DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERIA AGROPECUARIA - IASA I

Evaluación in vitro de Novak y Score sobre Botrytis cinérea causante de

Botrytis en Rosa hibrida

AUTORES:
Jaime Cedeño (Proyecto A – Microbiología A)

Mayra Marcalla (Microbiología A)

Octubre – Enero 2017

I Índice
II Antecedentes ............................................................................................................... 3
2.1 Justificación ........................................................................................................... 3
2.2 Planteamiento del Problema ................................................................................ 4
2.2.1 El Problema .................................................................................................... 4
III Revisión de Literatura .............................................................................................. 5
3.1 Generalidades ........................................................................................................ 5
3.1.1 Rosa hibrida .................................................................................................... 5
IV Objetivos .................................................................................................................. 10
4.1 General ................................................................................................................. 10
4.2 Específicos............................................................................................................ 10
V Hipótesis .................................................................................................................... 10
VI Materiales y Métodos .............................................................................................. 11
6.1 Materiales ............................................................................................................ 11
6.1.1 Fase de laboratorio ................................................................................. 11
6.1.2 Fase de Campo ........................................................................................ 11
6.1.3 Reactivos .................................................................................................. 11
6.2 Métodos ................................................................................................................ 11
6.2.1 Recolección de la muestra............................................................................ 11
6.2.2 Preparación del medio de cultivo ................................................................ 12
6.2.3 Siembra de Botrytis cinérea .................................................................... 12
6.2.3 Purificación del cultivo de Botrytis cinérea .......................................... 12
6.2.5 Caracterización de Botrytis cinérea ............................................................ 13
6.2.6 Inoculación de Botrytis cinérea en Novak y Score .............................. 13
Bibliografía .................................................................................................................... 13
II Antecedentes
2.1 Justificación
Las flores ecuatorianas son consideradas como las mejores del mundo por su calidad y
belleza inigualables. La situación geográfica del país permite contar con micro climas y
una luminosidad que proporciona características únicas a las flores como son: tallos
gruesos, largos y totalmente verticales, bayas grandes y colores sumamente vivos y el
mayor número de días de vida en florero (Wright, 2007).
La variedad de climas en el país así como su situación geográfica, han hecho del Ecuador
un sitio privilegiado para el cultivo de flores que desde hace 10 años ha cobrado
importancia económica en el país. La exportación de flores a otros países como Canadá,
Alemania, Holanda, Italia, Rusia y Estados Unidos es la principal razón de gran
crecimiento de este mercado. (Agrytec, 2010).

Sin embargo, debido a la presencia del hongo Botrytis cinerea en las plantaciones de rosa,
existen grandes pérdidas en los cultivos y por lo tanto pérdidas económicas, razón por la
cual existe la necesidad de crear estrategias eficaces para el control del hongo. Dada la
problemática de ciertos agentes patógenos como la podredumbre gris causada por
Botrytis cinérea, que se encontró en flores de los invernaderos del IASA I, se planteó un
estudio comparativo entre dos fungicidas y así establecer un control químico eficaz para
este hongo. El objetivo del presente trabajo es evaluar el efecto de los fungicidas, Novak
(Thiofanato metil) y Score en el tratamiento de la botrytis en rosas. (Agrytec, 2010).
2.2 Planteamiento del Problema
Los problemas a combatir en el cultivo intensivo de la rosa son las enfermedades
fungosas, en especial post cosecha; como es el “moho gris” o “botrytis” causado por
Botrytis cinerea.

La botrytis quizá sea la enfermedad más común y más ampliamente distribuida de las
plantas cultivadas en los invernaderos. Esta enfermedad aparece principalmente en forma
de tizones de inflorescencias, también como pudriciones del tallo, ahogamiento de las
plántulas, manchas foliares y como pudriciones de las raíces. Bajo condiciones húmedas
el hongo produce una capa fructífera conspicua de moho gris sobre los tejidos afectados.
En este momento, es uno de los problemas más graves de los cultivos protegidos y al aire
libre del litoral mediterráneo (López, 2012).

