Rev. Salud Anim. Vol. 24 No.

2 (2002): 134-141

DETECCIÓN DE SECUENCIAS PERTENECIENTES AL VIRUS

DE LA RETICULOENDOTELIOSIS EN EL GENOMA DE CEPAS
VACUNALES Y CLONES DEL VIRUS DE LA VIRUELA AVIAR

Edenis Ramos, Laura Coroas, Marlén González y A. Fernández

Dpto. de Biología Molecular, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10,
San José de las Lajas, La Habana, Cuba. Correo electrónico: ramos@censa.edu.cu

RESUMEN: Se multiplicaron las cepas vacunales y clones del virus de la Viruela aviar en cultivos de
fibroblastos de embrión de pollo (FEP) para realizar la extracción del ADN. La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) se utilizó para detectar si las muestras estaban contaminadas con secuencias del virus
de la reticuloendoteliosis (REV). Para esto se emplearon oligonucleótidos específicos a regiones de viruela
que se encuentran próximas al sitio de inserción. Los productos de PCR obtenidos presentaron una talla
de 519 pb, de la cual 248 pb correspondieron a secuencias retrovirales, al compararse con secuencias
reportadas del virus de la viruela aviar y de retrovirus.
(Palabras clave: virus de la viruela aviar; retrovirus; poxvirus; reacción en cadena de la polimerasa)

DETECTION OF RETICULOENDOTHELIOSIS VIRUS SEQUENCES INTEGRATED IN

THE GENOME OF VACCINAL STRAINS AND CLONES OF FOWLPOX VIRUS

ABSTRACT: Vaccinal strains and clones of fowlpox virus were propagated in chicken embryo fibroblast
cell cultures (CEF) for the extraction of DNA. The polymerase chain reaction (PCR) was carrried out
for the detection of reticuloendotheliosis virus sequences integrated in the genome of fowlpox virus. These
products show a size of 519 bp, which were sequenced and compared with other sequences of fowlpox
virus and retrovirus.
(Key words: fowlpox virus;retrovirus; poxvirus; polymerase chain reaction)

INTRODUCCIÓN recombinantes donde es ampliamente utilizado este

La viruela aviar es una enfermedad de importancia
económica para la avicultura, debido a su afectación
a aves de todas las edades, sexos y razas (15). Aun-
que provoca una baja mortalidad alrededor de un 5 a
un 10 % (4), las pérdidas se deben a una baja razón
de crecimiento dentro de la parvada. Para la preven-
ción de la enfermedad es necesario la aplicación de
vacunas, principalmente se usan los métodos conven-
cionales de inmunización, como las vacunas vivas pro-
ducidas en cultivos de fibroblastos de embrión de po-
llo (FEP) o en membrana corioalantoidea (MCA) de
huevos de pollos embrionados. Dentro de las vacunas
de nueva generación se encuentran las vacunas
virus como vector vacunal portador de genes
heterólogos.
El virus de la viruela aviar (VVA) es el prototipo del
género Avipoxvirus de la familia Poxviridae y presen-
ta un ADN de doble cadena que se replica en el cito-
plasma de las células infectadas (26). Tiene la carac-
terística de ser hospedero específico para especies
aviares además de la capacidad de aceptar fragmen-
tos foráneos de ADN (2) debido a su gran talla
genómica, a través de una recombinación homóloga,
lo que posibilita la obtención de vacunas multivalentes
para aves (18,22,16,13) y otras especies (14).

