Práctica 11 Inmunodetección en estado sólido

Objetivos

General

 Conocer y realizar la técnica de western blot para la detección de proteínas mediante

la reacción antígeno-anticuerpo.

Específicos

 Conocer la metodología básica para realizar electroforesis en gel de poliacrilamida.

 Conocer la metodología básica para realizar una electro transferencia.
 Conocer la metodología básica para detectar proteínas por medio de un Inmuno-
ensayo.

Introducción

El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas
específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un
extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al
criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas
posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana
adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de
interés con anticuerpos específicos contra ella. [1]

Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la biología
molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existe toda una industria
especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de
miles de proteínas diferentes. [2]

Práctica 12 Inmuno ensayo ligado a enzimas ELISA

Objetivos

General

 Conocer y realizar la técnica de ELISA para detección de antígeno o anticuerpo.

Específicos

 Conocer la metodología básica para adsorber antígenos en microplacas de ELISA.

 Ligar antígenos o anticuerpos conjugados a antígenos adsorbidos en placas de
ELISA.
 Determinar la presencia del antígeno deseado por la reacción de una enzima
conjugada a anticuerpo.
Introducción

El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma
que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al
estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un
substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
 Protocolo de extracción de proteínas

Tomar de 50-100 mg de carne. Agregar 600 𝜇𝑙 de crisol y tres

Mezclar con vortex y pipeteo
Muestra tomada 0.06 gramos. perlas de vidrio.

Transferir a tubo nuevo el

Centrifugar a 12000 RPM 5 Transferir a un nuevo tubo 600
sobrenadante e incubar 5
minutos. 𝜇𝑙 de muestra.
minutos.

Adicionar 200 𝜇𝑙 de cloroformo Centrifugar por 15 minutos a (En frio) desechar la fase acuosa
e incubar cinco minutos. 12000 RPM. y conservar la fase orgánica.

Centrifugar a 5000 RPM por 5 Adicionar 500 𝜇𝑙 de etanol al

Incubar por cinco minutos.
minutos. 100 % y mezclar por inversión.

Tomar el sobrenadante y Adicionar 750 𝜇𝑙 de isopropanol Centrifugar a 12000 RPM por 10

transferir a otro tubo. e incubar 10 minutos. minutos.

Agregar 1 ml de Hidrocloruro de
Descartar el sobrenadante,
Conservar a 4ºC Guanidina 0.3M en 95% de
conservar la pastilla.
etanol.

Separación de proteínas.

Proceso de purificación.
Resuspender en buffer de lisis Colocar 30 𝜇𝑙 de muestra en
Centrifugar 10 minutos a
(50𝜇𝑙) azul
máximas revoluciones.

Western Blot
Una vez finalizada transferir a Colocar en pozos de gel de
Hervir por 5 minutos
membrana PVDF. bisacrilamida al 7%
Cortar la membrana por Hacer dos lavados rápidos con Bloquear membrana con 10 ml
carriles. PBS-Twin 0.1% PBS-T leche 5% 30minutos

Añadir Ac. MO𝛼Actina y dejar 2 lavados rápidos y un lavado de

2 lavados rápidos
30 minutos en agitación. 5 minutos.

Añadir 5 ml PBS-T Goat𝛼MoHRP Hacer un Lavado rápido y

y dejar 30 minutos en agitación. después el revelado enzimático.

10 𝜇𝑙 de muestra Blanco
Cuantificación de proteínas
200 𝜇𝑙 de Bradford 200 𝜇𝑙 de Bradford
por Bradford
790 𝜇𝑙 de Agua. 800 𝜇𝑙 de agua

Leer a 580 nm

Usando una tira de microplaca,

Los positivos tendrán 50𝜇𝑙 de
ELISA tendremos cuatro pozos, dos
extracto de proteína en PBS
serán positivos y dos negativos.

Tres lavados rápidos del Dejar reposar 10 min para que

Los negativos tendrán 50 𝜇𝑙 de
sobrante con PBS-Twin 20 al las proteínas se adhieran a la
PBS
0.05% superficie del pozo.

Añadir 50 𝜇𝑙 del anticuerpo Anticuerpo secundario.

primario. En concentración de Hacer lavados rápidos 𝐺𝑜𝑎𝑡𝛼𝑀𝑜 𝐻𝑅𝑃 en proporción
1:100 Mo-𝛼-Actina 𝑒𝑛𝛾𝐵𝐶𝑆 − 1:100 con PBS-T 10 minutos
𝑇 dejar 10 min

Usar Diaminobenzidin +
Hacer lavados rápidos previos al
Peróxido de Hidrogeno. Y dejar
revelado.
15 minutos la reacción.
RESULTADOS PARA LA PRUEBA DE BRADFORD.