Botrytis cinerea precisa de bases nutritivas formadas por hojas senescentes, flores no
fecundadas, heridas o muñones de hojas resultantes de las podas, es decir materia orgánica
muerta, para poder iniciar la invasión de las partes vivas de la planta (Infoagro systems,
2006).

2.2.1 El Problema
El problema de la botrytis es afectar a las empresas florícolas y a los pequeños productores
alrededor de todo el país desde hace ya muchos años, sin embargo, el control
de Botrytis en los terrenos de cultivo mediante aspersiones químicas aún no ha tenido el
éxito deseado, especialmente en los climas húmedos y fríos. Para el control de la
enfermedad, se recomiendan las aspersiones o espolvoreaciones con captán, Novak
(Thiofanato metil), Score, entre otros fungicidas que son los que muestran mayor grado
de efectividad al momento de contrarrestar el hongo. (López, 2012)

Las consecuencias del uso irracional de agroquímicos se evidencian en la salud de los

seres humanos a través de la contaminación, generando como consecuencia la pérdida de
trabajo y considerables costos para el tratamiento de la salud, así como reduce
sustancialmente la calidad de vida (Alvarado & Higuera, 2013).
III Revisión de Literatura
3.1 Generalidades
3.1.1 Rosa hibrida
3.1.1.1 Origen
La rosa era considerada como símbolo de belleza por babilonios, sirios, egipcios, romanos
y griegos. Aproximadamente 200 especies botánicas de rosas son nativas del hemisferio
norte, aunque no se conoce la cantidad real debido a la existencia de poblaciones híbridas
en estado silvestre.

Las primeras rosas cultivadas eran de floración estival, hasta que posteriores trabajos de
selección y mejora realizados en oriente sobre algunas especies, fundamentalmente Rosa
gigantea y R. chinensis dieron como resultado la primera "rosa hibrida de té”, también
conocida como 'La France', de carácter refloreciente. Esta rosa fue introducida en
occidente en el año 1793 sirviendo de base a numerosos híbridos creados desde esta fecha
(Infoagro, 2007).

3.1.1.2 Taxonomía y Morfología

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida
Super orden Rosanae
Orden Rosales
Familia Rosaceae
Sub-familia Rosoideae
Tribu Roseae
Género Rosa
Especie R. 'La France'
Tabla 1. Taxonomía y Morfología de Rosa hibrida
(Wikipedia, 2016).

Los rosales son arbustos o trepadoras (a veces colgantes) generalmente espinosos, que
alcanzan entre 2 a 5 metros de alto, en ocasiones llegan a los 20 m trepando sobre otras
plantas. Tienen tallos semi-leñosos, casi siempre erectos (a veces rastreros), algunos de
textura rugosa y escamosa, con notables formaciones epidérmicas de variadas formas,
persistentes y bien desarrolladas (Quinche, 2009). Las hojas pueden ser perennes o
caducas, pecioladas e imparipinadas con entre 5 a 9 foliolos de borde aserrado y estípulas
basales. Las flores, que surgen en inflorescencias racimosas, formando corimbos, son
generalmente aromáticas, completas y hermafroditas; regulares, con simetría radial
(actinomorfas). (Becerra, 2010)
 El perianto está bien desarrollado. El cáliz es dialisépalo, de 5 piezas de color verde. Los
sépalos pueden ser simples, o a veces de forma compleja con lobulaciones laterales
estilizadas. Corola dialipétala, simétrica, formada de 5 pétalos regulares (o múltiplos de
5), a veces escotados, y de variados colores llamativos, también blancos. El androceo está
compuesto por numerosos estambres dispuestos en espiral (varios verticilos),
generalmente en número múltiplo de los pétalos es 5. El gineceo apocárpico (compuesto
por varios pistilos separados). Nectario presente, que atrae insectos para favorecer la
polinización, predominantemente entomófila. Perigina (ovario medio), numerosos
carpelos uniovulados (un primordio seminal por cada carpelo), así cada carpelo produce
un aquenio. (López, 2012)
El fruto de la flor es el escaramujo, un tipo de infrutescencia denominada cinorrodón.
Está compuesto por múltiples frutos secos pequeños (poliaquenio) separados y encerrados
en un receptáculo carnoso (hipantio) y de color rojizo vistoso cuando está maduro
(Wikipedia, 2014).

