UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Escola de Inverno em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia

Apostila de Atividades Práticas

RIBERÂO PRETO

2017
 LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP

Bloco R – sala 6B Tel: 3315- 4313

Pesquisador Responsável: Profa. Elaine Cristina Pereira de Martinis
Monitores: Diego de Araújo Frazilio (Doutorando)
Monitores: Fabian Camilo Niño Arias (Mestre)

1. INTRODUÇÃO
Para o estudo da comunidade microbiana de importância em alimentos e ambientes

de processamento, é importante a utilização de técnicas clássicas de cultivo, afim de

determinar bactérias cultiváveis, bem como estudos de técnicas de biologia molecular, que

consegue detectar o DNA de micro-organismos não cultiváveis e possíveis patógenos não

identificados pelas técnicas de cultivos tradicionais.

O preparo do alimento para identificação microbiana, é o passo mais importante na

investigação da população microbiana presente na amostra, uma vez que erros na coleta,

podem levar a falsos positivos por contaminação durante a manipulação do alimento.

Neste sentido, o trabalho que será realizado esta semana, consistirá na extração e

amplificação de colônias de bactérias oriundas de alimentos, para posterior sequenciamento

molecular.

2. CRONOGRAMA

Segunda Terça Quarta Quinta Sexta

Dia
(24/07/2017) (25/07/2017) (26/07/2017) (27/07/2017) (28/07/2017)

Reativação das Confecção do gel de Discussão dos

Experimento 1: Extração do DNA Amplificação do
cepas e preparo dos agarose e leitura do resultados e preparo
DNA com Kit especifico material genético
reagentes amplicon da apresentação
 Discussão dos
Reativação das
Experimento 2: Leitura dos resultados e
cepas e preparo dos Confecção do MIC -
MIC resultados preparado da
reagentes
apresentação

3. EXPERIMENTO 1: Extração do DNA, amplificação e leitura do gel de

agarose.

2. Extração do DNA das amostras cultiváveis.

Alíquotas de 1 ml de culturas das bactérias patogênicas ou comensais foram

cultivadas em caldo Infusão Cérebro Coração (BHI) (Oxoid) (37ºC por 24 horas), foram

utilizadas para extração de DNA, através da utilização do Kit Illustra Bacteria Genomic mini

Spin kit (GE Life Sciences, Suiça) segundo instruções do fabricante. Para a quantificação e

verificação da qualidade do DNA, foi utilizado o equipamento Nanodrop 2000c (Thermo

Fisher Scientific, USA). A densidade óptica será lida a 260 nm, onde a suspensão de luz que

atravessa a suspensão de material genético e da quantidade presente, é dada através de

comprimento de onda e da intensidade de luz incidente, resultando em um sinal detectável

por sensores, fornecendo os valores desejados (LEPOT et al., 2016).

4.2.1 Amplificação genética (PCR) e purificação do DNA dos micro-organismos

cultiváveis.

A sequência escolhida para a amplificação genética pela técnica de PCR, será o gene

16S do rDNA ribossomal para as bactérias. O gene 16S rDNA ribossomal, funciona como

um gene multifamiliar com função conservada e grande suficiente para permitir a análise

dos dados por bioinformática (1500 pb) (SILVA, 2014).

 A reação de cadeia da polimerase (PCR) será realizada com 84 µL de Taq Platinum

Blue (Invitrogen), 30 pmol do primer 27F (Invitrogen), 30 pmol do primer 1492R

(Invitrogen) e 300 ng do DNA genômico, em um volume final de 50µL (TULINI, 2014).

A amplificação será realizada em um termociclador My Gene -Peltier series (long

Gene MG96+, China), onde será estabelecido 1 ciclo de desnaturação de 94ºC por 1 minuto,

seguido pelo passo de anelação a 55ºC por 1 minuto, e a extensão da fita de DNA a 72ºC por

2 minutos, em um total de 30 ciclos. Para confirmar a amplificação os produtos da PCR será

realizado a eletroforese em gel de agarose. O gel de agarose é preparado a 0,85% juntamente

com um tampão de TAE 1X, previamente preparado e composto de Tris (2-amino-2-

[hidroximetil]-1,3-propanodiol), ácido acético e EDTA (ácido etileno diamino tetra acético)

que possuem íons responsáveis por carregar a corrente elétrica e mantém o pH estável.

