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Medida del crecimiento

El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de
acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas
metodologías.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las células individuales,
esto es iniciar y completar una división celular. De esta forma, se considera a los microorganismos
como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el número total de
partículas bacterianas. Existen dos formas para determinar el número total de microorganismos en
una muestra:

Recuento microscópico de partículas

Recuento electrónico de partículas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias
debido a que sólo se tiene en cuenta el número de microorganismos viables, esto es capaces de
crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias
Método del número más probable

Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos moleculares una medida del crecimiento es
el incremento de biomasa. Para ellos, la síntesis macromolecular y un incremento en la capacidad
para la síntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la
división celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que
limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimático para utilizar los recursos del medio y
formar biomasa.

Determinación de peso húmedo

Determinación de peso seco
Determinación de nitrógeno total
Determinación química de un ácido nucleico

Un último grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los
microorganismos en los cambios químicos de su entorno como consecuencia del incremento de la
biomasa.

Recuentos Directos

Recuento microscópico:
fácilmente disponible en
generalmente cámaras de
filtradas en membranas y
acridina).
Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento
un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan
recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de muestras
transparentadas o teñidas con colorantes fluorescentes (Naranja de

La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad en el llenado de la cámara

con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies del vidrio, incluyendo
pipetas. Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al realizar
las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de
carbono).

Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la
ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los recuentos se
realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar
información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados.

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Camara de recuento de Petroff-Hausser

Area Volumen Factor

Tipo de cuadro 2
[cm ] [ml] [1/Volumen]

Cuadrado total -2 -5 4
1.00 x 10 2.00 x 10 5.00 x 10

Cuadrado grande -4 -7 6
4.00 x 10 8.00 x 10 1.25 x 10

Cuadrado pequeño -5 -8 7
2.50 x 10 5.00 x 10 2.00 x 10

1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de recuento.

Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara que se utilizaron
para contar un el número de bacterias.
Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cámara. Depende del tipo de
cuadrado en donde se realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeño tiene un
3
volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm x 20 µm = 5 x 104 µm = 5 x 10-8 ml)

Recuento electronico: Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias,

levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o
miceliares.

Estos instrumentos constan básicamente de dos compartimientos comunicados a través de un

pequeño conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia eléctrica del
sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia
eléctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos
instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es
forzada a pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un muy breve
intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de
éste se incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos
cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados.

Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeñas producen
cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se
desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse células que formen filamentos o
agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de más de
una célula en un breve período de tiempo va a ser tomado como una célula más grande. Es común
la obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes.

Medida de la Biomasa
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Medida de la Biomasa

La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada frecuentemente

como base para la medida de una actividad metabólica, o de un constituyente metabólico o
químico.

Algunos de los métodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse
complicados si se busca la exactitud.

Peso húmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la
separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes
de muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al

peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet
de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre
el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se
determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una
centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que
pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.

Peso seco: El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en
una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso
constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del
orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias.

La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el
secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad
durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

Determinación de ácidos nucleicos: Es una técnica que permite determinar indirectamente la

masa de una población bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado ácido
nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la población.

Determinación de nitrógeno: Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de

una población bacteriana. Existen distintas técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que
contiene una muestra con relación al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el
nitrógeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrógeno proteico mediante absorción en
UV, Reacción de Biuret, Reacción de Lowry, o el nitrógeno total mediante la Digestión de Kjeldahl.

Incorporación de precursores radiactivos: Es una técnica que permite determinar

indirectamente la masa de una población bacteriana. En esta técnica se adiciona al medio un
compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la célula, y luego se determina la
cantidad de marca incorporada por toda la población.

Dispersión de la Luz

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es
reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la
luz dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz dispersada como un
decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. Con relación a la longitud de onda y al
tamaño de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión.

Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento
de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos.
Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular).

Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de

una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de
bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de
concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del
microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC
(Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por
esta razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos
viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de
microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el
número de microorganismos totales o con UFC.

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Absorbancia en función del Peso Seco

Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del
microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).

Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml).

La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de
bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores
mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar
suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo
nivel de absorción.

Absorbancia en función del Peso Seco

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Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales

En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes
con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de
microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.

Bibliografía:

http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=medida
http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/12-metodos%20de%20recuento.htm

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