DIA TEMAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

22/08– 5ª f. Introdução a Biologia Molecular; Experimentos clássicos de transferência de DNA.

Estrutura do DNA, Modelo Watson – Crick, Experimento de Meselson-Stalh

23/08– 6ª f. Replicação do DNA e Amplificação gênica.

Estudo dirigido 1

29/08– 5ª f. Transcrição do DNA – Mecanismos em Procariotos e eucariotos; Tipos de RNA -processamento

Estudo dirigido 2

30/08– 6ª f. Código genético – Etapas da Biossíntese de Proteínas

Estudo dirigido 3

O5/09– 5ª f. Controle da Expressão Gênica em Procarioto e Eucariotos; Modelo do Operon Lac / Níveis de
Regulação em Eucariotos.

Seminários grupos 1 e 2.
06/09– 5ª f. Técnicas em DNA recombinante; enzimas de restrição; clonagem gênica; sequenciamento; PCR e
aplicações médicas

Seminários grupos 3 e 4
12/09- 5ª f.
Seminários grupos 5 e 6.
13/09 6ªf. PROVA DE BIOLOGIA MOLECULAR
 Referências Bibliográficas
1- “Lehninger Principles of Biochemistry” (David L. Nelson, Michael
M. Cox),
 CAPs:
24- Genes and Chromosomes
25- DNA Metabolism
26- RNA Metabolism
27- Protein Metabolism
28- Regulation of Gene Expression
2- Bases da Biologia Celular e Molecular (Eduardo de Robertis,
José Hib- 4a Ed)
 CAPs:
13- Os genes
14- A Transcrição do RNA
15- O processamento do RNA
16- Síntese de proteínas
17- Replicação do DNA
 Referencias Bibliográficas
3- Molecular Biology of the Cell
(B Alberts, D Bray, J Lewis, M Raff, K Roberts, J Watson)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21054/)

4- Molecular Cell Biology- 5a ed (H. Lodish, A. Berk, P.

(Matsudaira, C. A. Kaiser, M. Krieger, M. P. Scott, L.
Zipursky, and J. Darnell)
Para animações, textos e tabelas, vídeos etc
(http://bcs.whfreeman.com/lodish5e/default.asp)

5-

(http://www.nslij-genetics.org/search_pubmed.html)
 OMIM: http://www.ncbi.nih.gov

©2009 Gus Rosania

 BIOLOGIA MOLECULAR

Temas para os seminários

1. Medicina personalizada:aplicações para diagnóstico e

tratamento
2. Terapia gênica
3. Telômeros, câncer e envelhecimento
4. Transferência de material genético entre microrganismos:
implicações na resistência à antibióticos e patogenicidade
5. Transgênicos e suas aplicações na medicina
6. Metagenômica aplicada à medicina

Obs: Cada grupo deverá ter no mínimo 5 e no máximo 6 alunos. Os

seminários serão apresentados por “todos os membros do grupo” em
aproximadamente 30 minutos (com duração máxima de 40 minutos).
A nota será dada individualmente e por grupo.

Avaliação do bloco:
Prova = 75%
Relatórios dos estudos dirigidos = 5%
Seminário = 20%
 BIOLOGIA MOLECULAR

Na 2a metade do Séc. XX surgiu o

interesse por componentes elementares da
célula  moléculas
↓
Medicina molecular
Medicina Genômica

“Baseia-se no sequenciamento do DNA (determinação da ordem das bases

nitrogenadas: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T), na
molécula de DNA) para ter informações sobre predisposições genéticas
de cada indivíduo e tratá-los de forma preventiva e personalizada.
 Detecção de mutações por
sequenciamento do DNA

Busca conhecer alterações na moléculas do DNA, ou seja,

mutações específicas, que possam servir como marcadores
genéticos de uma determinada doença.
 Mutação
 Definição molecular: alteração na sequência de bases de um
DNA em relação a uma sequência referência

 Definição biológica: alteração na sequência de bases de um

DNA que resulta em mudança na estrutura ou função do
DNA ou da proteína codificada por ele.

Codon

AAA GAC AGT AAA AAC AGT- referência

Silent Mutation

AAA GAC AGT AAA AAC AGC- mutante

Lys Asp Ser Lys Asn Ser

(K) (D) (S) (K) (N) (S)
Medicina Genômica (Molecular)

Diagnósticos genéticos

Terapias genéticas
Análise Clínica x Biologia Molecular
 Detecção do Câncer

CA= “Cancer Antigen”; CEA= “Carcinoembryonic Antigen”

PSA= antígeno prostático específico

Outras aplicações da Biologia Molecular na Medicina
 Medicina Personalizada = Medicina Genômica

Em 2003 o sequenciamento
de um genoma humano
inteiro custava ~U$2.7b;
em 2013 este valor é
apenas U$5.000,00
(06/2013)

Pessoas que podem

desembolsar U$5 mil
podem conhecer todos os
seus genes.

