hexano 30:70 seguido de la adición
de una mezcla éter de petróleo/hexano/diclorometano 15/35/50. Posteriormente se realizó la
espectrofotometría en uv-visible de los componentes separados, donde solo pudo
comprobarse la presencia del licopeno en la segunda muestra debido a que la primera
muestra separada(β-caroteno) fue contaminada accidentalmente.
 INTRODUCCION.

La cromatografía de adsorción se fundamenta en poner en contacto dos fases o

componentes mutuamente inmiscibles, que no reaccionen químicamente, una de las cuales
es móvil y la otra estacionaria. Las dos fases se eligen de tal forma que, los componentes de
la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la estacionaria. La fase
estacionaria, un sólido o un gel, contenido en una probeta de largo cuello, formando una
columna. La fase móvil consiste en una disolución de material que se desea analizar en un
disolvente apropiado que no se adsorba en la fase estacionaria. A medida que la fase móvil
pasa a través de la fase estacionaria, se va produciendo una adsorción selectiva: aquellos
componentes de la fase móvil que muestren mayor afinidad de adsorción con la fase
estacionaria quedaran retenidos en las capas superiores de la columna, y aquellos que
muestren menor afinidad se absorberán más tarde, más abajo en la columna. Como
consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas
o zonas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. El resultado es una
columna graduada o cromatograma en donde cada especie química se ha absorbido en una
capa concreta. Estas capas reciben el nombre de platos. [1 y 3]

Los componentes a separar, en su desplazamiento a lo largo del sistema

cromatográfico se mueven a diferentes velocidades, dependiendo de la afinidad de cada uno
por la fase estacionaria, respecto a la fase móvil. Cada uno de ellos se distribuye entre las
dos fases según un equilibrio caracterizado por una constante denominada constante de
distribución o coeficiente de distribución. Para el componente A,

[As]
KA=
[Am]

donde [AS] es la concentración de A en la fase estacionaria, y [Am] la concentración

de A en la fase móvil.

La adsorción es la retención de una especie química en los sitios activos de la

superficie de un sólido, quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa las
fases o superficie interfacial.

El fenómeno de adsorción ocurre en la superficie del granulo de fase fija, y se

fundamenta en la atracción entre el soluto y el adsorbente por formación de uniones dipolo
y formación de puentes de hidrogeno. La fuerza de interacción depende no solo de los
grupos funcionales, sino también de factores estéricos e isómeros estructurales.
 El tamaño del granulo del adsorbente es importante para el proceso, porque una
gran superficie implica una gran adsorción, es decir, mejor resolución. Cuando se utiliza el
adsorbente de grano más fino el equilibrio adsorción-desorción se establece rápido. Si el
tamaño del granulo es grande el equilibrio adsorción-desorción-adsorción será lento debido
a la lejanía entre sitios activos de los sucesivos gránulos de adsorbente. Esto implicara que
el soluto necesitara estar solubilizado un cierto tiempo en el eluyente y en ese lapso puede
difundir. Esta difusión conlleva a la formación de bandas en la cromatografía en columna [5]

La solubilidad relativa del soluto en la fase móvil va a depender de la polaridad del

compuesto, ya que si se trabaja en fase normal, los solutos más polares serán más retenidos,
mientras que los no polares correrán o se desplazaran, por la naturaleza del solvente. [2]

En cromatografía de adsorcion el disolvente compite con los solutos por los centros
activos de la fase estacionaria, por lo que la elución puede describirse como un
desplazamiento del soluto por el disolvente. Así, cuanto más intensa sea la interacción
disolvente-fase estacionaria, más tiempo pasará el soluto en la fase móvil y, en
consecuencia, más rápidamente será eluido. [6]

En la cromatografía de partición en fase normal la fase estacionaria es de caracter

polar, mientras que la móvil es apolar o menos polar. En la cromatografía en fase reversa la
fase estacionaria es menos polar que la fase móvil. [1]

El poder eluyente se define como la capacidad relativa de un determinado solvente

para desplazar solutos de un adsorbente dado.[6] las series elutropicas clasifican a los
solventes en una relación semicuantitativa basada en el poder eluyente de cada solvente.