La utilización de este virus para la producción de
vacunas vivas atenuadas y como vector de expresión
de genes foráneos para el desarrollo de vacunas virales
recombinantes, conlleva como medida de control de
la calidad de las vacunas, la detección de organismos
contaminantes. Recientemente se reportaron (9) se-
cuencias pertenecientes al virus de la
reticuloendoteliosis (REV) integradas en el genoma del
virus de la viruela aviar, y desde entonces se ha traba-
jado en la detección del mismo en cepas vacunales.
El REV pertenece a la familia Retroviridae,
subfamilia oncovirinae. Este virus provoca una
inmunosupresión por atrofia en la bolsa de Fabricio y
el timos e inducción de tumores en pollos, pavos y
codornices (25). En 1996 en E.U.A se reportó en po-
llos un brote de linfomas después de ser inmunizados
con una vacuna contra la Viruela Aviar (7), debido a
que la misma estaba contaminada con REV. Estos
estudios demostraron que pueden aparecer secuen-
cias retrovirales insertadas dentro del genoma del VVA,
y deben ser analizadas para evitar un riesgo potencial
de inmunosupresión e inducción de tumores en ave.
Por la importancia que tiene el estudio de las ce-
pas vacunales que van a ser usadas en la producción
de vacunas virales, el objetivo de este trabajo consis-
tió en detectar las secuencias pertenecientes al géne-
ro retrovirus y su caracterización para la búsqueda de
vacunas más eficaces.
MATERIALES Y MÉTODOS
Virus, medios de cultivo y células:
Cepas y clones del virus de la viruela aviar :
• FP9, gentilmente donada por el Dr Michael Skinner
del Instituto para la Salud Animal, Inglaterra.
• FP-ATCC-VR-250, gentilmente cedida por la Dra Ju-
lia Noda del laboratorio de Virología Animal (CEN-
SA), cepa de referencia.
• FPC-31 y FPC-32: clones virales procedentes de la
purificación de la cepa Gallina Modificada.
Estas cepas fueron multiplicadas en cultivos celu-
lares de fibroblastos de embrión de pollo para realizar
los estudios.
Cultivos celulares:
Los cultivos primarios de fibroblastos de embrión
de pollo (FEP) se prepararon a partir de embriones
libres de patógenos específicos (CENPALAB, Cuba)
con 10 días de incubación según la metodología des-
crita en el manual de referencia de patógenos aviares
135
(24 ) y crecidos en medio de cultivo DMEM pH 7.2-7.4
suplementado con 5% de suero fetal bovino (Gibco,
certificado libre de micoplasmas y virus), 100 UI/mL
de penicilina G y 100 mg/mL de estreptomicina.
Inoculación de los cultivos de FEP con las cepas
virales y obtención del material genómico.
A la monocapa celular confluente obtenida a las
24 - 48 hrs de incubación mediante la siembra de
18x106 células de FEP por placa de 100 mm de diá-
metro (Corning), se infectaron con las cepas: FP9, uti-
lizada como control positivo; FP-ATCC-VR250 , cepa
de referencia y los clones: FPC-31 y FPC-32, a una
baja multiplicidad de infección, al cabo de 1 hora (hr) a
37°C se eliminó la suspensión viral , se lavó la
monocapa dos veces con 3 mL de medio de cultivo
DMEM y se le adicionó 3 mL del medio anterior suple-
mentado con suero fetal bovino al 2%. Se incubó a
37°C en atmósfera de CO2 hasta observarse el efecto
citopático (ECP) a los 3-4 días Post-Infección (PI).
Posteriormente, el ADN se extrajo según el proto-
colo descrito por Earl y Moss (5) con las siguientes
modificaciones: a la monocapa celular infectada al cabo
de las 48 hrs (evidente ECP), se le retiró el medio de
cultivo y se lavó dos veces con solución amortiguadora
de fosfato salino (PBS) pH 7.2 y las células se recolec-
taron en 0.4 mL de una solución que contenía: Tris
HCl 50mM pH 8.0, Na2EDTA 0.5mM, sacarosa 30%.
A la suspensión obtenida se le adicionó SDS y β-
Mercaptoetanol a una concentración final de 1% y 360
mM, respectivamente, y se incubó durante 30 minutos
(min) en hielo. Se desproteinizó a través de un trata-
miento con Proteinasa K 10 mg/mL, (Merck), y se pro-
cedió a las extracciones consecutivas con fenol, fenol
/ cloroformo y cloroformo. Los ácidos nucleicos se pre-
cipitaron con etanol y NaCl 5M y se disolvieron en 200
mL de solución amortiguadora TE 1X (10 mM Tris, 0.25
mM EDTA pH 7.5). La concentración de ADN se de-
terminó por espectrofotometría a una λ= 260 nm, (19).
Reacción en cadena de la polimerasa para la de-
tección de secuencias REV.
La reacción en cadena de la polimerasa se realizó
con cebadores complementarios a la secuencia
nucleotídica de la cepa FP-9 en las posiciones 221604