3.1.1.3 Multiplicación
La propagación se puede llevar a cabo por semillas, estacas, injertos de vareta e injertos
de yema, aunque es este último el método más empleado a nivel comercial. La
reproducción por semillas está limitada a la obtención de nuevos cultivares. El injerto de
vareta o injerto inglés, rara vez se utiliza para la producción comercial de flor de corte,
ya que también requiere demasiado tiempo. (Infoagro, 2007)

En Holanda se emplea una técnica alternativa conocida como "stenting", que consiste en
injertar lateralmente el cultivar deseado sobre una estaquilla del porta-injertos que se
enraíza mediante los métodos normales de propagación. Actualmente también es posible
la producción de rosales in vitro (Infoagro et al, 2007).

3.1.1.4 Poscosecha
En la postcosecha intervienen varios factores, en primer lugar hay que tener en cuenta
que cada variedad tiene un punto de corte distinto y por tanto el nivel de madurez del
botón y el pedúnculo va a ser decisivo para la posterior evolución de la flor, una vez
cortada.

Una vez cortadas las flores los factores que pueden actuar en su marchitez son: dificultad
de absorción y desplazamiento del agua por los vasos conductores, incapacidad del tejido
floral para retener agua y variación de la concentración osmótica intracelular.

Los tallos cortados se van colocando en bandejas o cubos con solución nutritiva,
sacándolos del invernadero tan pronto como sea posible para evitar la marchitez por
transpiración de las hojas.

Una vez que las flores se sacan del almacén, se arrancan las hojas y espinas de parte
inferior del tallo. Posteriormente los tallos se clasifican según longitudes, desechando
aquellos curvados o deformados y las flores dañadas.
La clasificación por longitud de tallo puede realizarse de forma manual o mecanizada;
actualmente existen numerosas procesadoras de rosas que realizan el calibrado. Estas
máquinas cuentan con varias seleccionadoras para los distintos largos. Su empleo permite
reducir la mano de obra.

Finalmente se procede a la formación de ramos por decenas que son enfundados en un

film plástico y se devuelven a su almacén para un enfriamiento adicional (4-5ºC) antes
de su empaquetado, ya que la rosa cortada necesita unas horas de frío antes de ser
comercializada (Becerra, 2010).

3.1.1.5 Botrytis cinérea

Botrytis cinerea es un hongo Fito patógeno importante que infecta una amplia variedad
de plantas y que puede hacer uso de diferentes mecanismos de infección, aunque se ha
observado cierta variabilidad genética en algunas especies en cuanto a su resistencia a B.
cinerea, en ningún caso se ha encontrado una relación gen a gen. El patógeno puede atacar
al cultivo en cualquier estado de desarrollo del mismo e infectar cualquier parte de la
planta. Debido a la considerable incidencia del patógeno y a las repercusiones económicas
que tiene en cultivos de importancia tales como vid, tomate, fresa, ornamentales, etc. La
mayor parte de las estrategias de control utilizadas hasta el momento se han basado en el
empleo de agentes químicos. (Benito, Ernesto, Arranz, & Eslava, 2000).

3.1.1.6 Taxonomía y Morfología

Reino Fungi

Phylum Ascomycota

Sub-phylum Pezizomycotina

Clase Leotiomycetes

Orden Helotiales

Familia Sclerotinicaeae

Género Botryotinia

Especie Botrytis cinerea

Tabla 2. Taxonomía y Morfología de Botrytis cinere

(Wikipedia, 2016).

Botrytis cinerea se caracteriza por los abundantes conidios (esporas asexuales) de forma
oval en el extremo de conidióforos grises ramificados. El hongo además produce
esclerocios altamente resistentes como formas de resistencia en cultivos viejos. Pasa el
invierno en forma de esclerocio o como micelio intacto, ambas formas germinan en
primavera para producir conidióforos. Los conidios se dispersan por el viento, lluvia y
causan nuevas infecciones.
Se ha observado una considerable variabilidad genética en diferentes estirpes de Botrytis
cinerea (Wikipedia, 2014).
3.1.1.7 Botrytis (moho gris)
El moho gris (Botrytis cinerea) y sus cepas causan la necrosis de las flores, las hojas, las
yemas, los brotes, las plántulas y las frutas de las plantas. Tanto las plantas herbáceas
como las leñosas son susceptibles a esta enfermedad. Esta enfermedad no tiene
hospederos específicos. El moho gris puede infectar a cientos o miles de plantas. La
infección ocurre en condiciones de humedad. Cuanto más húmeda esté la planta, más
riesgo correrá de infectarse de moho gris. La cantidad de zonas infectadas ha aumentado
como así también la cantidad de plantas atacadas y el grado de gravedad de las infecciones
(desarrollo más rápido de la enfermedad y necrosis del tejido).

La botrytis a veces se confunde con los daños que se manifiestan cuando las plantas
envejecen, la marchitez causada por el envejecimiento debe ocurrir primero en los pétalos
externos y en los bordes o en la puntas, cuando los pétalos internos o el centro de los
pétalos desarrollan lesiones marrones primero, la causa probablemente sea el moho gris.
En las hojas delgadas como las del árbol de Judea, las lesiones son irregulares de color
marrón claro a marrón, en las hojas más carnosas como las del rododendro se ven anillos
concéntricos de distintos tonos del marrón.

Algunas plantas herbáceas perennes susceptibles son las anémonas, las aster, las
gypsophilas, las campanitas, el corazón sangrante, la sanguinaria, la campanilla de
Irlanda, el botón de oro, la caléndula, las iberis, el clavel, el crisantemo, la achicoria, la
coral baya, los geranios, el diente de león, la pipa del holandés, la dedalera, amaranto
perenne, los jacintos, los lirios, el aro manchado, el lirio de los valles, los lupinus, la cruz
de malta, el narciso, la peonía, el phlox, las dianthus, las hostas, la amapola, las prímulas,
la echinacea purpúrea, la rosa, la campanilla de invierno, el tulipán, la hierba doncella y
la violeta. (Agrytec, 2010).

3.1.1.8 Síntomas
Los síntomas varían según el tipo de planta atacada, la parte de la planta atacada y las
condiciones de crecimiento. Cuando hay mucha humedad se puede ver un entretejido fino
gris (micelio). Generalmente, en ese “tejido” se forma una estructura denominada
conidióforo que contiene esporas. Las plantas infectadas liberan las esporas de la
enfermedad en forma de nubes cuando por alguna razón se mueven. La humedad también
acelera la liberación de las esporas. La mala circulación de aire también contribuye a la
supervivencia y al desarrollo de la enfermedad. Cuando la temperatura oscila entre los 68
y 76 °F y la humedad es elevada, la enfermedad demora aproximadamente 20 horas para
comenzar a infectar. El clima cálido a muy caluroso y seco contribuye a reducir o detener
el desarrollo y la diseminación de la enfermedad (Schuster, 2014).

3.1.1.9 Fungicidas
Los fungicidas son usados extensamente en la industria, la agricultura, en el hogar y el
jardín para un número de propósitos que incluyen: para protección de las semillas de
granos durante su almacenamiento, transportación y la germinación; para la protección
de los cultivos maduros, de las fresas, los semilleros, las flores e hierbas silvestres,
durante su almacenamiento y transportación; para la eliminación de mohos que atacan las
superficies pintadas; para el control del limo en la pasta del papel ; y para la protección
de alfombras y telas en el hogar. (Quiminet, 2003).

3.1.1.10 Aplicación
Se aplican mediante rociado, pulverizado, revestimiento (ejemplo: para semillas) o por
fumigación de los locales (ejemplo: en invernaderos y almacenes) y en tratamientos de
otros materiales como madera, papel, cuero, etc. Se aplican mediante impregnación o
tinción. Otra forma de administrarse es a modo de medicamentos ingeridos o aplicados
en tratamientos de enfermedades humanas o animales (Quiminet, 2003).

3.1.1.11 Clasificación
 Fungicidas protectores: se aplican antes de que lleguen las esporas de los hongos.
Por ejemplo: los compuestos de azufre y cobre.
 Fungicidas erradicadores: se aplican para el tratamiento de la planta ya enferma
por hongos. Por ejemplo: compuestos de mercurio, derivados nitrogenados de
fenoles, etc.
(Quiminet, 2003).

3.1.1.12 Score
Score es un fungicida sistémico, eficaz para el control de enfermedades causadas por
hongos ascomicetos, hongos imperfectos y basidiomicetos, inhibiendo el desarrollo
miceliar tanto interno como externo, disminuyendo la germinación de las esporas o
conidias del hongo.
Se puede mezclar con la mayoría de los fungicidas, insecticidas y fertilizantes foliares
existentes en el mercado. Es incompatible con productos de reacción alcalina, para su
mejor utilización se recomienda hacer pruebas preliminares (Agroquim, 2012).

3.1.1.13 Novak (Thiofanato metil)

Tio-carbonato sistémico y actividad fungicida, preventiva y curativa, por vía sistémica y
contacto sobre enfermedades producidas por hongos endo y ectoparásitos presentado en
forma de polvo que se puede mojar para aplicar en pulverización foliar. Resulta eficaz en
el control preventivo y, hasta la aparición de los primeros síntomas, curativo de diversas
enfermedades producidas por hongos endoparásitos. Puede ser utilizado en el control de
las enfermedades que se citan en los cultivos y plantaciones (Terralia, 2013).
IV Objetivos
4.1 General
Evaluación in vitro de Novak y Score sobre Botrytis cinérea causante de Botrytis en Rosa
hibrida

4.2 Específicos
 Aislar el hongo (Botrytis cinerea) causante de botrytis en el laboratorio.
 Verificar el fungicida eficiente para el control del hongo.

V Hipótesis
 El empleo de Novak y Score disminuyen la incidencia de Botrytis cinérea
mejorando la productividad y la calidad de rosas.
 El empleo de Novak y Score no disminuyen la incidencia de Botrytis cinérea por
lo que no mejora la productividad y calidad de rosas
VI Materiales y Métodos
6.1 Materiales
6.1.1 Fase de laboratorio
 Guantes quirúrgicos
 Mascarilla
 Balanza analítica
 Matraces
 Autoclave
 Refrigerador
 Cajas Petri de vidrio
 Asa de inoculación
 Agua destilada
 Mechero de Bunsen
 Incubadora de laboratorio
 Atomizadores
 Cámara de flujo laminar
 Medios de cultivo (Agar papa dextrosa)
 Cinta de parafina
 Tijera quirúrgica
 Pinza
 Microscopio
 Azul de lactofenol
 Porta y cubre objetos
 Agua destilada
 Muestra de Botrytis cinerea en hojas y flores de rosa
 Alcohol antiséptico
 Papel toalla

6.1.2 Fase de Campo

 Fundas Ziploc
 Libreta de campo
 Marcadores

6.1.3 Reactivos
 Agar papa dextrosa
 Score
 Novak (Thiofanato Metil)

6.2 Métodos
6.2.1 Recolección de la muestra
o Se obtuvieron las muestras de botones de las rosas más susceptibles que
presentaron síntomas o signos de la presencia de Botrytis cinerea.
 o Luego las muestras vegetales fueron colocadas en fundas plásticas y transportadas
al laboratorio. El material muestreado se colocó en las cámaras húmedas durante
el tiempo necesario para propiciar esporulación del hongo. El material se incubó
a temperatura de laboratorio, después que el hongo esporuló se procedió a realizar
su aislamiento.

6.2.2 Preparación del medio de cultivo

Para tener nuestro medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA), se pesaron 20g de PDA
en la balanza y se disolvió en un matraz Erlenmeyer de 500ml con agua disuelta. Se armó
un equipo con el mechero de gas el trípode y la malla de amianto. Sobre este se puso a
calentar la mezcla removiendo con la varilla de agitación. Luego que esté completamente
disuelto el PDA se colocó en un frasco de vidrio y se tapó sin ajustar totalmente. Se
esterilizó en el autoclave. Se dejó enfriar varios minutos para luego dispensar el agar en
cada una de las cajas Petri. Se realizó esta labor en la cámara de flujo laminar. Finalmente
se colocó las cajas Petri con agar en la refrigeradora.