Depois da solidificação do gel na cuba de eletroforese, o amplicon será preenchido em poços

contidos no gel recém preparado e colocado sobre uma corrente elétrica através do pólo

negativo (DNA tem carga negativa) para o pólo positivo, sobre uma corrente elétrica entre

100 a 120 volts, para que ocorra a separação das bandas do DNA amplificado

(SANDERSON et al., 2014).

Os produtos da PCR serão purificados usando o kit Gel Band Purification (GE Life

Sciences, Suiça), e enviados para a unidade de sequenciamento na FCFRP-USP para ser

analisado pelo método de Sanger, usando o equipamento 3500 Genetic Analyzer (Life

Technology, EUA).

Os resultados de sequenciamento do DNA serão analisados utilizando o programa

Chromas 2.4.4 (Technelysium, South Brisbane, Austrália), combinado com o programa de

montagem de sequenciamento PRABI-Doua (Pôle Rhône-Alpes de Bioinformatique Site

Doua, France). As sequências de DNA serão comparadas com outras sequências depositadas
no banco de dados GenBank, através do programa

BLASTIN,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

3.1.Materiais utilizados

-Tubos de 10 mL

-Caixa com ponteiras volume 100-1000 µL.(azul)

-Caixa com ponteira volume 1-200 µL (amarela)

-Pipeta automática Volume (100-1000 µL)

-Frasco para descarte das ponteiras

-Algodão

-Álcool 70%

-Estufa bacteriológica

-Kit para extração de DNA

Tabela 2: Protocolo do meio de cultura BHI para reativação das bactérias

Componentes Quantidade
Caldo cérebro e coração (BHI) 18,5 g
Água destilada 500 ml

Caso haja a necessidade, é possível comprovar a ação bactericida do experimento,

através da realização do plaqueamento da cultura em meio sólido, para isso basta adicionar
15g de ágar bacteriológico na composição do meio e verter em placas de plástico estéril,
para solidificação do meio de cultura. Depois basta inocular 100 µL da amostra, deixando
por 24 horas e observar se ocorreu crescimento.
Anotações:
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4. EXPERIMENTO 1: TESTE DE SENSIBILIDADE – EXTRATOS DE

REFLUXO – PH NEUTRO
4.1. Objetivo

O objetivo do teste de MIC (concentração inibitória mínima), consiste em avaliar a

ação dos antimicrobianos, como antibióticos e outros compostos, através da leitura da
observação de turvação em diferentes concentrações, observando qual foi a concentração
mínima responsável por eliminar bactérias. É uma metodologia relativamente simples de
ser realizada e permite, de certa forma, indicar o produto mais eficaz e/ou dosagem a ser
empregada, dentro de um período de 24 horas, o que torna a utilização dos
antimicrobianos mais econômica e racional.

4.2.Materiais utilizados

PARA O MIC: Caixa de ponteiras de 1mL; Caixa de ponteiras de 5mL, caixa de ponteiras
de 100uL; 250mL de meio Miller Hinton caldo ou BHI, 2 frascos de Boeco de 250mL;
Pipetador Multicanal de 200µL; Placas de petri estéril; Solução salina (9ml em tubo de
preferência); Escala de marcfarland 0,5.

PARA O CIB: Meio de cultura em placa Miller Hinton ou BHI; palitos de dentes
autoclavados; mosaico impresso de placa de elisa 96 poços.
 4.3. Preparo das Soluções Estoque

4.3.1. Solução estoque de tetraciclina – inibidor de bactérias

-Dissolver 250 mg (0,25g) de tetraciclina em 25 ml de água destilada esterilizada, formando

assim uma solução estoque de 10000ppm.