y 222124 del genoma. Esta cepa contiene las secuen-
cias pertenecientes a retrovirus en la región compren-
dida entre las posiciones anteriores y fue utilizada como
control positivo, (comunicación personal, Dr Michael
Skinner). Los oligonucleótidos fueron gentilmente ce-
didos por el Dr Michael A. Skinner del Instituto para la
Salud Animal, Inglaterra. Los cebadores se diseñaron
de acuerdo a las sugerencias de Innis et al. (10) y las
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136
secuencias de nucleótidos reportadas para cada re-
gión. Los programas de amplificación se establecie-
ron según la temperatura de desnaturalización de cada
cebador determinado por la fórmula Tm = 69.3+0.41
(% G+C)- 650/Longitud descrita por Chester y Marshak
(3).
Las secuencias diseñadas para estos cebadores
son las siguientes:
REV-F 5’ GAG TGT TAT CAA ATC AGA G 3’ 19 pb
(en sentido)
REV-R 5’ TAC ATA GGG TAT TCG G 3’ 16 pb
(antisentido)
La reacción de amplificación se realizó en un
termociclador (Progene, Techne Cambrigde Ltd) con
50 ng de ADN, 20 pmoles de los cebadores, 0.2mM
dNTP( Amersham), 5mL de solución amortiguadora
10X (Roche) y 0.4 mL Enzima3.5 U/mL (Expand High
Fidelity PCR System, Versión 3, Roche) en 50 mL de
volumen final de reacción. Las condiciones de amplifi-
cación fueron las siguientes: 1 ciclo de 94°C, 1 min; 25
ciclos de 94°C, 1 min ,45°C, 1 min, 68°C, 2min y final-
mente un ciclo de 68°C, 10 min.
Los productos de PCR se revelaron mediante una
electroforesis en gel de agarosa al 0.8% preparado en
TBE 0.5X (Tris 5.4g, Ácido Bórico 2.75 g, 0.46 g
Na2EDTA en 1000 mL), teñido con bromuro de etidio
a una concentración final de 0.5 mg/mL y corrido a
100 volts (19). Se visualizaron con luz ultravioleta (LKB,
Pharmacia) y fueron fotografiados con una cámara
Polaroid DS-34.
Secuenciación y análisis con secuencias reporta-
das.
Los productos de PCR se purificaron por el juego
de reactivos QIA prep Miniprep, QIAGE (Alemania),
para realizar una secuenciación automática desde
ambas cadenas a través del juego de reactivos ABI
PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle
Sequencing (PE, ABI) con 50 ng del producto y 10
pmoles de los cebadores usados para PCR. El pro-
grama utilizado fue el siguiente:
96°C, 10 segundos
46°C, 30 segundos 30 ciclos
60°C, 4min
Los electroferogramas obtenidos a partir de la
secuenciación automática fueron procesados con la
utilización del programa Chromas (http:/
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www.technelysium.com.au/ chromas.html). Se realiza-
ron alineamientos de las secuencias mediante el pro-
grama de alineamientos múltiples de secuencias
Clustal W versión 1.5 (23).
La secuencia consenso obtenida entre todas las
muestras fue alineada con las secuencias de las ce-
pas vacunales del VVA reportadas por Hertig y colabo-
radores (9), así como con las secuencias de los frag-
mentos repetitivos largos terminales (LTR) del provirus
sincitial de pollo (ACRLTR1) a través del programa
Clustal W. También fue introducida en una base de
datos para analizar los por cientos de homologías con
otras secuencias reportadas a través del uso del pro-
grama FASTA (17).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de la amplificación por PCR revela-
ron que las muestras que contenían ADN de la cepa
FP-ATCC y los clones FPC-31 y FPC-32 fueron positi-
vas para secuencias REV, al obtenerse un producto
entre 500 y 600 pb del marcador de peso molecular de
100 pb, los cuales coincidieron en talla con lo obtenido
en la cepa FP9 utilizada como control positivo. Las
muestras que contenían ADN de FEP y agua resulta-
ron negativas por esta técnica. Esto demuestra que el
método empleado para el diseño de los cebadores y
las condiciones de amplificación resultaron satisfacto-
rias para la detección de secuencias REV integradas
en el genoma del virus de la viruela aviar (Figura 1).
1.0
0.5
0.2
FIGURA 1. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % en
solución amortiguadora TBE 0.5x del producto amplificado
para la detección de secuencias de retrovirus insertadas en
el genoma del virus de la viruela aviar./ Electrophoresis in
agarose gel at 0.8% in TBE 0.5x buffer of PCR product for
detection of retrovirus sequences inserted in fowlpox virus
genome.
Línea 1: Marcador de peso molecular 100pb MBI; Línea 2:
FPC-31; Línea 3: FPC-32; Línea 4: FP-9; Línea 5: ATCC;
Línea 6: Células sin infectar; Línea 7: Control H2O
 137

