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A pesar de una gama cada vez mayor de nuevas terapias contra el cáncer, la resistencia a los
medicamentos es un fenómeno casi universal que probablemente se deba a la presencia de
poblaciones subclonales raras que actúan como reservorio de mutaciones de resistencia. La
aparición de resistencia a los medicamentos finalmente resulta fatal para la mayoría de los
pacientes, y por lo tanto la detección temprana de resistencia y la identificación de nuevas
estrategias de resensibilización es un tema de intensa actividad.
Por estas razones, existe un considerable interés en el uso de pantallas genéticas avanzadas
capaces de modificar los eventos mutacionales del genoma del cáncer que pueden analizarse
para determinar su capacidad de causar resistencia a los fármacos de forma imparcial. Tales
pantallas, si son lo suficientemente imparciales, en teoría podrían capturar toda la amplitud de
los mecanismos de resistencia genética para cualquier droga. Estudios recientes han
demostrado la potencia de las pantallas de ganancia y pérdida de función en todo el genoma
usando CRISPR / Cas9, shRNA lentiviral y tecnologías de lectura abierta a gran escala para
identificar mecanismos clínicamente relevantes de resistencia a los medicamentos en el cáncer
(Hu y Zhang 2016). Sin embargo, estas pantallas no logran capturar un tercer mecanismo
importante de resistencia a los medicamentos, a saber, el de las mutaciones puntuales. Las
mutaciones puntuales son responsables de la resistencia en un gran número de pacientes que
reciben terapias dirigidas en melanoma, cáncer de colon y pulmón y leucemia mieloide crónica
(tabla complementaria S1; Kobayashi et al., 2005; Katayama et al., 2012; Montagut et al., 2012;
Ohashi et al. al. 2012; Bettegowda 2014; Long et al., 2014; Van Allen et al., 2014; Wagle et al.,
2014; Arena et al., 2015; Russo, et al., 2015; Siravegna et al., 2015; Thress et al., 2015) .
Resultados
La exposición a ENU confiere una resistencia estable al Cetuximab en las células de cáncer de
colon
Figura 1.
Figura 1.
Pantallas de mutagénesis química en todo el genoma para definir las vías de resistencia a los
fármacos en el cáncer. (A) Pantalla de viabilidad de Cetuximab en líneas celulares de cáncer
colorrectal. Se analizaron 51 líneas celulares de cáncer colorrectal con un rango de
concentración del anticuerpo monoclonal EGFR ...
Figura 1.
Pantallas de mutagénesis química en todo el genoma para definir las vías de resistencia a los
fármacos en el cáncer. (A) Pantalla de viabilidad de Cetuximab en líneas celulares de cáncer
colorrectal. Se analizaron 51 líneas celulares de cáncer colorrectal con un rango de
concentración del anticuerpo monoclonal EGFR ...
Figura 2.
El espectro de mutaciones inducidas por ENU. (A) Espectro de mutaciones en clones resistentes
a fármacos derivados de ENU. Representación gráfica circular de la proporción de 33.857
mutaciones detectadas en los clones CCK-81 y NCI-H508 categorizados de acuerdo con el tipo
de mutación. Por ...
Como era de esperar, detectamos una firma de MSI ("Firma B") en el catálogo de mutaciones
combinadas para los clones CCK-81, pero sorprendentemente también en los clones NCI-H508
(Supplemental Fig. S4; Alexandrov et al., 2013a). En un examen más detallado, esta firma fue el
resultado de dos clones hipermutadores en el catálogo de mutaciones NCI-H508 (flechas rojas)
(clones NCI-H508_26 y NCI-H508_40) (Fig. S5 suplementaria). Estos clones tenían tasas de
mutación tan altas como cualquiera de los clones de MSI CCK-81 y un número incrementado de
inserciones y deleciones pequeñas. Esto estaría de acuerdo con un defecto en la vía de
reparación de desajuste (Tabla Suplementaria S2). Se descubrió que el clon NCI-H508_26
albergaba una nueva mutación sin sentido (stop-gain) en el gen de reparación del
desapareamiento MLH1, y el clon NCI-H508_40 albergaba una mutación sin sentido en el gen de
reparación del ADN EXO1. Otros dos clones (flechas negras) también tienen tasas de mutación
elevadas que pueden ser el resultado de la obtención de mutaciones sin sentido en POLQ, un
gen implicado en la reparación del daño del ADN. Estos dieron lugar a la tercera firma de origen
desconocido detectada en clones NCI-H508 ("Firma C") (Fig. S4 suplementaria).
Figura 3.