En la practica a realizada el poder eluyente, de las distintas fases moviles empleadas

puede clasificarse en orden ascendente de la siguiente forma:

Éter de petróleo < hexano < diclorometano <Cloroformo

El orden de los disolventes es parecido al de polaridad (momento dipolar) de sus

moléculas. Sin embargo, la polaridad del disolvente, no es el único factor que producirá
solvatación, y por tanto, elución más rápida. Otros factores a tener en cuenta seria la
tendencia del disolvente a formar puentes de hidrogeno, y más específicamente, los factores
que afectasen al equilibrio de adsorción.

También es importante en la cromatografía de columna, la altura a la que se ha

quedado determinada una especie química. Esta altura se relaciona directamente con el
llamado tiempo de retención: cuanto mayor sea la afinidad de absorción entre el soluto y la
especie, menor tiempo de retención presentara. Otro parámetro característico es el volumen
de retención, la cantidad necesaria de fase móvil para transportar la especie desde la parte
superior de la columna hasta el detector. [4]

En un sistema cromatográfico el tiempo de reacción de un soluto particular es

constante, y por lo tanto puede utilizarse para identificar ese soluto. En caso de no ser
conocido el tiempo de retención de una especie dada siempre se puede recurrir para su
identificación a técnicas auxiliares, generalmente espectrografía.

El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis de alimentos,

medicinas, sangre, productos petrolíferos y de fisión radiactiva. La cromatografía de
columna, se usa para separar grandes cantidades de material aproximadamente mayores a
100 mg.

Tiene aplicaciones en la industria farmacéutica es las separaciones de componentes

de plantas medicinales, de componentes de una síntesis orgánica, de colorantes, en la
separación e identificación de hioscina y de morfina, también de ácido acético, alcohol
cetílico y metil-etil cetona, entre otras.

En la práctica realizada se llevó a cabo la técnica cromatográfica en columna con la

finalidad de comprender los fundamentos y utilidad de esta importante técnica de
separación. Los objetivos de la práctica son:

1. Separar por cromatografía en columna los principales carotenos y licopenos

presentes en un extracto de tomate y zanahoria

2. Seleccionar la fase estacionaria que optimiza la separación de los pigmentos en la

columna cromatográfica

3. Seleccionar la serie de solventes que optimiza la separación de los pigmentos en

la columna cromatográfica

4. Estudiar las diferencias moleculares y en propiedades fisicoquímicas del sistema

”fase estacionaria/analito/fase móvil” que se aprovechan para la separación cromatográfica
de los pigmentos de la zanahoria de los del tomate

5. Determinar las condiciones de operación del ensayo cromatográfica en columna.

6. Conocer la aplicabilidad de la cromatografía en la preparación y an´alisis de

productos de la industria de los alimento
 METODOLOGIA EXPERIMENTAL.

Se preparó una columna cromatográfica utilizando como recipiente una bureta de 50

ml .Para el empaque se utilizaron 10 g de alúmina (fase estacionaria), colocándose un
pequeño tapón de algodón al final de la columna para evitar que el empaque se saliera de la
misma. Mediante un embudo se introdujo el empaque en la columna dándole a la misma
unos leves toques con una manguera de plástico, para evitar deposiciones y
aglomeraciones. Para el acondicionamiento de la columna se utilizó éter de petróleo como
fase móvil, una vez que el empaque estuvo completamente húmedo se realizó la separación
de los pigmentos, insertando a los mismos en la parte superior de la columna con una
pipeta. Se empleó como primera fase móvil una mezcla éter de petróleo y hexano 70:30, y
luego como segundo eluyente una mezcla de éter de petróleo, hexano y diclorometano en
proporción volumétrica 2,8:1,2: 1 con respecto al diclorometano. Se toma nota de las
dimensiones del empaque seco y húmedo, además de medir los flujos de ambas fases
móviles cuando se encuentran en estado estacionario.

La bibliografía establece que es más frecuente echar el adsorbente en forma de una

papilla con el eluyente que colocar el adsorbente en seco(tal como se realizó en la
práctica), ya que es más fácil realizar un mejor empaquetamiento de la columna de esta
forma.