Esta técnica de PCR fue utilizada por Diallo et al.
(4) como procedimiento para la detección de secuen-
cias del virus de la reticuloendoteliosis desde aislamien-
tos de campos del virus de la viruela aviar, con
oligonucleótidos complementarios a regiones dentro
de las secuencias LTR. Estos investigadores obtuvie-
ron un fragmento de 219 pb que representa la región
U5 entera y 118 pb de la región U3 de las LTR, basa-
dos en las secuencias del virus de la necrosis del bazo,
otra especie perteneciente al mismo género.
Otro grupo de investigadores (6), han testado se-
cuencias de retrovirus a través del uso de diferentes
técnicas como inmunofluorescencia indirecta, el ELISA
y la PCR; sus trabajos arrojaron que la PCR es el mé-
todo más sensible en comparación con las otras dos
técnicas donde, en muestras con baja concentración,
dieron resultados negativos, por lo que nuestro proce-
dimiento es adecuado para la detección de estas se-
cuencias.

Sec_ (CVE) ATGTTAAAACGGTACTCTCTAAAGTTCATACGAGTATGAAATCGTACTACAACAATGATA

sec_LTR-M3 ------------------------------------------------------------
sec_LTR-3’S ------------------------------------------------------------
sec_5’LTR S ------------------------------------------------------------
sec_ACRLTR ------------------------------------------------------------

<— FPV/ U3->

Sec_ (CVE) CGTCTCTTCCTGTCGCCGTTAAGGTGATTTACGGAACAGTAACAATATAAAAAGTGTGG-
sec_LTR-M3 -----------------------------AACGGAACAGTAACAATATAAAAAGTGTGG-
sec_LTR-3’S REV <-TGTGGG
sec_5’LTR S -----------------------------AACGGAACAGTAACAATATAAAAAGTGTGG-
sec_ACRLTR REV <-TGTGGG
*****

Sec_ (CVE) AGGGAGCTCCGGGGGG----------------------AATAGCGCTGGCTCGCTAACTG

sec_LTR-M3 AGGGAGCTCCGGGGGG----------------------AATAGCGCTGGCTCGCTAACTG
sec_LTR-3’S AGGGAGCTCCGGGGAATGTGGGAGGGAGCTCCGGGGGGAATAGCGCTGGCTCGCTAACTG
sec_5’LTR S AGGGAGCTCCGGGGGG----------------------AATAGCGCTGGCTCGCTAACTG
sec_ACRLTR AGGGAGCTCCGGGGGA----------------------AATAGCGCTGGCTCGCTAACTG
************** **********************