La mutagénesis ENU identifica mutaciones y vías clínicamente relevantes. (A) La vía más
enriquecida con mutaciones, "Señalización a P38 a través de RIT y RIN", contiene muchos de los
genes clave de la vía canónica MAP quinasa, ...
Figura 4.
La mutagénesis ENU identifica una nueva mutación de resistencia MAP2K1 que se detecta en un
paciente con cáncer colorrectal después de una respuesta inicial a Cetuximab. (A) Un paciente
con cáncer colorrectal con metástasis hepáticas inoperables fue tratado con la combinación de
...
Tabla 1.
Tabla 1.
Para validar funcionalmente los efectos de resistencia de estas mutaciones MAP2K1, tratamos
células CCK-81 que expresan las nuevas mutaciones p.F53L y p.C121S, así como la mutación
p.K57N previamente identificada con Cetuximab (junto con vectores vacíos y controles de tipo
salvaje MAP2K1 ) Encontramos que todas nuestras mutaciones de resistencia candidatas
indujeron resistencia a Cetuximab, y la fuerza del efecto de resistencia para las mutaciones fue
comparable a la conferida por la sobreexpresión de la tirosina quinasa receptora MET, un
mecanismo de resistencia previamente identificado (Fig. 4B, izquierda; Bardelli et al. 2013). Los
ensayos de inhibición del crecimiento a largo plazo mostraron una resistencia robusta y
duradera a Cetuximab en las células mutantes MAP2K1 (Fig. 4B, derecha). El análisis de
inmunotransferencia demostró una fosforilación constitutiva elevada de ERK1 / 2 así como una
falla para suprimir completamente la expresión de pERK1 / 2 después del tratamiento con
Cetuximab en todos los clones mutantes de MAP2K1 (figura 4C).
La señalización constitutiva de EGFR en tumores sólidos activa una serie de rutas pro-
supervivencia / proliferación corriente abajo que incluyen PKC, PI3K / AKT / mTOR, JAK-STAT y
MAPK (Supplemental Fig. S8A; Shostak y Chariot 2015). En las células dependientes de EGFR, el
tratamiento con inhibidores de EGFR afecta la supervivencia celular mediante el cierre de tales
procesos. La identificación de las principales vías de señalización que sustentan la resistencia a
los medicamentos abre la posibilidad de orientar racionalmente los componentes clave de
dichas vías de resistencia y, por lo tanto, de volver a sensibilizar las células. La creación de líneas
celulares resistentes mutagenizadas, ya sea a través de la pantalla ENU o mediante la
modificación genética deliberada de la línea celular parental para mutaciones específicas, nos
permitió la oportunidad de que tales experimentos se llevaran a cabo in vitro. Como en la
práctica clínica, la vía más frecuentemente mutada en los clones de ENK resistente a fármacos
CCK-81 y NCI-H508 converge hacia los miembros de la familia MAPK, y se puede esperar que la
selección de estos nodos supere la resistencia (figura 3C). Por ejemplo, un clon mutante CCK-81
BRAF V600E resistente a Cetuximab (ENU-10) se volvió a sensibilizar cuando el anticuerpo
monoclonal de EGFR se combinó con el inhibidor de BRAF Dabrafenib (Figura complementaria
S9A). En las células mutantes, la mutación activadora de BRAF permitiría que tales células
continúen señalizando a través de la ruta de MAPK (y sobrevivan) a pesar del bloqueo de EGFR
(Fig. S8B suplementaria). Por lo tanto, solo atacando tanto a EGFR como a BRAF en combinación,
se pueden silenciar todos los efectores de supervivencia relevantes y se puede reducir la
viabilidad de las células. Los clones resistentes a Cetuximab que albergan mutaciones (en KRAS,
NRAS y MAP2K1) que se predice que activan la señalización de MAPK se volvieron a sensibilizar
cuando se combinó un inhibidor de MEK (Trametinib) con Cetuximab (Fig. S9B suplementaria).
De forma similar, la combinación de Cetuximab con Trametinib resensibilizó casi completamente
las células CCK-81 mutantes MAP2K1 resistentes (Fig. 5A, B). De hecho, tal combinación ya se ha
sugerido como estrategia terapéutica putativa para pacientes con cáncer de colon (Misale et al.,
2014).
Figura 5.
Figura 5.
Orientación racional de las vías de resistencia para resensibilizar mutantes resistentes a los
fármacos. (A) Ensayo de supervivencia clonogénica de células CCK-81 mutantes MAP2K1 cuando
se tratan con Cetuximab, Trametinib o una combinación de los dos fármacos. Mapas de calor de
viabilidad normalizada ... Figura 3.