Fig 1.1: Lectura de longitud de onda a

580 nm en el espectrofotómetro-
Determinación de la concentración de
proteínas en la muestra del equipo 7.

RESULTADOS PARA LA PRUEBA DE WESTERN BLOT.

Fig 1.2: Corrida en gel de poliacrilamida
de la muestra de proteínas.

Fig 1.3: Membrana de PVDF en rojo de

Ponceau, es posible observar el
marcador de peso molecular en el
primer carril.

Fig 1.4: Banda correspondiente al

equipo 7 de PVDF después de haber
lavados y el procedimiento de Western
Blot.
 Fig 1.5: Gel de poliacrilamida al 7%
después de realizar el proceso de
electrotransferencia, se pueden
observar pequeñas zonas teñidas que
indican la presencia de proteínas,
desde el inicio teníamos una gran
cantidad

Fig 1.6: Gel de poliacrilamida con

proteínas, a este gel no se le hizo
transferencia, solo se tiñó con azul de
Coomassie. Es el control para observar
que si hubo presencia de la muestra en
el gel.

RESULTADOS PARA LA PRUEBA DE ELISA.

Fig 1.7: Positivos y negativos aplicables

para la prueba ELISA.
DISCUSIÓN.
Como parte del análisis de biomoléculas en el laboratorio dedicamos especial atención a
las proteínas obtenidas de un trozo de carne, las proteínas son moléculas complejas
imprescindibles para la estructura y función de las células, se originan a partir de la unión
de otras moléculas (aminoácidos) agrupadas en cadenas largas y cuya estabilidad se
mantiene por enlaces peptídicos.

De las proteínas que se expresan a partir del genoma de un organismo de conforma un

proteoma mismo que es estudiado por la proteómica, una rama en esencia que dedica su
estudio a la identificación de las proteínas, su estructura primaria, sus modificaciones
postraduccionales, localización y la cuantificación de la expresión proteica. Sabemos que
el genoma humano se conforma por alrededor de 25 000 genes, aunque sólo se conoce la
función de 8 000. Sin embargo, el número de proteínas expresadas en los humanos va de
50 000 a 500 000. Esto se debe a que los genes no expresan necesariamente una sola
proteína; se sabe que por procesamiento alternativo del ARNm (maduración y empalme
alternativo) se pueden generan diversas proteínas a partir de un solo gen. Es importante
hablar de esto porque en investigaciones referentes a la salud permiten el mejor
entendimiento de la fisiología humana. El análisis del proteoma es una herramienta para la
caracterización de procesos patológicos y para la identificación de biomarcadores
(sustancias que indican un estado biológico) que permitan diagnosticar y tratar
enfermedades antes de que aparezcan los síntomas, aspecto clave en el cáncer. Además,
también serían útiles para monitorizar la respuesta del paciente durante el tratamiento.

Experimentalmente para la detección de proteínas realizamos la técnica analítica Western

Blot, para cuantificar empleamos la prueba de ELISA y para determinar la concentración
proteica empleamos la técnica Bradford.

Western Blot es una técnica que permite identificar una proteína en una muestra, para ello
tras preparar la muestra por medio de una electroforesis en gel de poliacrilamida las
proteínas se separan en función de su peso molecular pues pierden su estructura
secundaria y terciaria, para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos
se transfieren esas proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa o PVDF, esta
membrana se caracteriza por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica (es
decir, se adhieren a todas las proteínas con idéntica afinidad). Puesto que la membrana
escogida necesita poder unirse proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los
lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia para ello se incuba la
membrana con una solución de proteínas, típicamente de albúmina de suero bovino o ASB;
leche en polvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente, como Tween 20. Las
proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no
estén ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá
unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos. En
la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína. Para
ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su
sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color). De esta forma, se hace patente
la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.

Es importante que al separar en gel consideremos el porcentaje: La concentración de

acrilamida (% T) representa el porcentaje en peso del monómero total empleado (acrilamida
+ entrecruzador en gramos por 100 mL) y determina la longitud promedio de la cadena del
polímero. La concentración de bis-acrilamida (% C) representa el porcentaje de
este monómero en el gel y determina el grado de entrecruzamiento. La estructura del gel
comienza a ser evidente a 4 % T; 0,2-5 % C. Los factores que gobiernan la talla del poro
del gel son complicados, pero en general el tamaño del poro disminuye con el incremento
del % T. Las proporciones en que ambas se encuentran determinan las propiedades físicas
del gel como su densidad, elasticidad, resistencia mecánica y el tamaño del poro. En
general se recomiendan valores de T de 5 a 15 % y de C de 2 a 4 % para separar moléculas
por tamaño, es necesario tomar en cuenta la relación entre el poro efectivo del medio y el
tamaño de la molécula que se pretende separar. Si el poro del medio es significativamente
mayor que la molécula, la separación electroforética será sobre la base de diferencias de
carga y el tamizaje molecular será mínimo.

