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PRACTICA # 3

TINCIONES DIFERENCIAL DE GRAM Y TINCIONES SELECTIVAS

La tinción propuesta por el médico Danés Christian Gram en 1984, es una de las tinciones
diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de 24
horas en Gram positivas y Gram negativas. El fundamento radica en la diferente estructura
de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de
peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de
peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacárida externa. (ver figura N° 1).

Gram + Gram -

Peptidoglicano Peptidoglicano

Membrana plasmática Membrana plasmática
Espacio periplásmico
Lipopolisácarido y
proteína

Figura N° 1. Composición de la pared celular

Tras la tinción con el colorante primario (cristal violeta), se tiñe por igual a todas las
bacterias; pero la combinación con el colorante es más permanente en los Gram positivos.

Para establecer la diferencia entre estos dos grupos (ver figura Nº 2), se aplica un disolvente
del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen
firmemente; pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo
tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy difícil su observación
por lo que es preciso tratarlos con otro colorante, como la safranina. Este colorante no
modifica el color de los microorganismos que habían retenido el color primario; pero tiñe a
los microorganismos decolorados.

Figura Nº 2. Diferencia entre Gram negativas y Gram positivas

MATERIALES Probeta de 100 mL Beacker de 100 mL Mecheros bunsen Microscopio compuesto Portaobjetos Cristal violeta Safranina . que aparecen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un fondo oscuro. La capsula también llamada: Glicocálix es una estructura externa a la célula. Otras tinciones que permiten mayor información son la negativa y la selectiva.Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la composición química y estructuras de las paredes celulares (capa de peptidoglicano). La tinción negativa facilita las observaciones de la morfología y tamaño de las bacterias sin alteración por efecto del calor así. Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas y Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram. Además. formada de polisacáridos o polipéptidos. como de estructuras especiales. como la capsula de algunas especies bacterianas. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium. La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o nigrosina. Comprender la importancia de las tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias. bacterias en las que su presencia. permite observar en el microscopio estructuras especiales como las capsulas. . OBJETIVOS . que facilitan la retención o eliminación del colorante después del proceso de decoloración. forma y localización son de importante criterio para su clasificación taxonómica. que confiere de protección a las bacterias contra la desecación y fagocitosis. su detección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés. debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos patógenos de gran toxicidad.

Lugol Alcohol-acetona Tinta china Fenol o metanol al 95% Aceite de inmersión PROCEDIMIENTO . Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. 2. . en condiciones asépticas.Fijación de las bacterias al portaobjetos 4. tomar. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjeto. Fijar la preparación con calor. . Esta operación se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis. aunque carecen de contraste. 2. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias. pues las células pueden deformarse o romperse. Cubrir el frotis con cristal violeta por un minuto.Realización del frotis 1. 3. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases. Colocar una pequeña gota de solución salina en el centro de un portaobjetos limpio. . una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de solución salina. Esperar a que el metanol se evapore completamente. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido. Flamear el asa de siembra. las preparaciones pueden ser observadas al microscopio. pero sin que vaya dirigido directamente sobre él. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.Tinción del frotis bacteriano (Tinción de Gram) Método convencional 1. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. que se toma con el asa de siembra. 5. directamente sobre el portaobjetos. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana. 3. Con metanol: Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca. Esperar hasta que la suspensión se seque o se evapore.

10. PROCEDIMIENTO: El docente proporcionará a los alumnos cultivos sólidos de: Escherichia coli. Cubrir con safranina por 30 segundos. Dejar secar a temperatura ambiente. Cubrir el frotis con lugol por 60 segundos. Pseudomonas aeruginosa. 7. Cubrir el frotis con lugol por 60 segundos. pero sin que vaya dirigido directamente sobre él. Cubrir con safranina por 60 segundos. 11. 4. Enterococcus faecalis. en este caso utilizar el aceite de inmersión (100X). 8. 8. Lavar la preparación. 2. en este caso utilizar el aceite de inmersión. En ningún caso se debe frotar el portaobjeto. Lavar la preparación. Método recomendado por la Sociedad Americana de Microbiología (ASM). Lavar con agua de chorro y escurrir. pues podría arrastrar parte del frotis consigo. 7. 5. Dejar secar a temperatura ambiente. Eliminar la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. El estudiante preparará los frotis de cada cultivo solido. Cubrir con alcohol-acetona.Preparación del frotis. Cubrir con alcohol-acetona. 1. Lavar con agua de chorro y escurrir. para realizar la Tinción de Gram. Staphylococcus aureus. 9. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. . 4. (Figura N° 2) . 6. 5. pues podría arrastrar parte del frotis consigo. 11. 6. (100X). Cubrir el frotis con cristal violeta por 30 segundos. hasta que se vea que sale el color pálido. Esta operación se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis. Lavar la preparación como se menciono en el paso 2. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. 9. 3. Eliminar la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. 10. Fijar la preparación con metanol. No sobre decolorar. No sobre decolorar. Lavar la preparación como se menciono en el paso 2. En ningún caso se debe frotar el portaobjeto. hasta que se vea que sale el color pálido.

5. colocando otro portaobjetos perpendicular en ángulo de 45° sobre la muestra. hacer una suspensión del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china. b) Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos. 3. Acercar la placa al mechero para tomar cuidadosamente una colonia y colocarla en la gota de solución salina del portaobjeto. 1. 6. Figura 2. Dejar secar a temperatura ambiente. . Si se trata de un cultivo solido. Preparación del frotis . c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de mezcla. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. d) dejar secar al aire libre. (Leer teoría arriba descrita) . colocar junto una gota del cultivo liquido de Klebsiella sp. .Tinción negativa para observación de capsulas a) Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos. Colocar una gota de solución salina en un portaobjetos. Preparar el frotis con los reactivos de Gram. Grupo 1: Realizará la tinción de Gram con el método convencional. (previamente limpio con alcohol. hasta que se ponga al rojo vivo. (Figura N°3). 4. (Leer teoría arriba descrita). Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero. extenderla de forma circular. Grupo 2: Realizará la tinción de Gram con el método recomendado por ASM.acetona). 2.

2. Figura N° 3. Colocar el portaobjeto en la platina y enfocar al microscopio. . Escriba y dibuje lo que ha observado. Al finalizar las observaciones. se le coloca una gota de aceite de inmersión al cubreobjeto (encima de la preparación).Observación al microscopio: 1. Técnica de Tinción Negativa . Escherichia coli Forma . desde el primer objetivo hasta el objetivo 100X.Resultados: 1. Limpiar los objetivos y el ocular del microscopio. limpiar cuidadosamente el objetivo con el algodón para eliminar el exceso de aceite. Reportar las observaciones del frotis (morfología. No olvidar que al enfocar con este objetivo. color). 3.

Clasificación Staphylococcus aureus Forma Clasificación Pseudomonas aeruginosa Forma Clasificación Enterococcus faecalis Forma Clasificación .

2. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros ejemplos de tinción diferencial. ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes de en la tinción de Gram? 3. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica ¿Qué tipo de información se obtiene? .CUESTIONARIO 1. Explique qué reacción de Gram darán los cultivos de levaduras?¿estos resultados tendrán la misma importancia que para las bacterias? 4.