La mutagénesis ENU identifica mutaciones y vías clínicamente relevantes. (A) La vía más
enriquecida con mutaciones, "Señalización a P38 a través de RIT y RIN", contiene muchos de los
genes clave de la vía canónica MAP quinasa, ...
Figura 4.
La mutagénesis ENU identifica una nueva mutación de resistencia MAP2K1 que se detecta en un
paciente con cáncer colorrectal después de una respuesta inicial a Cetuximab. (A) Un paciente
con cáncer colorrectal con metástasis hepáticas inoperables fue tratado con la combinación de
...
Tabla 1.
Tabla 1.
Para validar funcionalmente los efectos de resistencia de estas mutaciones MAP2K1, tratamos
células CCK-81 que expresan las nuevas mutaciones p.F53L y p.C121S, así como la mutación
p.K57N previamente identificada con Cetuximab (junto con vectores vacíos y controles de tipo
salvaje MAP2K1 ) Encontramos que todas nuestras mutaciones de resistencia candidatas
indujeron resistencia a Cetuximab, y la fuerza del efecto de resistencia para las mutaciones fue
comparable a la conferida por la sobreexpresión de la tirosina quinasa receptora MET, un
mecanismo de resistencia previamente identificado (Fig. 4B, izquierda; Bardelli et al. 2013). Los
ensayos de inhibición del crecimiento a largo plazo mostraron una resistencia robusta y
duradera a Cetuximab en las células mutantes MAP2K1 (Fig. 4B, derecha). El análisis de
inmunotransferencia demostró una fosforilación constitutiva elevada de ERK1 / 2 así como una
falla para suprimir completamente la expresión de pERK1 / 2 después del tratamiento con
Cetuximab en todos los clones mutantes de MAP2K1 (figura 4C).
La señalización constitutiva de EGFR en tumores sólidos activa una serie de rutas pro-
supervivencia / proliferación corriente abajo que incluyen PKC, PI3K / AKT / mTOR, JAK-STAT y
MAPK (Supplemental Fig. S8A; Shostak y Chariot 2015). En las células dependientes de EGFR, el
tratamiento con inhibidores de EGFR afecta la supervivencia celular mediante el cierre de tales
procesos. La identificación de las principales vías de señalización que sustentan la resistencia a
los medicamentos abre la posibilidad de orientar racionalmente los componentes clave de
dichas vías de resistencia y, por lo tanto, de volver a sensibilizar las células. La creación de líneas
celulares resistentes mutagenizadas, ya sea a través de la pantalla ENU o mediante la
modificación genética deliberada de la línea celular parental para mutaciones específicas, nos
permitió la oportunidad de que tales experimentos se llevaran a cabo in vitro. Como en la
práctica clínica, la vía más frecuentemente mutada en los clones de ENK resistente a fármacos
CCK-81 y NCI-H508 converge hacia los miembros de la familia MAPK, y se puede esperar que la
selección de estos nodos supere la resistencia (figura 3C). Por ejemplo, un clon mutante CCK-81
BRAF V600E resistente a Cetuximab (ENU-10) se volvió a sensibilizar cuando el anticuerpo
monoclonal de EGFR se combinó con el inhibidor de BRAF Dabrafenib (Figura complementaria
S9A). En las células mutantes, la mutación activadora de BRAF permitiría que tales células
continúen señalizando a través de la ruta de MAPK (y sobrevivan) a pesar del bloqueo de EGFR
(Fig. S8B suplementaria). Por lo tanto, solo atacando tanto a EGFR como a BRAF en combinación,
se pueden silenciar todos los efectores de supervivencia relevantes y se puede reducir la
viabilidad de las células. Los clones resistentes a Cetuximab que albergan mutaciones (en KRAS,
NRAS y MAP2K1) que se predice que activan la señalización de MAPK se volvieron a sensibilizar
cuando se combinó un inhibidor de MEK (Trametinib) con Cetuximab (Fig. S9B suplementaria).
De forma similar, la combinación de Cetuximab con Trametinib resensibilizó casi completamente
las células CCK-81 mutantes MAP2K1 resistentes (Fig. 5A, B). De hecho, tal combinación ya se ha
sugerido como estrategia terapéutica putativa para pacientes con cáncer de colon (Misale et al.,
2014).
Figura 5.
Figura 5.
Orientación racional de las vías de resistencia para resensibilizar mutantes resistentes a los
fármacos. (A) Ensayo de supervivencia clonogénica de células CCK-81 mutantes MAP2K1 cuando
se tratan con Cetuximab, Trametinib o una combinación de los dos fármacos. Mapas de calor de
viabilidad normalizada ...