Hemos mencionado que para bloquear empleamos un anticuerpo (inmunoglobulina capaz

de una combinación específica con el antígeno que ha causado su producción en un animal
susceptible) el anticuerpo mouse alfa actina este fue empleado como tipo primario entonces
permitió que ciertas proteínas se adhirieran a una biomolécula de interés, son de tipo
monoclonal o policlonal pero en el caso de este anticuerpo es monoclonal empleando entres
las especies candidatas al ratón, funciona como una copia única del linfocito B del ratón y
se dirige solo contra un epítopo de un antígeno (Es una sustancia que desencadena la
formación de anticuerpos y puede causar una respuesta inmunitaria).

Y como anticuerpo secundario empleamos el anticuerpo cabra alfa ratón HRP. Este anti-
ratón IgG HRP de cabra es usado como anticuerpo secundario para Western Blot o ELISA
donde el anticuerpo primario fue generado en ratón. La peroxidasa conjugada en el
anticuerpo secundario es útil para Western Blot cuando se emplea detección por sustratos
quimioluminiscentes disponibles comercialmente. Este anticuerpo permite la asociación
entre el anticuerpo primario del ratón luego de que su región V se una al antígeno y el
anticuerpo secundario se asocia al vástago de la región C del anticuerpo primario.

El revelado enzimático ocurre por el anexo de un sustrato compuesto de peróxido de

hidrogeno y diaminobenzidin que resulta muy sensible a la luz pero después de mantenerse
en contacto con la membrana y el anticuerpo permite apreciar un fluoroforo lo que hace que
aparezcan bandas coloreadas sobre la membrana en el lugar donde estaba la proteína de
interés.

Esta técnica es aplicable en investigación como deducción de la biología molecular y así

mismo como respaldo en el diagnóstico de enfermedades, suele ser la confirmación de una
prueba ELISA para evitar un falso positivo, es la prueba definitiva en la detección de la
“enfermedad de las vacas locas”, a veces es empleada en el diagnóstico de Lyme y para
confirmar la presencia de FIV en gatos.
Por su parte la prueba ELISA resulta menos complicada que la anterior requirió por igual el
manejo de ambos anticuerpos más extracto de proteína en PBS (solución isotónica que
evita la modificación celular e inmoviliza) ubicado en pozitos de carácter positivo y negativo.
Permite la cuantificación de una proteína en una mezcla de anticuerpo-antígeno

Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos:

Competitivo: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado
por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una
muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado
ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

No competitivo: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en

la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionara con el respectivo sustrato desarrollando color.

Para finalizar la prueba y detectar hay también dos formas de hacerlo:

Se pueden utilizar marcadores radiactivos, fluorescentes o enzimas a las cuales se les

agrega un sustrato. La enzima convierte el sustrato en un producto detectable. Si un ELISA
se ha construido y desarrollado correctamente, entonces la intensidad de la señal que se
produce cuando el sustrato se añade es directamente proporcional a la cantidad de
antígeno capturado en la placa. Los tipos de enzima y sustrato que se utilizan son los
mismos que los del Western Blot.

Directa: el método de detección directa utiliza un anticuerpo, marcado primario que

reacciona directamente con el antígeno. La detección directa de un antígeno marcado se
utiliza con frecuencia para detectar drogas o en la orina en las pruebas de embarazo para
realizar en el hogar.

Indirecto: el método de detección indirecta utiliza un anticuerpo secundario marcado para

la detección y es el formato más popular para ELISA. El anticuerpo secundario tiene una
especificidad para el anticuerpo primario. En un ELISA, es fundamental que el anticuerpo
secundario sea específico para la detección de anticuerpo primarios (y no por los
anticuerpos de captura) o el ensayo no será específico para el antígeno. La detección
indirecta de anticuerpos en una muestra de sangre se utiliza para el diagnóstico de VIH.

Observamos que en aspectos; cuantitativo, sensibilidad, menor tiempo, rendimiento, tipos

de muestra que permite examinar, y consistencia la prueba ELISA tiene una mayor
eficiencia que una prueba Western Blot.

Anexos
 Marcador de referencia para interpretar
los resultados de la membrana por
identificación de peso molecular en
proteínas.

Referencias

[1] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. (1979). « Electrophoretic transfer of proteins from

polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.
(http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=411572)».Pro
cNatlAcadSciUSA.6(9): pp.4350–4354.doi:10.1073/pnas.76.9.4350
(http://dx.doi.org/10.1073/pnas.76.9.4350).PMID388439(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm
ed/388439).

[2] Antibody Central. . Consultado el 18 de agosto de 2010. «Total number of antibodies in

database: 231279».

[3] Cultek. (2006). Fundamentos y tipos de ELISA. diciembre 9, 2017, de Cultek Sitio web:
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf