INTRODUCCION A LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

¿Qué es la cromatografía?
"Un método utilizado para la separación de los componentes de una muestra,
los cuales se distribuyen en dos fases: una fase estacionaria, que puede ser un
sólido, un líquido o un gel sobre un soporte solido (columna, película, o capa);
y una fase móvil (liquida o gaseosa) que se mueve a través del soporte sólido.
Cromatografía: técnica de separación donde los componentes de una muestra
se distribuyen entre dos fases (Fase Móvil y Fase Estacionaria), como
consecuencia de su diferente afinidad hacia dichas fases. La separación se basa
en las distintas velocidades de migración de los analitos, determinadas por el
tiempo que permanecen en cada fase.

Fig. 1. Separación de dos componentes por cromatografía de columna.

Se mide la concentración de los componentes a la salida de la columna y se

representa en función del tiempo transcurrido desde la introducción de la
muestra, se obtiene una gráfica denominada "cromatograma".
 Fig2. Cromatograma.

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATÓGRAFICOS

Los métodos cromatográficos se clasifican de acuerdo a:
 Estado físico de las fases móvil y estacionaria (gas-líquido, líquido-
líquido, etc).
De acuerdo a la naturaleza de la fase móvil, los métodos cromatográficos se
clasifican en tres grupos: Cromatografía líquida, Cromatografía de gases y
Cromatografía de fluidos supercríticos, según si la fase móvil es un líquido, un
gas o un fluido supercrítico.
En cromatografía líquida, si la fase estacionaria es polar y la fase móvil no-
polar, se denominan sistemas normales, o de fase normal. En estos sistemas,
la retención del soluto se incrementa generalmente con su polaridad. Por otra
parte, si la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil, el sistema se
designa como de fase inversa, y en éstos, las especies polares tienen poca
afinidad por la fase estacionaria, siendo eluidos rápidamente. (ver Fig.3)
 Fig 3. Clasificación de métodos Cromatograficos

 Soporte utilizado (columna, papel, etc)

De acuerdo al soporte, se distinguen dos categorías: plana y en columna. En
cromatografía plana, la fase estacionaria puede ser una hoja de papel
(Cromatografía en papel) o una capa de un sólido distribuido uniformemente
sobre una lámina de vidrio, plástico o aluminio (cromatografía de capa fina).
La fase estacionaria puede estar contenida en una columna, en cuyo caso la
técnica se denomina Cromatografía en columna. Cuando la fase estacionaria
es un líquido, éste debe inmovilizarse sobre un soporte sólido inerte, o sobre
la propia columna.

Fig 4. Clasificación de acuerdo al soporte

COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS
Las columnas convencionales usadas en cromatografía líquida y de gases
tienen diámetros relativamente grandes: 2-4 mm en CG y 4-6 mm en HPLC.
Estas columnas contienen la fase estacionaria empacada, consistente en un
sólido o un líquido volátil recubriendo a un soporte sólido inerte.

Fig 5. Columnas empaquetadas

En los últimos años se han desarrollado distintos tipos de columnas capilares

(Columnas tubulares abiertas) utilizadas en CG y CL e incluso en cromatografía
de fluidos supercríticos. Estas columnas son más estrechas y más largas que
las columnas empacadas. En ellas, la fase estacionaria sólida está constituida
por una capa porosa (PLOT) y la fase estacionaria líquida puede estar
recubriendo directamente la pared interna de la columna (WCOT), o sobre un
soporte sólido (SCOT).
 Fig 6. Columnas capilares
Las columnas tubulares abiertas proporcionan mayor resolución, requieren
menor tiempo para el análisis y presentan mayor sensibilidad que las columnas
empacadas, si bien, se maneja una cantidad de muestra considerablemente
menor y no son útiles para separaciones preparativas en las que se trate de
aislar cantidades relativamente grandes de compuesto.

Fig 7. Columnas tubulares abiertas

 MECANISMO DE LAS SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS
La naturaleza de las interacciones entre los componentes de la muestra y la
fase móvil y estacionaria, permite clasificar los sistemas cromatográficos
como:
Cromatografía de adsorción: La fase estacionaria es un sólido adsorbente de
gran área superficial (gel de sílice, alúmina, etc.). Los centros activos situados
sobre la superficie del sólido (grupos silanol de la gel de sílice) interaccionan
con los grupos funcionales polares de los compuestos a separar (fig. 8). La
separación se produce como consecuencia de la distinta intensidad de las
interacciones (enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van Der Waals).