6.2.3 Siembra de Botrytis cinérea

o Con la ayuda de una tijera quirúrgica se procedió a cortar parte del pétalo y la hoja
infectada con Botrytis cinerea y lo colocamos en un plato Petri.
o Se encendió el mechero para proceder con el cultivo de la muestra.
o Se desinfecto y se flamero el asa de inoculación.
o Con la ayuda del asa de inoculación estéril tomamos una pequeña muestra de la
caja Petri, recordando que todo este proceso se debe realizar detrás de la llama del
mechero de Bunsen para evitar que el cultivo se contamine.
o Se colocó la muestra en el medio de cultivo de agar papa dextrosa (PDA).
o Se flameo los bordes de la caja Petri.
o Se selló la caja Petri con la cinta de parafina.
o Se llevó nuestro cultivo a la incubadora de laboratorio, la cual se encontraba a
26° C, procurando que la tapa de la caja Petri esté boca abajo para proporcionar
una adecuada humedad al medio de cultivo.
o El Cultivo permaneció en la incubadora durante 5 días.

6.2.3 Purificación del cultivo de Botrytis cinérea

o Se observó el estado en el que se encontraba nuestro cultivo, percatándonos de las
colonias formadas presentes en el mismo, procuramos identificar la colonia de
Botrytis cinerea el mismo que mostró una apariencia de moho gris.
o Se procedió a la extracción y purificación del cultivo para lo cual extrajimos el
hongo de Botrytis cinerea y lo colocamos en un nuevo medio de cultivo,
obteniendo una cepa completamente pura.
o Se colocó las cajas Petri debidamente selladas en la incubadora.
6.2.5 Caracterización de Botrytis cinérea
Se raspó la superficie esponjosa del hongo y se hizo un frotis sobre un portaobjetos, se
aplicó una gota de azul de lactofenol, se cubrió con el cubre objetos y se observó en el
microscopio la presencia de micelio y conidios globosos.

6.2.6 Inoculación de Botrytis cinérea en Novak y Score

o Se prepararon los sensidiscos para los fungicidas: Novak (Thiofanato metil) y
Score.
o Se realizó el tratamiento del hongo, en dos medios PDA con el uso del asa de
inoculación y detrás del mechero para evitar contaminación biológica, como
también para esterilizar el asa de inoculación; para el primer tratamiento tomamos
una muestra del hongo purificado, el cual se lo coloco en el centro del medio
PDA , luego en las cercanías del borde de la caja Petri se colocaron dos sensidicos
empapados con el primer fungicida, se precedió a sellarlo con parafilm y se lo
llevó a la incubadora.
o Para la preparación del segundo tratamiento se realizó el mismo procedimiento
pero aplicando el otro fungicida.
o Se esperó durante cuatro días la propagación del hongo y el control de cada uno
de los tratamientos y se observaron los resultados.

Bibliografía
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Wikipedia. (2016). Rosa. Obtenido de Wikipedia : http://es.wikipedia.org/wiki/Rosa

 ANEXOS

Imagen 1. Desinfección de la cámara de flujo. Imagen 2. Muestra de Botrytis Cinerea para proceder
a sembrar.

Imagen 3. Sembrado en cultivo PDA. Imagen 4. Sellado del cultivo con papel parafilm.
Imagen 5.Cultivos de Botrytis Cinerea que deben ser Imagen 6. Cultivo de Botrytis Cinerea aislado.
aislados.

Imagen 7. Observación del hongo. Imagen 8. Se puede ver un esporangioforo del hongo.

Imagen 9. Diferentes observaciones del microscopio de Botrytis cinérea.

Imagen 10. Esterilización de los sensidiscos para aplicar Imagen 11. Cultivos de Botrytis cinérea para aplicar los
al cultivo. químicos respectivos.

Imagen 12. Pesticidas que vamos a utilizar para el

control del hongo.

Imagen 13. Preparación de los pesticidas para el control.