Sec_ (CVE) CCATATTAGCTTCTGTAATCATGCTTGCTTGCCTTAGCCGCCATTGTACTTGATATATTT

sec_LTR-M3 CCATATTAGCTTCTGTAATCATGCTTGCTTGCCTTAGCCGCCATTGTACTTGATATATTT
sec_LTR-3’S CCATATTAGCTTCTGTAATCATGCTTGCTTGCCTTAGCCGCCATTGTACTTGATATATTT
sec_5’LTR S CCATATTAGCTTCTGTAATCATGCTTGCTTGCCTTAGCCGCCATTGTACTTGATATATTT
sec_ACRLTR CCATATTAGCTTCTGTAATCATGCTTGCTTGCCTTAGCCGCCATTGTACTTGATATATTT
************************************************************

Sec_ (CVE) CGCTGATATCATTTCTCGGAATCGGCATCAAGAGCAGGCTCATAAACCATAAAAGGAAAT

sec_LTR-M3 CGCTGATATCATTTCTCGGAATCGGCATCAAGAGCAGGCTCATAAACCATAAAAGGAAAT
sec_LTR-3’S CGCTGATATCATTTCTCGGAATCGGCATCAAGAGCAGGCTCATAAACCATAAAAGAAAAT
sec_5’LTR S CGCTGATATCATTTCTCGGAATCGGCATCAAGAGCAGGCTCATAAACCATAAAAGGAAAT
sec_ACRLTR CGCTGATATCATTTCTCGGAATCGGCATCAAGAGCAGGCTCATAAACCATAAAAGGAAAT
******************************************************* ****

Sec_ (CVE) GTTTGTTGAAGGCAAGCATCAGACCACTTGCAC---------------------------

sec_LTR-M3 GTTTGTTGAAGGCAAGCATCAGACCACTTGCAC---------------------------
sec_LTR-3’S GTTTGTTGAAGGCAAGCATCAGACCACTTGCAC---------------------------
sec_5’LTR S GTTTGTTGAAGGCAAGCATCAGACCACTTGCACCATCCAATCACGAACAAACACGAGATC
sec_ACRLTR GTTTGTTGAAGGCAAGCATCAGACCACTTGCACCATCCAATCACGAACAAACACGAGATC
*********************************

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Sec_ (CVE) -----------------------------------------------------------

sec_LTR-M3 -----------------------------------------------------------
sec_LTR-3’S -----------------------------------------------------------
sec_5’LTR S GAACTATCATACTGACCCAATGGTTGTAAAGGGCAGATGCTATCCTCCAATGAGGGAAA
sec_ACRLTR GAACTATCATACTGACCCAATGGTTGTAAAGGGCAGATGCTATCCTCCAATGAGGGAAA

<- U3/ R->

Sec_ (CVE) --------------------------------------------------------------
sec_LTR-M3 --------------------------------------------------------------
sec_LTR-3’S --------------------------------------------------------------
sec_5’LTR S ATGTCATGCAACATCCTGTAAGCGGCTATATAAGCCAGGTGCATCTCTTGCTCGGGGTCGCC
sec_ACRLTR ATGTCATGCAACATCCTGTAAGCGGCTATATAAGCCAGGTGCATCTCTTGCTCGGGGTCGCC

Sec_ (CVE) --------------------------------------------------------------

sec_LTR-M3 --------------------------------------------------------------
sec_LTR-3’S --------------------------------------------------------------
sec_5’LTR S GTCCTACACATTGTTGTGACGTGCGGCCCAGATTCGAATCTGTAATAAAAGCTTTTTCTTCT
sec_ACRLTR GTCCTACACATTGTTGTGACGTGCGGCCCCGATTCGAATCTGTAATAAAAGCTTTTTCTTCT

<-R / U5->
Sec_ (CVE) -----------------------------------------------------ACTAGGTGG
sec_LTR-M3 -----------------------------------------------------ACTAGGTGG
sec_LTR-3’S -----------------------------------------------------ACTAGGTGG
sec_5’LTR S ATATCCTCAGATTGGCAGTGAGAGGAGATTTTGTTCGTGGTGTTGGCTGGCCTACTGGGTGG
sec_ACRLTR ATATCCTCAGATTGGCAGTGAGAGGAGATTTTGTTCGTGGTGTTGGCTGGCCTACTGGGTGG
*** *****