É a medicina personalizada: visa diagnósticos precoces e

tratamentos adaptados à genética de cada pessoa.
http://veja.abril.com.br/blog/genetica/pesquisas/remedios-personalisados-o-futuro-
ja-comecou/
 http://cienciahoje.uol.com.br/colunas/deriva-genetica/medicina-genomica-a-
Os cinco ‘P’s da medicina genômica (imagem: Sergio Pena) ciencia-de-manter-a-saude
 Medicina “eletrônica” P5- medicina do futuro?

- Você fornecerá dados pessoais, incluindo de seu genoma, para um site

P5 de medicina eletrônica, no computador.

- Se sentir algo anormal, descreverá os sintomas, sem sair de casa.

- O site P5 poderá sugerir: férias, conversa com analista ou uma série de

exames e onde poderão ser realizados.

- No caso de imagens, o próprio computador terá dispositivos para

fotografá-lo internamente nos mínimos detalhes. Será a ressonância
magnética do futuro.

- O programa poderá concluir: (a) não há nada de errado (b) um provável

diagnóstico. Baseando-se nos seus genes, o programa decidirá que
medicamentos você deverá tomar e em que dose  farmacogenômica

http://veja.abril.com.br/blog/genetica/pesquisas/medicina-eletronica-a-
medicina-do-futuro/
UMA BREVE HISTÓRIA DA
Natureza química do material
genético
 Descoberta da nucleína

Friedrich Miescher, químico alemão, em 1868:

 Primeiro estudo químico sobre o núcleo celular

 Isolou uma substância (nucleína) dos núcleos de células

purulentas (glóbulos brancos) obtidas de curativos
descartados.

 A nucleína continha o elemento químico fósforo e

consistia de uma porção ácida e outra básica.

 Encontrou a substância também na cabeça de

espermatozoide de salmão.
 O ácido nucleico
Richard Altmann (um aluno de Miescher),
patologista e histologista alemão, em ~ 1889.

 Obteve preparações altamente purificadas de

nucleína, sem nenhuma contaminação por
proteínas e confirmou os resultados de
Miescher.

 Pelo fato de a substância ter caráter ácido, o

que já havia sido detectado por Miescher,
Altmann sugeriu que ela fosse chamada de
ácido nucléico.
 Descoberta das bases nitrogenadas
Albrecht Kossel, bioquímico alemão, entre 1877-1897

 estudou a composição química das nucleínas e detectou dois tipos de

bases nitrogenadas já conhecidas, a adenina e a guanina.

 identificou uma nova base nitrogenada, que era liberada pela

degradação de nucleína da células do timo; por isso denominou-a
timina.

 logo em seguida, descobriu que a nucleína continha um quarto tipo de

base nitrogenada, a qual denominou citosina.

 em 1894, o grupo liderado por Kossel descobriu que os ácidos

nucléicos continham também pentose, um açúcar com cinco átomos
de carbono.

Em 1910 Albrecht Kossel recebeu o prêmio Nobel de Fisiologia e

Medicina.
 O nucleotídeo
Phoebus Levine e Walter Jacobs em 1909:

 conseguiram determinar a organização dos grupamentos

fosfato, pentose e base nitrogenada no ácido nucléico.

 esses três componentes estão unidos entre si formando uma

unidade fundamental, o nucleotídeo.

 a pentose do DNA foi denominada 2-deoxi-ribose, pelo fato

de ela possuir, no carbono 2 de sua cadeia, um átomo de oxigênio a
menos que a ribose,

 A ribose é ua pentose encontrada no

ácido ribonucléico ou RNA.
2-deoxi-ribose
ribose
No início do século XX- os componentes do DNA já eram conhecidos
DNA como material genético
1- Frederick Griffith, microbiologista inglês
(1928) Modelo de estudo:Streptococcus pneumoniae.

Colônias lisas (S) Colônias rugosas (R)

Streptococcus pneumoniae
Frederick Griffith’s “Transformation Experiment” (1928)
“Fator de transformação” em S. pneumoniae

1 2 3 4
Experimentos de F. Griffith

 mostraram que a adição de células S virulentas

(encapsuladas) mortas pelo calor a Streptococcus R não
virulentos (não encapsulados) causava a transformação
de células R em S.
Griffith não identificou o “fator de transformação”, que

achava ser uma “proteína”.