Fig8. grupo silanol

Cuanto menor sea el tamaño de partícula, mayor será el área superficial del
adsorbente y, en consecuencia, mayor el número de centros activos
disponibles para la adsorción.
Cromatografía de reparto: Como fase estacionaria se utiliza un líquido. Para
inmovilizar este líquido se utiliza un soporte sólido (gel de sílice, celulosa, tierra
de diatomeas, poli-estireno, etc.) de gran área superficial. En cromatografía
líquido-líquido, para evitar que se mezclen las fases se utiliza como fases móvil
y estacionaria dos líquidos de polaridades muy diferentes. Si el líquido
estacionario es polar (por ejemplo, etilenglicol), la fase móvil será no polar
(hexano). En este caso, los solutos polares son retenidos más fuertemente que
los no polares. La forma citada es la de operación normal (ver fig 9), si bien
también puede operarse con una fase estacionaria no polar (decano) y con una
fase móvil polar (agua). Esta forma de proceder se denomina de fase inversa
(ver fig 10). En cualquier caso, la separación se produce porque las moléculas
de soluto se distribuyen entre las dos fases según su solubilidad relativa en
cada una de ellas.

Fig 9. Fase normal

 Fig 10. Fases ligadas

En la cromatografía de intercambio iónico, la fase estacionaria es una matriz

rígida, en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva o
negativamente (A) y contra-iones de carga opuesta (M), susceptibles de
intercambiarse con iones de la misma carga contenidos en la fase móvil
Intercambio catiónico:
Matriz-A– M+ + X+ —> Matriz-A–X+ + M+
Intercambio aniónico:
Matriz-A+M– + Y– —> Matriz-A+Y– +M–
La fase móvil suele ser una solución acuosa tamponada y la separación se
produce por la competencia que se establece entre los iones de la fase móvil
y los iones del analito por los centros activos de la resina.
La cromatografía de exclusión también se denomina cromatografía de
filtración en gel o cromatografía de permeación en gel. En ella, la fase
estacionaria consiste en un sólido inerte que contiene pequeños poros en los
que pueden penetrar las moléculas de tamaño reducido, pero no las grandes
El grado de retención depende del tamaño de las moléculas (solvatadas) y del
tamaño de los poros. Las moléculas pequeñas pueden penetrar en los poros
pequeños, mientras que las de tamaño intermedio pueden penetrar solo en
algunos poros, siendo excluidas de los otros, y las moléculas grandes son
excluidas completamente, Estas últimas se desplazan con la fase estacionaria
y son eluidas en primer lugar.

FUNDAMENTOS TEORICOS DE CROMATOGRAFIA

Presentaremos los conceptos en los que se basan las separaciones
cromatográficas y aquellos parámetros que son de utilidad para comprender
y mejorar la calidad de los cromatogramas.

1. Constante de distribución y separaciones.

Los componentes a separar, en su desplazamiento a lo largo del sistema
cromatográfico se mueven a diferentes velocidades, dependiendo de la
afinidad de cada uno por la fase estacionaria, respecto a la fase móvil. Cada
uno de ellos se distribuye entre las dos fases según un equilibrio caracterizado
por una constante denominada constante de distribución o coeficiente de
distribución. Para el componente A,

donde [AS] es la concentración de A en la fase estacionaria, y [AM] la

concentración de A en la fase móvil. Cuanto mayor sea el valor de K, mayor
será la afinidad del componente en cuestión para la fase estacionaria y
menor será la velocidad a la que se mueve a través del sistema. Para una
muestra que contenga los componentes 1, 2 y 3, y que se introduzca como una
banda estrecha sobre una fase estacionaria, si K3 > K2> K1 el componente 3
se desplazará a lo largo del sistema más lentamente que el 2, y éste más
despacio que el 1. En cromatografía de gases o en HPLC, donde normalmente
se utilizan métodos instrumentales como detectores a la salida de la columna
en los que se monitoriza continuamente la composición de la fase móvil, la
señal obtenida es proporcional a la cantidad de soluto presente en el eluyente,
con lo que se obtienen picos más o menos Gaussianos, como los representados
en la figura 11.