Aunque se ha utilizado una gran cantidad de sólidos como fases estacionarias en

cromatografía liquida de adsorción , las más empleadas son la gel de sílice y la alúmina. La
gel de sílice, (SiO2.xH2O), también llamado ácido silícico, es un material que se obtiene
por precipitación en medio ácido de soluciones de silicato sódico. El área superficial, el
tamaño de poro y el pH de la superficie dependen de las condiciones de precipitación. Así,
a pH 3.7. la superficie específica es 830 m2/g, mientras que a pH 5.7, el valor obtenido es
348 m2/g. Los centros activos son los grupos silanol (Si–O–H) superficiales, espaciados
unos de otros aproximadamente 5 Å

La alúmina (Al2O3.x H2O) presenta distintos tipos de interacción con los solutos,
ya que, por una parte, tiene sitios activos ácidos en las zonas próximas al Al3+, y centros
básicos en las zonas próximas al O2–. La proporción relativa de centros ácidos aumenta
con la temperatura de activación, mientras que la superficie puede desactivarse por adición
de agua.

La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitud

entre 10 y 30cm. El diámetro interno varía entre 3mm y 1cm y los tamaños de partícula
entre 5 y 10µm. En esta experiencia se utilizó una columna con dimensiones de 20 cm de
altura y 1,1 cm de diámetro.
 Generalmente las separaciones en columnas de 100 a 250 mm de largo x 4.6 mm de
diámetro se eluyen con un flujo de 1 ml/min y las separaciones preparativas que se
desarrollan en columnas de 250 mm x 9.4 mm de diámetro utilizan flujos de 4 ml/min.[4]

Finalmente, se recogieron en vasos de precipitado pequeñas porciones de las

bandas separadas, y se procedió a realizar la espectrofotometría uv-visible de las mismas
usando un espectrofotómetro Spectronic D+ Milton Roy Company.

RESULTADOS Y DISCUSION

En la práctica se llevó a cabo la separación de los pigmentos presentes en un

extracto de tomate y zanahoria, licopenos y β-caroteno, por medio de cromatografía en
columna. Todos los grupos trabajaron con alúmina como fase estacionaria, pero cada grupo
utilizo distintos eluyentes y/o distintas mezclas de los mismos.

Tanto el licopeno como el β-caroteno son carotenoides. Desde el punto de vista

químico, pertenecen a la familia de los terpenos, es decir están formados por unidades de
isopreno (ocho unidades, es decir, cuarenta átomos de carbono), y su biosíntesis se produce
a partir de isopentenil pirofosfato. Los carotenoides, como hidrocarburos, son sustancias
lipofílicas solubles en éter, aceites y disolventes no polares. Diferencias en su estructura se
traducen a diferencias en su polaridad, de modo que pueden ser separados por medio de
cromatografía en columna al utilizar distintos solventes como fase móvil. Además, el color
permite monitorizar su separación mediante cromatografía en columna.

El licopeno es un carotenoide de estructura sencilla con una cadena alifática

formada por 40 átomos de carbono (C40H56), altamente lipofílico que se caracteriza por
carecer de anillos cíclicos y poseer un gran número de dobles enlaces conjugados. Su
obtención por síntesis química aún no está totalmente establecida dado que los sistemas de
extracción son costosos y el licopeno presenta una baja estabilidad, por lo que se ha
limitado su utilización como colorante alimenticio y se extrae principalmente de fuentes
naturales.

Figura 1. Estructura del Licopeno.[4]

Por otro lado, el β-caroteno es el primer carotenoide purificado. Es el responsable del color
naranja en las zanahorias. Es un hidrocarburo de cadena alifática con dos anillos en los
extremos. (Figura 2).

Figura 2. Estructura del β-caroteno[4]

Tanto el licopeno como el β-caroteno son carotenoides. Desde el punto de vista químico,
pertenecen a la familia de los terpenos, es decir están formados por unidades de isopreno
(ocho unidades, es decir, cuarenta átomos de carbono), y su biosíntesis se produce a partir
de isopentenil pirofosfato.