Discusión
Como un medio para generar mutaciones puntuales aleatorias por todo el genoma, ENU
mutagénesis química y la detección posterior fenotipo impulsado ha sido fundamental para una
comprensión completa de la complejidad de los procesos biológicos operan en organismos
modelo clásico incluyendo la levadura (Forsburg 2001), moscas (St Johnston 2002 ), pez cebra
(Patton y Zon 2001) y, tal vez más ampliamente, ratones (Kile y Hilton 2005). El agente alquilante
N-etil-N-nitrosourea (ENU) puede introducir una alta tasa de mutaciones puntuales en el
genoma y tiene dos ventajas distintas sobre los mutágenos utilizados anteriormente. Primero,
es muy eficiente, induciendo una mutación puntual cada 1-2 Mb a lo largo del genoma en
modelos de ratón (~100 veces más que la tasa de mutación espontánea y tres veces más alta
que la irradiación X) (Concepción et al., 2004). En segundo lugar, a diferencia de la irradiación,
que induce deleciones multilocus, ENU es un mutágeno puntual y afecta a loci únicos. ENU
funciona mediante la transferencia de su grupo etilo a átomos de oxígeno o nitrógeno en el ADN,
lo que da como resultado una identificación errónea de estas bases etiladas durante la
replicación. Si la falta de coincidencia no se repara, se produce una sustitución de pares de bases
(Justicia 2000). Hasta la fecha, el uso de ENU para definir los mecanismos de resistencia a
fármacos en el cáncer se ha centrado en genes específicos en modelos de líneas celulares no
cancerosas en lugar de interrogar a todo el genoma codificador (Tiedt et al., 2011; Zhang et al.,
2011; Ercan et al. 2015). Los estudios de secuenciación previos de mutaciones derivadas de ENU
en modelos de ratón y mosca demostraron un fuerte sesgo en el espectro de mutaciones de
sustitución observadas, con un número especialmente bajo de mutaciones C> G, T> G y C> A.
Observamos una representación mucho más equilibrada de los seis posibles contextos de
sustitución de bases en nuestras células cancerosas humanas después de la exposición a ENU
(Tabla Suplementaria S8). Por lo tanto, debería haber un mayor potencial para identificar un
mayor número de mutaciones de resistencia, independientemente de su espectro de mutación.
Además, comparamos el espectro de mutación de ENU con el de otro mutágeno, a saber, la
radiación gamma. Se irradiaron dos líneas celulares de cáncer (MSI frente a MSS), y las células
individuales se expandieron a clones antes de la secuenciación del exoma. Observamos que el
espectro de la mutación difería bastante significativamente para las dos líneas celulares, lo que
sugiere que a diferencia de la mutagénesis ENU, hay un mayor efecto específico de la línea
celular en el patrón de mutaciones observadas (Fig. S10 suplementaria). Esto debería tenerse
en cuenta si se usara irradiación gamma para la detección de genes de resistencia a fármacos.
Debido a que es probable que solo un alelo mute para cualquier gen específico, y <5% de las
mutaciones ENU son capaces de anular la expresión de proteínas (es decir, sin sentido,
frameshift o mutaciones esenciales del sitio de empalme), la pantalla está fuertemente sesgada
hacia la ganancia de función o mutaciones de punto dominante. Los genes de resistencia a la
pérdida de función se captarían mejor a través de pantallas de inactivación CRISPR de genoma
completo o utilizar ENU en el establecimiento de modelos de células haploides (aunque cuán
relevantes son para las células cancerosas aneuploidías podría ser un problema confuso).
Materiales
Todo el cultivo celular se realizó en medio RPMI o DMEM / F12 (de acuerdo con las
recomendaciones del proveedor) y se complementó con FBS al 5% y penicilina / estreptavidina.
Las células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO2 durante el cultivo. La identidad de todas las
líneas celulares utilizadas en este documento se confirmó utilizando un panel de 95
polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) utilizados previamente para la autenticación de línea
celular (Fluidigm).
Immunoblotting
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos para ensayos de 6 d y placas de seis pocillos
para ensayos clonogénicos de 20 d. Las células se incubaron en medios libres de drogas para
permitir la adherencia durante 24 h antes de la adición del fármaco a las concentraciones
indicadas. Cada línea celular se sembró para alcanzar ~ 70% de confluencia al final del ensayo.
Cetuximab se obtuvo de la farmacia del hospital Addenbrookes. Trametinib (GSK1120212) y
Dabrafenib se obtuvieron de Selleckchem.