Fig 11. Picos Cromatograficos

2. Retención y distribución
El cromatograma simplificado (Fig 12) corresponde a una muestra que
contiene un solo analito (A). El pico pequeño (B), corresponde a una especie
no retenida por la columna y que a menudo está contenida en la muestra, pero
que puede añadirse para facilitar la identificación de los picos. En la misma
figura se muestran algunos datos y símbolos característicos.
 Fig 12.Parametros Característicos del Cromatograma
tM: tiempo muerto (tiempo requerido para que una especie no retenida
alcance el detector)
VM: volumen muerto (volumen de fase móvil que se requiere para eluir una
especie no retenida)
tR: tiempo de retención (tiempo transcurrido desde la introducción de la
muestra hasta que el componente alcanza el detector)
VR: volumen de retención (volumen de fase móvil que se requiere para eluir
un soluto de la columna cromatográfica)
h: altura de pico;
w: anchura de pico;
w 1/2: anchura de pico a la semialtura
w 0, 1: anchura de pico a un décimo de la altura
A mayor o menor retención de los componentes de una muestra por la fase
estacionaria depende de las correspondientes afinidades. Estas, a su vez,
dependen de diversos factores, entre los que cabe mencionar:
* Interacciones electrostáticas entre especies de carga opuesta, como las que
tienen lugar en separaciones por cromatografía iónica.
* Interacciones por fuerzas de van der Waals del tipo dipolo-dipolo
(orientación) o del tipo dipolo-dipolo inducido (inducción)
* Interacciones por fuerzas de dispersión entre moléculas neutras o grupos
funcionales.
* Formación de enlaces de hidrógeno.
El tiempo de retención puede considerarse que está constituido por dos
componentes. Uno de ellos es el ya mencionado tiempo muerto, que es el
mismo para todos los analitos en un sistema cromatográfico determinado, y el
otro es el denominado tiempo de retención ajustado, t'R, que es el tiempo que
realmente se invierte en la retención de un soluto por la fase estacionaria, y
que se define como:

t'R = tR — tM
Las características de retención de los componentes suelen describirse en la
práctica por el factor de retención o factor de capacidad, k', definido como,

El factor de retención puede considerarse como,

El factor de capacidad es un parámetro importante porque es independiente
de la velocidad de flujo de la fase móvil y de las dimensiones de la columna,
y puede usarse para comparar retenciones en instrumentos diferentes. Los
factores de retención grandes favorecen una buena separación, pero
también incrementan el tiempo de elución y el ancho de banda. Idealmente,
las separaciones se realizan en unas condiciones en las que los factores de
capacidad para las especies de una mezcla oscilan entre 1 y 5.

3. Factor de selectividad.
La capacidad de una determinada fase estacionaria para separar dos
componentes A y B se expresa mediante el factor de separación o factor de
selectividad, α, definido por

y, por otra parte, puede determinarse fácilmente de forma directa midiendo

los tiempos de retención de las especies A y B sobre un cromatograma
experimental, ya que,

EFICACIA DE LAS COLUMNAS CROMATOGRAFICAS

Durante el desplazamiento por el interior de una columna, el analito
experimenta miles de transferencias entre las fases móvil y estacionaria. El
tiempo de residencia en una fase dada es muy irregular, pudiendo ser muy
pequeño en algunas etapas, y relativamente grande en otras. El analito solo
eluye cuando reside en la fase móvil; algunas partículas se desplazarán
rápidamente, debido a que permanecen más tiempo en la fase móvil y menos
tiempo en la fase estacionaria. Debido a que los procesos mencionados
transcurren de forma aleatoria, se obtiene una dispersión de los tiempos de
residencia en la columna (o de las velocidades) alrededor de un valor medio,
originándose un pico Gaussiano como el representado en la Fig 13, y en el que
casi un 96 % del área se encuentra dentro del intervalo comprendido entre
más y menos dos veces la desviación estándar alrededor del máximo.