-A dosagem recomendada para este experimento é de 10 ppm, para isso basta colocar 0,1 µL
da solução estoque preparada em 100 ml de água esterilizada, e utilizar 450 µL da solução
preparada a partir da solução estoque.

Validade e conservação – Até um mês armazenado sob refrigeração.

4.4 Procedimento

O meio de cultura utilizado para o teste de sensibilidade é o GLT e o BHI caldo (descrito
na tabela 1 e 2), pH ajustado de acordo com a necessidade experimental.

Tabela 2: Protocolo do meio de cultura BHI

Componentes Quantidade
Caldo cérebro e coração (BHI) 18,5 g
Água destilada 500 ml

Caso haja a necessidade, é possível comprovar a ação bactericida do experimento,

através da realização do plaqueamento da cultura em meio sólido, para isso basta adicionar
15g de ágar bacteriológico na composição do meio e verter em placas de plástico estéril,
para solidificação do meio de cultura. Depois basta inocular 100 µL da amostra, deixando
por 24 horas e observar se ocorreu crescimento.

3.4.1. Preparo das Amostras de Bactérias

Preparar o meio de cultura BHI e GLT mencionado acima e transferir 5 ml deste para
tubos Falcon® previamente esterilizados, posteriormente colocar em estufa por 24 horas,
tendo assim preparado o inóculo para o experimento.
 Para cada bactéria que se deseja estudar a ação bactericida, será testado o antibiótico
de interesse ou extrato de planta.

PROCEDIMENTO
 Transferir com pipeta 0,15 ml da solução estoque de actidiona para cada tubo
contendo 15 ml do meio de cultivo esterilizado,
 Preparar os materiais, colocando no fluxo lâminar já limpo e esterilizado com
álcool 70%, as ponteiras, os pipetadores, o meio liquido, a solução salina, o
inóculo que se deseja estudar.
 Primeiramente pega-se o meio liquido e coloca uma alíquota numa placa de
petri estéril, para não se ficar voltando ao frasco que foi autoclavado, evitando
que o mesmo seja aberto e fechado várias vezes para evitar contaminação,
colocar em todos os poços 100µL de meio Miller, exceto a coluna número 3,
na coluna 1 colocar 200µL para controle -, na coluna 3 apenas 40µL do meio,
em seguida pega-se uma solução mãe que foi preparada através da
concentração de escolha, nesse caso preparamos uma solução mãe de
200ppm, que ao se colocar 160µL dessa solução na coluna 3, junto com os
40µL do meio, sofreu uma nova diluição ficando a 160ppm. Dessa coluna
contendo 200µL (160 do antibiótico + 40µL do meio), com a pipeta
multicanal, pega-se 100ul e passa para a coluna 4 que já contem 100ul apenas
de meio, em seguida passa 100µL da coluna 4 para 5 até a coluna 12,
desprezando os últimos 100ul. Pega-se então 100ul do inóculo preparado na
escala 0,5 de marcfarland e diluído 60x (12ml de meio e 240µL do inóculo
na escala 0,5), e coloca-se 100µL do inoculo da coluna 2 até a coluna 12.
Vedar a placa com papel filme e incubar. No dia posterior marcar a
concentração no qual o poço não turvou, mostrando que o antibiótico teve
ação impedindo o crescimento. Em seguida, pegar a placa com meio sólido,
e ir com os palitos de dente molhando nos poços e furando o mosaico pregado
na traseira da placa. Todos os 96 poços devem ser molhados e furados na
placa. No dia seguinte analisar se houve o crescimento marcando qual
concentração, as bactérias não cresceram.

3.4.2. Interpretação dos Resultados

 O resultado do teste de MIC é através da turvação ou da ausência de turvação que será
lida visualmente, uma vez que quando maior a turvação, também será menor a eficiência
contra aqueles microrganismos. Referências Bibliográficas

QUÍMICA REAL. Manual técnico de fermentação alcoólica. Versão.2. brasil.

Anotações:
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