<-U5/FPV->
Sec_ (CVE) GGCAGCAGGGGTCCGGACTGAAT-CGTCGTAGTTCGGTACAACA--GTATTATTGTATAATA
sec_LTR-M3 GGCAGCAGGGGTCCGGACTGAAT-CGTCGTAGTTCGGTACAACA--GTATTATTGTATAATA
sec_LTR-3’S GGCAGCAGGGGTCCGGACTGAAT-CGTCGTAGTTCGGTACAACA--GTATTATTGTATAATA
sec_5’LTR S GGTAG---GGATCCGGACTGAATCCGTAGTATTTCGGTACAACATT-> REV
sec_ACRLTR GGTAG---GGATCCGGACTGAATCCGTAGTATTTCGGTACAACATT-> REV
** ** ** ************ *** *** ************

Sec_ (CVE) TTATATTTTGTAATATATAAAAAAATAGAAAATAAATAATATATTATTTTTATAATGGATAT

sec_LTR-M3 TTATATTTT
sec_LTR-3’S TTATATTTT

FIGURA 2. Alineamiento de las secuencias LTR de REV y de las secuencias que flanquean dicha inserción presente en la
cepa vacunal estudiada (sec-CVE) del virus de la viruela aviar con las secuencias LTR REV presentes por el terminal 5’ y
3’ de la cepa vacunal estándar FPV-S ( sec_ LTR 5’ y sec- LTR 3’) y el remanente obtenido en la cepa vacunal FPV-M3
(sec_LTR M3), reportadas por Hertig et al. (9). Las regiones U3, R y U5 fueron identificadas por las secuencias LTR
presentes en el virus sincitial de pollo (ACRLTR1). Las delecciones en el alineamiento se indican por un guión./ Alignment
of REV LTR and flanking FPV sequences present in FPV(sec-CVE) studied vaccinal strain with REV LTR present at the
5´end and the 3´end in the FPV standard strain (FPV-S) and the remnant in FPV-M3. The LTR sequences was identified
using the chicken syncytial virus (ACRLTR1). The deletions are indicated by a dash.

Cuando se secuenciaron los productos de PCR esto reveló una secuencia consenso de 519 pb, la cual
obtenidos y las secuencias correspondientes a cada fue a su vez comparada con las secuencias reporta-
muestra se alinearon a través del programa Clustal W, das por Hertig et al. (9). (Figura 2).

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 139

Esta comparación reveló que coincidían en una re-
gión de 248 pb la cual se corresponde a los fragmen-
tos LTR de la cepa FPV-M3, conocida por no estar
contaminada con REV infeccioso a partir de los expe-
rimentos de Hertig et al. (9). El resto de las bases que
flanquean esta región correspondieron a secuencias
del virus de la viruela aviar. En comparación con la
secuencia del terminal 3’ LTR de la cepa FPV-S, con-
taminada con REV y comprobada su contaminación
por los experimentos de Hertig et al. (9), dio 3 sustitu-
ciones y 23 delecciones y por el terminal 5’ de la se-
cuencia LTR de esta misma cepa y con la secuencia
LTR del virus sincitial de pollo (21), perteneciente al
género retrovirus, resultó en una gran delección de 263
pb que comprende parte de la región U3, la región R
completa y parte de U5. En el remanente de U5 (52
pb), nuestras secuencias mostraron cambios igual que
la cepa FPV-M3 en 3 delecciones, 5 sustituciones y 3
inserciones con respecto a las secuencias LTR del vi-
rus sincitial de pollo y el terminal 5’ de la cepa S, como
se refleja en la Figura 2. Este alineamiento nos permi-
tió concluir que las cepas vacunales y los clones estu-
diados llevan integrados un remanente de la secuen-
cia LTR de REV, lo que representa un 100 % de
homología a nivel nucleotídico, al compararse con el
remanente presente en la cepa FPV-M3 Australiana.
Además de los resultados obtenidos por la compa-
ración a través del Clustal de la secuencia completa
con las publicadas por Hertig et al. (9), obtuvimos, por
el procedimiento de FASTA, otras secuencias que apa-
recen en la literatura, las cuales coincidían también
con la región de 248 pb, que representa la secuencia
de retrovirus encontrada en este trabajo. Esta coinci-
dencia resultó entre 85 a un 100% de identidad como
puede ser observado en la Tabla 1 dentro del área com-
prendida que se destaca, lo que nos habla a favor de
la similitud a nivel nucleotídico de la secuencia estu-
diada con las recogidas en la base de datos relaciona-
das con la presencia de secuencias de REV.
Otra importante consideración que se desprende
de los resultados presentados es con relación a la se-
cuencia AF198100 perteneciente a una cepa
patogénica de viruela aviar, procedente del centro de
Salud Animal, Iowa. Como aparece referido en la Ta-
bla 1, Afonso et al. (1) obtuvieron en esta cepa un re-
manente similar de secuencias LTR de REV que está
representado por 253 nucleótidos insertados desde la
posición 232464 a la 232717 del genoma de la misma,
con un 98 % de identidad a las LTR del REV proce-
dente de un Linfoma β de pollo. Estos investigadores
tampoco encontraron los genes env, gag y pol que
codifican para proteínas retrovirales. Al compararse la
secuencia AF198100 con la obtenida en nuestro tra-
bajo, se vio un 100 % de identidad en la secuencia
nucleotídica como queda reflejado en esta Tabla, lo
que permite inferir que nuestra secuencia carece de
los genes env,gag, pol propios de los retrovirus, dato
ya encontrado al analizar el alineamiento.