 Seu interesse era meramente médico

 Geneticistas não conheciam herança genética em
bactérias
 Médicos não sabiam muito sobre genética
Resultados dos experimentos de F. Griffith
foram confirmados por outros pesquisadores
nos USA.

Oswald Avery, Maclyn McCarthy, Colin

McLeod em 1944, USA- testaram
capacidade de transformação de várias
frações celulares e sugeriram que o fator de
transformação era o DNA.
O. Avery, M. Mc Carthy, C. McLeod
• Extraíram o DNA (?) dos Streptococcus S (encapsuladas
virulentas) mortos, removeram as proteínas com enzimas
específicas e adicionaram-no a células R (não
encapsuladas)- estas se transformaram em S.

• Compararam a composição do elemento transformador e

de um DNA (presença dos elementos químicos do DNA,
C,H,N e P) e verificaram similaridade.

• A capacidade de transformação do material não foi

destruída por enzimas proteolíticas (digerem proteínas)
ou RNA-ases (digerem RNAs) e foi destruída por
DNA-ases, que digerem o DNA.

Portanto, DNA poderia ser o fator de transformação

Avery’s Transformation Experiment (1944)

Confirmou que o DNA era o material genético

Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
 2-Alfred Hershey e Martha Chase em 1952,
USA
 Utilizaram uma bactéria
(Escherichia coli) e um
bacteriófago (fagoT2).

 O fago T2 infecta a célula

bacteriana e em ~20 min
cada célula bacteriana libera
~100 novas partículas de T2.

 Estrutura de T2: DNA e

proteína
Ciclo de vida do bacteriófago T2
 Experimentos de Hershey-Chase (1953)
A- 1 e 2:
O DNA do fago foi marcado com P32 (1)
As proteínas do fago foram marcadas com 35S (2)
Fagos marcados S35 e P32 foram purificados
 Experimentos de Hershey-Chase (1953)

B- 1 e 2: Empty
Radioactive protein shell Radioactivity
B
Phage
protein (phage protein)
in liquid
Bacterial cell

• Fagos marcados foram

adicionados
Batch 1: DNA
Sulfur (35S)
Phage
separadamente a DNA

suspensões de E coli – Centrifuge

após minutos, as Pellet (bacterial

suspensões foram
Radioactive
DNA cells and contents)

agitadas e Batch 2:

centrifugadas- as
Phosphorus (32P)

células (sedimento)
mais os meios fluidos
(sobrenadantes) foram Centrifuge
Radioactivity
analisados para S35 e Pellet (phage DNA)
in pellet
P32
 Experimentos de Hershey-Chase - 1953

Resultados:

- 80% do material marcado com S35 estava nos meios

fluidos e

- 70% do P32 foi encontrado associado as células.

Conclusão:
DNA: material responsável pela hereditariedade.
Descoberta dos ácidos nucléicos (DNA e RNA)
Dois momentos importantes na história da descoberta dos
ácidos nucléicos (DNA e RNA):

 1- A descoberta da sua existência no núcleo celular e a

determinação de sua composição química
(1868-1909: F Miescher, R Altmann, A Kossel, P Levine e
W Jacobs)

 2- A identificação e aceitação do DNA como material

hereditário
(1928-1952: F. Griffith, O Avery, M McCarthy, C
McLeod, A Hershey e M Chase)

 Até então acreditava-se que as proteínas fossem o

material hereditário, devido a sua impressionante
variabilidade de composição e estrutura.
Estrutura do DNA
 Nucleotídeos = monômeros do DNA e RNA
1- Açúcar: pentose (5-carbonos)
DNA = deoxi-ribose
RNA = ribose

Pirimidinas

2- Bases Nitrogenadas
Purinas Pirimidinas
Adenine Uracil (RNA)
Guanine Citosina
Timina (DNA)

Purinas 3- Fosfato ligado ao 5’ C do

açucar
 Nucleotídeos

5’

Deoxicitidina
Deoxitimidina
Deoxiguanosina
Deoxiadenosina

Adenosina
Citidina
Guanosina 3’
Nucleotídeos:
AMP, ADP, ATP

Estrutura
primária do
DNA
Composição de bases do DNA (?)