Para la identificación de los carotenoides se usan los espectros y características de

absorción íntimamente relacionados con el número de dobles enlaces. El espectro de
absorción del β-caroteno posee dos máximos en 425-453nm y 480-481nm, mientras que el
licopeno presenta tres máximos de absorción a 444, 471 y 502nm

Figura 3. Espectro de absorción del licopeno.

 Figura 4. Espectro de absorción del β-caroteno.

En la práctica luego de colocar una pequeña porción de la muestra (extracto) en la

columna y realizar la elución con el eluyente 1 conformado por la mezcla 70:30 éter de
petróleo y hexano se observó la separación de los pigmentos en dos bandas de colores, una
amarilla(β-caroteno) y otra naranja(licopeno). La banda amarilla se movía más
rápidamente a través de la columna con el eluyente 1 mientras que la banda naranja bajaba
muy lentamente, siendo por tanto la banda amarilla la primera en ser eluida (salir de la
columna).

Lo anterior se debe a que la separación de los carotenoides está basada en sus

diferencias en polaridad, siendo el β-caroteno(banda amarilla) menos polar que el
licopeno(banda naranja). Por lo tanto el β-caroteno(no polar) será retenido más débilmente
por la alúmina(polar) , y fluirá más rápidamente por la columna junto con la fase móvil
1(no polar) .

Para permitir que el licopeno pueda moverse más rápidamente y sea eluido de la
columna es necesario incrementar la polaridad del solvente. Por ello se escogió un segundo
eluyente conformado una mezcla de éter de petróleo, hexano y diclorometano en
proporción volumétrica 56:24:20 respectivamente. Al agregarse el segundo eluyente se
logró extraer el licopeno de la columna, sin embargo el tiempo transcurrido para la elución
fue considerablemente mayor que para el resto de los grupos de laboratorio (quienes
trabajaron con mezclas distintas de eluyentes). Esto se debe a que se realizó un mal
empaquetamiento de la columna, ya que pudo observarse burbujas de aire entre el algodón
y la alúmina, además de una mala deposición del sólido.
 Finalmente, se recogieron en vasos de precipitado pequeñas porciones de las
bandas separadas, y se procedió a realizar la espectrofotometría uv-visible de las mismas,
obteniéndose los siguientes espectros de absorción:

Figura 5. Espectro de absorción de la segunda fase en eluir para la columna de alúmina

(muestra 1 fracción naranja)

Figura 6. Espectro de absorción de la segunda fase en eluir para la columna de alúmina

(muestra 2 fracción naranja)
 Es importante destacar que no se obtuvo el espectro de absorción para la primera
muestra en eluir, debido a contaminación de las celdas del espectrofotómetro con agua y
otros blancos distintos al de la muestra obtenida.

De la figura 5 y 6 correspondiente al espectro de absorción del licopeno, se puede

apreciar el pico característico en 470 nm, sin embargo el espectro presenta desplazamientos
e interferencias debido a la interacción de la muestra con otros componentes distintos al
licopeno. Cabe mencionar que los mismos estudios realizados por los otros grupos de
laboratorios arrojaron resultados más apreciables, con tiempo de eluciones menores. Por
ejemplo al compararse el espectro obtenido en nuestro caso para el licopeno con el espectro
para el mismo componente obtenido usando como eluyente 1 mezcla éter de
petróleo/hexano 30:70 seguido de la adición de una mezcla éter de
petróleo/hexano/diclorometano 15/35/50 (Grupo 2 ver anexo), puede observarse que las
señales de absorbancia para nuestro caso son débiles con respecto al espectro del grupo 2
para un mismo volumen de muestra (extracto) analizado. Esto pudiera originarse por varios
motivos siendo uno de ellos que el licopeno no fue separado totalmente de la alúmina en
nuestro caso debido a que se pudo observar un desplazamiento discontinuo de la banda
naranja lo cual a su vez se debe al mal empaquetamiento de la columna.

La velocidad de flujo de la fase móvil fue medida antes de depositar la muestra, y al

obtener la fracción del licopeno, obteniéndose valores de 0,70 ml/min y 0,5 ml/min las
cuales se encuentran dentro del rango optimo recomendado para cromatografía preparativa
(0,5 ml/min a 1 ml/min). Estas velocidades son bajas debido a que el mecanismo de flujo es
por gravedad.