Fig 13. Pico cromatografico

Por otra parte, la anchura de los picos está directamente relacionada con el
tiempo de residencia en la columna (inversamente proporcional a la
velocidad de flujo de la fase móvil), ya que a mayor tiempo, mayor dispersión,
de forma que las especies eluidas al final presentan picos más anchos que las
eluidas al comienzo, como se muestra en la Fig 13. El ensanchamiento de los
picos de los distintos componentes del analito actúa en detrimento de la
separación, de forma que el objetivo en cromatografía es la obtención de
picos estrechos y simétricos. El término " eficacia " de una columna, o mejor,
de un sistema cromatográfico, se utiliza para describir el ensanchamiento de
las bandas de los solutos en su movimiento a través de la columna. El tema de
la eficacia de un sistema cromatográfico se aborda desde dos puntos de vista:
la teoría de platos y la teoría cinética.
Teoría de los platos en Cromatografía
Consideramos que la columna cromatográfica está constituida por discretas
capas estrechas, denominadas platos teóricos. Se considera que en cada plato
se establece un equilibrio del componente entre la fase móvil y la fase
estacionaria, y el desplazamiento del analito a través de la columna se trata
como una transferencia de la fase móvil desde un plato al siguiente. La eficacia
de la columna aumenta al hacerlo el número de estas transferencias, esto es,
al aumentar el número de platos teóricos. El número de platos teóricos, N, se
define como

Donde tR es el tiempo de retención del analito y σ la desviación estándar del

pico Gaussiano. Como, w = 4 σ (Fig 13.)

Expresión que permite obtener N midiendo directamente en el cromatograma.

El número de platos teóricos será directamente proporcional a la longitud de
la columna, de forma que si esta se representa por L, la denominada altura
equivalente a un plato teórico, (H) será:

Teoría cinética
La teoría cinética considera que el ensanchamiento de las bandas (o picos)
cromatográficos se produce como consecuencia de que los distintos procesos
de transferencia de masa durante el desplazamiento de un analitico a lo largo
de la columna ocurren a velocidad finita. Según esta teoría, la forma de los
picos depende de los siguientes factores:
- Difusión por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase móvil.
- Difusión longitudinal del soluto a lo largo de la columna.
- Equilibrio del soluto entre las fases móvil y estacionaria no suficientemente
rápido.
Los tres factores mencionados normalmente se identifican con los parámetros
A, B y C y su contribución al ensanchamiento de las bandas cromatográficas
conducen a la ecuación de van Deemter:

donde u es la velocidad lineal media de la fase móvil

u = L/tM
L = longitud de la columna.
tM = tiempo muerto.

Término A (difusión por turbulencia)

Este primer factor surge de la multitud de trayectorias de distintas longitudes
que toma la fase móvil que fluye a través de la columna, que está empacada
con partículas de diferentes tamaños y formas acomodadas de manera
irregular. Según se observa en la Fig 14, donde se representan las trayectorias
seguidas por dos moléculas durante la elución.
El término A es independiente de la velocidad de la fase móvil, pero es función
del tamaño de las partículas de la fase estacionaria. Partículas pequeñas y
uniformemente empaquetadas conducirán a columnas más eficaces.
 Fig 14. Trayectorias fase móvil

Término B (difusión longitudinal)

El segundo factor que contribuye al ensanchamiento de las bandas es la
difusión longitudinal del soluto en la fase móvil. Se produce debido a que la
concentración de soluto es menor en los bordes de la banda que en el centro,
por lo que una banda de soluto que se mueva a lo largo de la columna (de a
hasta b en la figura 15) se ensanchará cuando las moléculas se difundan hacia
las zonas de menos concentración, hacia adelante y hacia atrás de la banda.

Fig15. Ensanchamiento por difusión longitudinal

 Término C (resistencia a la transferencia de masa)

El término C está relacionado con el hecho de que el equilibrio para la

distribución del soluto entre las fases móvil y estacionaria se establece tan
lentamente que una columna cromatográfica siempre opera en condiciones
lejos del equilibrio. En realidad, el término C puede descomponerse en dos, CS
y CM, según se considere la transferencia de masa en la fase estacionaria y en
la fase móvil. La resistencia a la transferencia de masa en la fase estacionaria
es despreciable para fases sólidas, ya que la transferencia del analito sobre la
superficie de un adsorbente es muy rápida. Sin embargo, para fases
estacionarias líquidas, el término depende del espesor de la película (df) y del
coeficiente de difusión del analito (DS)