1-Informações obtidas de experimentos de

Erwin Chargaff e cols. (1947):

Analisaram a composição de bases

(% de A,G,C,T) do DNA de diversos

organismos, do ponto de vista qualitativo e
quantitativo.
 Resultados de experimentos de Erwin
Chargaff e cols. (1947)

a composição de bases pode variar de

uma espécie para outra
 a composição de bases do DNA de
diferentes tecidos de um mesmo
indivíduo é igual
 o estado nutricional, bem como idade e
mudanças ambientais não alteram a
composição de bases do DNA
 espécies afins possuem composição de
bases semelhantes
Organismo %A %G %C %T A/T G/C %GC

φX174 24.0 23.3 21.5 31.2 0.77 1.08 44.8

Milho 26.8 22.8 23.2 27.2 0.99 0.98 46.1
Polvo 33.2 17.6 17.6 31.6 1.05 1.00 35.2
Galinha 28.0 22.0 21.6 28.4 0.99 1.02 43.7
Rato 28.6 21.4 20.5 28.4 1.01 1.00 42.9
Humano 29.3 20.7 20.0 30.0 0.98 1.04 40.7
Gafanhoto 29.3 20.5 20.7 29.3
Ouriço do 32.8 17.7 17.3 32.1
mar
Trigo 27.3 22.7 22.8 27.1
Levedura 31.3 18.7 17.1 32.9
E. coli 24.7 26.0 25.7 23.6
 Regras de Erwin Chargaff

Em todos (?) os tipos de DNA, as quantidades de

 A=T e de G=C

 A+G=T+C

 A+T é diferente de G+C

A relação (A+T/G+C) é espécie específica

Resultados sugeriram que a maioria das moléculas
de DNA analisadas poderiam ser dupla fita.
 2-Outras descobertas que ajudaram na
elucidação da estrutura do DNA

 1953 – Rosalind Franklin

e Maurice Hugh
Frederick Wilkins

1920 - 1958

1916 - 2004
 Cristalografia por difração de raios-X de
moléculas

A difração de raios-X é um dos principais métodos de

determinar estrutura moleculares.

• Baseia-se na interação dos raios-X com os elétrons

dos átomos das moléculas com espalhamento

•Utilizam-se raios-X porque têm comprimento de onda

da ordem de grandeza das distâncias interatômicas

•São necessários monocristais da amostra a analisar

 Difração do DNA com raios-X: R Franklin & M Wilkins

DNA cristalizado 90% hidratado

“One of Franklin's X-ray
diffraction images of
DNA”.
A "cruz" formada de pontos
escuros indicaram que a
molécula era helicoidal”.
 Resultados da difração de raio-X do DNA

O DNA é uma molécula

longa (raio de 1,0 nm)
e helicoidal

Tem partes paralelas

ao longo da molécula

Apresenta duas
periodicidades: a cada
3,4 nm e a cada 0,34 nm
Bases e as medidas
Pareamento de bases: sugeridas por Rosalind
entre purina e
pirimidina
Resultados da difração de raio-X do DNA

 Mostraram a forma particular como a

molécula do DNA se enovela- foi

sugerida pela primeira vez em 1953,

realizados por R. Franklin e M. Wilkins.

 3- Estrutura do DNA
 M Wilkins, mostrou a imagem obtida por R Franklin a
James D Watson, geneticista americano, também
interessado na determinação da estrutura do DNA,
sem que R Franklin soubesse.

 “Os geneticistas consideram hoje que R Franklin fez

mais do que preparar o terreno para Watson e Crick;
ela deveria ter partilhado com eles o prêmio Nobel se
estivesse viva na ocasião”
Pascal Acot. Ciência e Ambiente, v 26, 2003. A DUPLA
REVOLUÇÃO DA DUPLA HÉLICE
 Modelo do DNA de James D. Watson
& Francis Crick - 1953
 J.Watson, geneticista americano e F.
Crick, físico britânico, trabalhando em
Cambridge (UK) reuniram todos os dados
disponíveis sobre estrutura do DNA

 Propuseram um modelo hipotético

tridimensional para o DNA baseado tanto
nos dados de difração de raio-X do DNA
quanto no pareamento de Chargaff.
 Modelo de Watson e Crick: o DNA é uma
dupla hélice
 Duas cadeias em torno de um eixo
comum formando uma hélice para a
direita

 Cadeias antiparalelas não idênticas em

sequências e composição de bases-
complementares

 O esqueleto hidrofílico- unidades

alternadas de fosfato e ribose-
voltado para o lado de fora da hélice,
em contato com o meio aquoso.