El volumen de lecho de la Columna fue 16,76 cm3 el cual se corresponde con los
valores recomendados (10-25 cm y 4mm a 10 mm de diámetro), la porosidad calculada de
dicha columna fue de 0,85, siendo esta una alta porosidad comparada a la obtenida en otros
ensayos (0,79-0,82), lo cual proporciona una menor área de contacto entre analito/fase
móvil y una separación menos eficiente. No es recomendable volúmenes mayores de lecho
a los estipulados debido a que la velocidad de flujo se da solo por gravedad en
cromatografía preparativa, lo cual haría muy lenta la elución con el gasto de mayores
cantidades de eluyente para lograrla.
 CONCLUSIONES

 Se realizó por cromatografía en columna la separación del β-caroteno y licopeno,

principales pigmentos presentes en los extractos de zanahoria y tomate,
aprovechando la afinidad química de cada uno de ellos por determinados solventes.

 Usando una mezcla de éter de petróleo/hexano 70:30 se realizó la elución del β-

caroteno, y luego se llevó a cabo la elución del licopeno empleando como eluyente
2 éter de petróleo/hexano/diclorometano en proporciones volumétricas 2:2,8:1,2
con respecto al diclorometano, obteniéndose los mayores tiempos de elución con
respecto a los demás grupos que realizaron el estudio.

 Se encontró que los solventes más eficaces (utilizados por el grupo 2 de laboratorio)
que favorecen la separación de los β-carotenos y licopenos en la muestra estudiada
son : mezcla éter de petróleo/hexano 30/70 seguido de una mezcla de éter de
petróleo/hexano/diclorometano 15:35:50.

 La cromatografía en columna permite separar los distintos pigmentos presentes en

los vegetales y plantas, teniendo una amplia aplicación en la industria alimentaria y
farmacéutica. Siempre y cuando se utilicen las fases estacionaria y móvil adecuadas,
es posible obtener la separación óptima.

BIBLIOGRAFIA.

[1] SKOOG y HOLLER. (2001) Principios de Análisis Instrumental. McGraw-Hill

Interamericana de España, S.A.U. Madrid, España. Capítulo 26.

[2].Documento en línea.
http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/
cromatografia_principios_y_aplicaciones.pdf. Fecha de consulta 18/01/15.

[3] Documento en línea .http://www2.uadec.mx/pub/pdf/cienciacierta14.pdf. Fecha

de consulta 18/01/15

[4] Documento en línea. http://es.scribd.com/doc/78545419/EXTRACCION-DEL-

LICOPENO-Y-B#scribd. Fecha de consulta 18/01/15

[5].GALAGOVSTKY, Lydia. Química Orgánica: Fundamentos teórico-prácticos

para el laboratorio. Editorial Universitaria de Buenos Aires. Quinta edición. Buenos aires,
1999.
 [6]. GONZALEZ Claudio. Análisis instrumental aplicado a la ingeniería química. Editorial
Reverte. Colombia, 2005.

ANEXOS

Tabla 1. Datos para construir el espectro de absorción del β-caroteno y licopeno.

Absorbancia
Long. De Muestra 1(β- Muestra Muestra 2
Onda caroteno) 1(licopeno) (licopeno)
420 0 - -
430 0 - -
440 0 0,08 0,1
450 0 0,08 0,1
460 0 0,07 0,1
470 0 0,07 0,1
480 0 0,05 0,09
490 0 0,03 0,07
500 0 0,01 0,04
510 - 0 0,04
520 - 0 0,02

Tabla 2. Datos de la columna de Alúmina.

Diametro (cm) 1,1

Longitud columna seca(cm) 9,7
Longitud columna húmeda(cm) 9,5
Velocidad de flujo solvente(ml/min) 0,70

Tabla 3. Porosidad de la columna de Alúmina.

Densidad 4000 kg/m3

Vol total 16,76 cm3

1.676E-5 m3

Vol. alúmina 0.0000025 m3

vol hueco 9.940E-6 m3

porosidad 0.85