TABLA 1. Análisis comparativo de la secuencia insertada de 248 pb con 10 secuencias publicadas en la base de datos
de la EMBL./ Comparative analysis of inserted sequence of 248 bp with 10 sequences published in the EMBL base

Código Cepa Posición en el Área de Por ciento Por ciento de

de acceso analizada genoma comparación Homología continuidad Referencia
(nucleótidos) (ungapped)
AF198100 Fowlpox Challenge virus, 232468- 248 100 100 1
Iowa 232715
AF006064 Cepa vacunal Mild (M) 905-1152 248 100 100 9
Fowlpox, Australia
AF006065 Cepa vacunal Standard 905-1100 196 100 100 9
(S) Fowlpox, Australia
AF006066 Cepa vacunal Standard 435-679 245 99.59 99.59 9
(S) Fowlpox, Australia
S82226 Cepa JM de MDV 50-242 193 100 100 12
REACRL02 Cepa de retrovirus 10-202 193 99.48 99.48 21
REACRL03 Cepa de retrovirus 250-442 193 99.48 99.48 21
S79845 Cepa atenuada JM-Hi3 428-557 130 100 100 11
de MDV
S70398 Cepa de retrovirus 7-136 130 100 100 8
RESNVPO1 Cepa de SNV 5-129 126 84.92 91.45 20
‘ Las homologías con la secuencia descrita en este trabajo se muestran como % de identidad de nucleótidos

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Hertig et al. (9) plantean que la presencia de se-
cuencias REV no es único de cepas australianas, ya
que existen evidencias de remanentes en el mismo
sitio en cepas vacunales y aislamientos de campos
europeos. Estos autores también han analizado aisla-
mientos obtenidos del año 1960, los cuales resultaron
positivos para secuencias de REV y llegaron a la con-
clusión que esta integración no ha ocurrido reciente-
mente. Se ha visto que existe una amplia distribución
geográfica de cepas del virus de la viruela aviar que
llevan secuencias REV integradas al genoma como lo
describen los autores referidos en las referencias 1, 4
y 9, al encontrarse en Europa, Australia y América del
Norte, que son regiones geográficas distantes, pero
que muestran un comportamiento similar en cuanto a
la presencia y localización genómica de secuencias
LTR de REV en cepas del virus de la viruela aviar.
Con este estudio hemos llegado a la conclusión que
los clones FPC-31 y FPC-32 pudieran ser utilizados
como vehículos para la producción de vacunas útiles
en la industria avícola por encontrarse libres de la po-
sibilidad de formar retrovirus infecciosos al replicarse
en el hospedero.
REFERENCIAS
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