En la práctica, las fases estacionarias líquidas poco viscosas presentan un

espesor de película favorable.
En la Figura 16 se representa la variación de los tres términos de la ecuación
de van Deemter en función de la velocidad de la fase móvil. Nótese que la
contribución del término A es independiente de la velocidad, mientras que B/u
aumenta cuando la velocidad disminuye y que Cu predomina a velocidades
elevadas.
 Fig 16. Representacion esquemática de la ecuación de van Deemter

Las curvas de la ecuación de van Deemter son similares para CG y para CL,
presentando, en todos los casos un valor mínimo de H para una determinada
velocidad de la fase móvil (condición óptima). A velocidades inferiores a la
óptima la difusión longitudinal (B) origina un incremento en la altura de plato
y un ensanchamiento de la banda, mientras que a velocidades superiores, la
resistencia a la transferencia de masa (equilibrio lento) entre fases provoca
que el soluto se extienda.
A partir de la ecuación de van Deemter pueden deducirse las condiciones
experimentales que minimicen el valor de H. Así, el valor de H disminuye con
el tamaño de partícula (dp) y con un empaquetamiento uniforme (λ), así como
operando con capas finas de fase estacionaria líquida (df2) de baja viscosidad
y a temperatura elevada (para incrementar DS).
En la práctica, los datos para el gráfico de la ecuación de van Deemter suelen
determinarse experimentalmente usando valores de tiempos de retención,
tiempo muerto y anchuras de pico, con objeto de obtener N y por tanto, H a
distintas velocidades de fases móviles. En cualquier caso, normalmente suele
operarse a velocidades superiores a la óptima, con objeto de reducir el tiempo
necesario para la separación.
 Factores extra-columna sobre el ensanchamiento de las bandas
cromatográficas
Además de los factores ya considerados que contribuyen al ensanchamiento
de los picos y que se producen en la propia columna cromatográfica, es
necesario mencionar algunos que ocurren en otras zonas del sistema distintas
de las fase estacionaria. Entre ellos, pueden considerarse los siguientes:
* Introducción de la muestra. Teóricamente suele considerarse que la muestra
se introduce en el sistema cromatográfico de forma que ocupa una capa de
espesor infinitamente pequeño. Sin embargo, en la realidad, la muestra ocupa
un volumen finito, y a veces relativamente grande, tal como sucede en CG,
donde un micro-litro de una sustancia líquida inyectada puede ocupar un
volumen del orden de 0.5 mL cuando se vaporiza a 250 º, y ello representa
varios centímetros de longitud de columna. Además, la lenta velocidad de
vaporización contribuye también al ensanchamiento de la banda. En
cromatografía líquida suelen emplearse bucles conteniendo un determinado
volumen de muestra a temperatura ambiente. En estas ocasiones, la
relativamente lenta eliminación de trazas de la muestra de las paredes de la
válvula es el factor que puede contribuir al ensanchamiento de la zona.
* Volúmenes muertos en el sistema de inyección, detector y tubos de
conexión. Por volumen muerto se considera el existente entre el punto de
inyección de la muestra y el punto de detección, excepto el volumen ocupado
por la fase estacionaria, de forma que cualquier zona del sistema en la que
estén presentes el soluto y la fase móvil, pero no expuesta a la fase
estacionaria contribuye a la difusión del soluto y, en consecuencia, al
ensanchamiento de las bandas cromatográficas. Para minimizar el
ensanchamiento de las bandas cromatográficas por factores extra-columna,
deben minimizarse todos los espacios muertos y las dimensiones de los tubos;
la muestra deberá aplicarse en una zona muy estrecha.
RESOLUCION Y SU OPTIMIZACION
La separación de solutos por un sistema cromatográfico puede expresarse por
el factor de selectividad, α,
Sin embargo, α describe la separación entre los centros de las bandas
cromatográficas, pero no tiene en cuenta las anchuras de pico, ya que puede
ocurrir que el factor de selectividad entre dos picos de dos cromatogramas
diferentes sean iguales, y, sin embargo, la resolución sea bastante diferente,
como puede apreciarse en la figura 17

Fig.17. selectividad y resolución

Por lo anteriormente mencionado, resulta más adecuado obtener la

resolución a partir de la expresión (para picos Gaussianos)
 Fig18. Medidas para obtener la resolución