La línea de células de cáncer de colon MSI HCT116 y la línea de cáncer de pulmón MSS NCI-
H3122 se irradiaron cada una con 1 Gy o 10 Gy. Al día siguiente, las células individuales se
clasificaron por flujo y se expandieron como colonias. El ADN se extrajo de nueve colonias de
cada línea celular y se sometió a secuenciación.
La secuenciación del exoma se llevó a cabo utilizando el conjunto de cebo Agilent SureSelectXT
Human All Exon de 50 Mb. Se extrajeron ADN de 72 clones y se sometieron a construcción de la
biblioteca, preparación de células de flujo y generación de clústeres de acuerdo con el protocolo
de preparación de la biblioteca Illumina. Realizamos secuenciación Illumina de 75 pares de
extremos emparejados. La alineación de lectura con el genoma humano de referencia (GRCh37)
se realizó con el Alineador de Burrows-Wheeler (BWA) (http://bio-bwa.sourceforge.net/) (Li y
Durbin 2010). Las lecturas no asignadas se excluyeron del análisis. La cobertura promedio entre
los clones derivados de CCK-81 y NCI-508 fue de 65x y 62x, respectivamente. Las líneas celulares
parentales combinadas se secuenciaron a mayor profundidad (158 x en CCK-81 y 144 x en NCI-
H508).
Detección de variantes
Descifrar las firmas mutacionales marcando secuencias exómicas de clones expuestos a ENU
El contexto inmediato de la secuencia 5 'y 3' de las sustituciones de bases identificadas en los
clones resistentes a Cetuximab se extrajo utilizando las API centrales de Ensembl para la
construcción del genoma humano GRCh37 y se utilizó para generar catálogos mutacionales para
el análisis posterior. El catálogo mutacional de clones resistentes a Cetuximab CCK-81 contenía
7198 sustituciones, mientras que los clones NCI-H508 contenían un total de 23,862
sustituciones. Las firmas mutacionales se descifraron por separado en ambos catálogos de
mutaciones, utilizando un marco computacional desarrollado previamente (Alexandrov et al.,
2013b). Brevemente, el algoritmo identifica un conjunto mínimo de firmas mutacionales que
explica de manera óptima las proporciones de tipos de mutaciones encontradas en un catálogo
mutacional dado (es decir, a través de todas las sustituciones identificadas en clones CCK-81 y
NCI-H508) (Fig. S4 suplementaria) y luego estima la contribución de cada firma identificada a un
espectro de mutación de cada muestra incluida en el análisis (es decir, a un espectro de
mutación de cada clon individual, ver para los clones NCI-H508) (Supplemental Fig. S5).
Análisis del nivel de muestra del enriquecimiento de las vías (SLAPenrich)
Se incluye una breve descripción del modelo estadístico implementado en SLAPenrich en los
Métodos Suplementarios, junto con las especificaciones de los parámetros de entrada y
parámetros utilizados para los análisis presentados en este manuscrito. SLAPenrich se
implementa como un paquete R, y está disponible públicamente en
https://github.com/saezlab/SLAPenrich. La canalización computacional para reproducir los
resultados presentados se implementa en el script adjunto BrammeldEtAl_analysis.R (también
disponible en los Métodos suplementarios).
En resumen, como primer paso, SLAPenrich estima la probabilidad de observar al menos un gen
que pertenece a una vía dada mutada en una muestra dada, en función de la longitud de los
bloques de exones totales de los genes en esa ruta, y la carga de la mutación de la muestra. Una
vez que se ha estimado esta probabilidad para cada muestra individual, SLAPenrich modela la
probabilidad de observar un número dado de muestras con mutaciones en la ruta considerada
mediante una distribución binomial de Poisson. Esta es la distribución discreta de una suma de
ensayos de Bernoulli en la que la probabilidad de éxito no es constante. Es utilizado por
SLAPenrich para calcular la desviación del número de muestras observadas con mutaciones en
una vía dada desde su expectativa a través de una asignación de valor P correspondiente.
La extracción de ADN se realizó con QIAmp DNA Mini kit (Qiagen). La preparación de la biblioteca
se realizó con el Oncomine Focus Assay (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Después de la codificación de barras, las bibliotecas se igualaron a 100 pM. La
plantilla de secuenciación se preparó usando el IonPGMSequencing 200 Kit v2 y se secuenció en
un chip Ion Select 318 usando el PGM Sequencing 200 Kit v2 con 500 flujos. Las mutaciones de
hotspot en 35 genes se seleccionaron usando el Oncomine Focus Assay (Thermo Fisher) (Tabla
Suplementaria S7). Variant Caller v4.0.r73742 se usó para la llamada de variante con el software
Ion Reporter. Todas las variantes filtradas también se analizaron con el software Integrative
Genomic Viewer (IGV v2.3).