 As bases de ambas as cadeias estão

empilhadas dentro da dupla hélice com
seus anéis em planos perpendiculares
ao eixo longo

 Pareamento compatíveis: A-T e G-C

 Ligações químicas no DNA
Pontes de
hidrogênio
5 3
Ligações
covalentes
fosfodiester

3
5
• A dupla hélice é mantida por
dois tipos de forças:
(1) pontes de hidrogênio entre
as bases
(2) interações hidrofóbicas
entre as bases empilhadas

• A relação espacial entre as

cadeias cria dois tipos de
sulco na molécula: maior e
um menor.

• As periodicidades na
estrutura do DNA
observada na imagem da
difração do raio-X são:
(1) distância entre pares de
base de 0,34nm
(2) uma volta completa da
hélice de 3,4nm (10pb)
 A Dupla Hélice
A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a
direita
Estrutura do DNA
1953 – James Watson e Francis Crick
1962: Nobel Prize in Physiology and Medicine

James D. Francis H. Maurice H. F.

Watson Crick Wilkins

“ What about
Rosalind Franklin”?
 Estruturas do DNA

 As fotografias de raios X mostraram dois

tipos de estruturas de DNA: A-DNA e B-
DNA.
 O B-DNA foi obtido quando o DNA estava
totalmente hidratado, como se estivesse
in vivo.
 O A-DNA foi obtido sob condições não
fisiológicas de hidratação (estava
desidratado).
 A-DNA, B-DNA, Z-DNA
 Estudos posteriores mostraram mais um tipo, o Z-
DNA.
 A diferença entre A e B-DNA está no número
médio de pares de bases por volta da hélice:
10,9bp no A-DNA e 10bp no B-DNA.

 O Z-DNA tem uma estrutura um pouco

diferente, com uma hélice esquerda e esqueleto de
açúcares e fosfato em zig-zag.

 O B-DNA é a conformação mais importante

Estruturas alternativas do DNA
Z-DNA- as cadeias
formam um zig-zag. Ao
contrário de B, que é uma
hélice direita, Z é uma
hélice esquerda. Cada volta
tem 4,6 nm, com 12 pares
de bases

A-DNA- Em solução com

altas concentrações de sal
ou álcool a estrutura do
DNA pode alterar da
forma B para a forma A
com ~11 pares de
bases/volta de 2,3nm.

DNA-B- hélice direita.

A-DNA B-DNA Z-DNA
Cada volta tem 3,4 nm,
com 10 pares de bases.
 Superenovelamento do DNA

T2 DNA- 60.800nm;dimensão 210 nm

E.coli DNA- 1,58 mm, E coli cel.0,001mm
.
nucleoide

E.coli DNA- 1,58 mm

 Superenovelamento do DNA
DNA apresenta vários domínios superenovelados
que são estabilizados por proteínas especiais
básicas. Ex: E.coli- DNA > 50domínios
 Estrutura da cromatina de eucarioto

~2,0 m na forma linear

Cromatina- complexo de DNA e proteínas

Dois tipos principais de proteínas:

• Histonas- abundantes, básicas, carregadas

positivamente e se ligam ao DNA (ácido):

5 tipos principais: H1, H2A, H2B, H3, H4

• Não-histonas- que variam em tipo e

estruturas
Empacotamento do DNA nos
cromossomas

Nível 1-
DNA (146 bp) se enrola ao redor
de um complexo de histonas
que consiste de 2 cópias das 4
histonas : H2A, H2B, H3 and
H4
Nível 2-
Nucleossomas são ligados entre si H1

no DNA como um colar de

pérolas

(O empacotamento do DNA em fibras

de cromatina de 11 nm diminui em ~
6 vezes o seu comprimento!)
 Empacotamento do DNA nos cromossomas

Nível 3- Empacotamento dos nucleossomas de

em fibras de cromatina de 30nm de
espessura
30nm

Nível 4-Formação de regiões

em alças.
Fibras de cromatina
 Diferentes níveis de organização das fibras de cromatina

Comprimento de cada cromossoma humano: varia de 1,7- 8,5 cm

“Stretched end-to-end, the DNA in a single human diploid cell extends ~ 2m”
Organização do DNA/RNA em cromossomas
Virais:

1. Cadeia simples ou dupla de DNA ou RNA

2. Circular ou linear

Bacterianos:

1. A maioria contém uma molécula de DNA circular fita dupla

2. Outras bactérias contêm uma ou mais moléculas de DNA

circular ou linear empacotadas na região chamada nucleoide.
 RNA de cadeia simples também formam
estruturas resultantes de interações
entre bases complementares.