Si R=1.5, los dos picos solo se superponen un 0.3 %, mientras que si R=1, la
superposición es del orden del 2 %, que puede considerarse adecuada para
muchos análisis. La ecuación anterior resulta adecuada para obtener el valor
de R, pero no proporciona información acerca de las propiedades cinéticas o
termodinámicas de la columna, lo cual es importante en orden a optimizar R.
Por ello, una ecuación alternativa para la resolución es la siguiente:

donde k' es el valor medio de k'A y k'B. Esta expresión indica que la resolución
depende de la eficacia global de la columna (N), de la capacidad de la fase
estacionaria para retener a los componentes (α) y de las características de
retención de cada componente (k). Según la ecuación anterior, la resolución
es una función de la raíz cuadrada de N, por lo que para aumentar
significativamente el valor de R es necesario aumentar mucho el de N. Esto
puede hacerse incrementando la longitud de la columna, si bien esto puede
llevar a un tiempo demasiado grande. Por ello, normalmente suele ser
preferible optimizar k y α. Una forma relativamente sencilla de mejorar la
resolución es optimizando k', lo cual puede hacerse aumentando la
temperatura (sobre todo en CG) o cambiando la composición de la fase móvil
(en HPLC). En cuanto al factor de selectividad, éste puede modificarse
variando la composición de las fases móvil y estacionaria, así como la
temperatura o recurriendo a factores químicos especiales como puede ser
incorporar a la fase estacionaria algún agente complejante particular. En
estos casos suele recurrirse a cambiar las condiciones mientras se realiza la
separación, para lo cual, puede utilizarse la elución con gradiente (variación
gradual de la composición de la fase móvil durante la elución) o la
programación de la temperatura (variación de la temperatura durante la
elución).

LA CROMATOGRAFIA Y EL ANALISIS QUIMICO

La cromatografía es el método más importante para la separación de especies.
Las aplicaciones cuantitativas de la cromatografía en columna se basan en la
comparación de la altura o del área del pico del analito con los
correspondientes a los patrones. El empleo de las alturas de pico tiene la
ventaja de su fácil medida, pero presenta el inconveniente de que debe
controlarse rigurosamente la temperatura de la columna, el caudal de
eluyente y la velocidad de inyección de la muestra, ya que estas variables
alteran las anchuras de pico, y éstas están inversamente relacionadas con las
correspondientes alturas. Sin embargo, el área de pico es independiente de los
efectos debidos a las variables anteriormente mencionadas, por lo que es el
parámetro que normalmente se utiliza. Su medida se lleva a cabo con facilidad,
ya que casi todos los cromatógrafos modernos están provistos de integradores
electrónicos digitales. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la respuesta
del detector varía de un compuesto a otro.. Por ello, a menudo se utilizan los
denominados factores de respuesta, obtenidos de la relación entre el área de
un componente y el área de otro componente elegido como referencia. Los
métodos de cuantificación que principalmente se utilizan en cromatografía
son las rectas de calibrado obtenidas a partir de series de patrones, el método
del patrón interno, el de normalización de áreas y el de adición estándar. La
obtención de rectas de calibrado se lleva a cabo preparando una serie de
disoluciones patrón de composición parecida a la de la muestra, obteniendo
los correspondientes cromatogramas y representando las áreas de pico (o las
alturas) en función de la concentración. En este método, la fuente más
importante de error es la incertidumbre en el volumen de la muestra, sobre
todo cuando se utilizan microjeringas. Estos errores pueden reducirse
considerablemente con el empleo de válvulas rotatorias.

En el método del patrón interno se añade a los patrones y a la muestra una

cantidad exactamente medida de un componente puro, ausente en la
muestra, utilizándose como parámetro analítico la relación de áreas de pico
del analito y del patrón interno. Para aplicar este método en cromatografía,
es necesario que el pico del patrón interno esté bien aislado de los picos de los
demás componentes de la muestra, pero deberá estar cerca del pico del
analito.
El método de normalización de las áreas consiste en eluir todos los
componentes de la muestra, determinar las áreas de todos los picos eluidos y
obtener las correspondientes áreas de pico corregidas (mediante los factores
de respuesta del detector). La concentración del analito se obtiene de la
relación entre su área y el área total de los picos de todos los componentes de
la muestra. Para el componente x,

Finalmente, por lo que se refiere al método de adición estándar, su uso en

cromatografía está bastante limitado, debido, sobre todo, a la dificultad de
inyectar de forma precisa cantidades exactamente conocidas de la muestra