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Carácter anfotérico y punto isoeléctrico de aminoácidos

Tipo de práctica: Duración: Indicaciones de peligro:

Grupal (2 personas) 4 horas

OBJETIVOS
 Comprobar el carácter anfotérico de los aminoácidos.
 Determinar los valores de pK de los grupos ionizables de un aminoácido.
 Hallar el punto isoeléctrico de un aminoácido.

Conceptos relacionados: constante de acidez, curva de titulación aminoácidos, pH

FUNDAMENTO TEÓRICO
Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas. Todos los aminoácidos
poseen un grupo ácido (-COOH) y un grupo básico (-NH2), por tal razón, todos los
aminoácidos libres presentan características ácido-base. En la célula los aminoácidos
predominan en forma de ion dipolar o zwitterion (del alemán ion híbrido). En la forma
dipolar el grupo carboxilo se encuentra disociado (-COO-) y el grupo amino protonado (-
NH3+), pero la carga de la molécula es neutra. Un zwitterion puede actuar como un ácido
o como una base cediendo o aceptando protones. La protonación o desprotonación de los
grupo amino y carboxilo depende del pH. Para la glicina el pKa para el grupo carboxilo es
de 2,3 y del amino es 9,6. Esto significa que a pH inferior a 2,3 los grupos carboxilo y
amino estarán protonados y la carga neta de la molécula será positiva. A pH entre 2,3 y
9,6 el grupo carboxilo estará desprotonado y el grupo amino protonado, siendo la carga
neta del aminoácido cero. A pH superior a 9,6 ambos grupos estarán desprotonados,
siendo la carga neta negativa. Dado que los grupos ionizables de los aminoácidos son
ácidos relativamente débiles podemos aplicar la ecuación de Henderson-Hasselbalch para
calcular la fracción de cada grupo que se encuentra ionizada a un determinado pH.
 A 
pH = pK a + log , donde A-: aceptor de protones y HA: donor de protones
 HA

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El grupo α-carboxilo tiene un pKa entre 1,8 y 2,5, mucho más bajo que el pKa del ácido
acético (pKa = 4,8). Esto se debe al efecto inductivo que ejerce el grupo amino que al
estar protonado atrae hacia sí los electrones del grupo carboxilo favoreciendo su
desprotonación. Para un grupo carboxilo que tenga un pKa de 2,0 la razón de forma
desprotonada a forma protonada a pH 7 será de 100.000 a 1, es decir, a pH fisiológico la
forma predominante es la de anión carboxilato.

Para el grupo amino el valor de pKa varía entre 8,7 y 10,9. Así, para un grupo amino cuyo
pKa sea de 10,0 la razón base/ácido será de 1/1000 a pH 7. Estos datos confirman el
hecho de que la forma predominante a pH neutro para los aminoácidos es la forma de
zwitterion (neutro).

MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales Reactivos
Vaso de precipitados 50 mL L-alanina 0,05 M
Tubos de ensayo L-lisina 0,05 M
Buretas de 25 mL Hidróxido de sodio 0,025 M (titulado)
Pipetas de 1 mL Ácido clorhídrico 0,025 M (titulado)
Agitador magnético Fenolftaleína al 0,5% m/v (en etanol al 95%)
pH-metro Azul de timol 0,1% m/v (en etanol al 20%)

PROCEDIMIENTO

 Titulación de aminoácidos
 Tome 5 mL de la solución acuosa del aminoácido L-alanina 0,05 M en un Erlenmeyer.
Calibre el pH-metro y mida el pH inicial de la solución. Registre los datos en una tabla
de resultados. Adicione dos gotas de un indicador adecuado e inicie la titulación
adicionando 0.5 mL de HCl 0.025 M y registre el pH de la solución resultante.
Continúe adicionando HCl en alícuotas de 0.5 mL y registrando el valor del pH hasta
obtener un valor de pH de 1.5. Construya una tabla y registre los valores de pH y el
volumen de ácido adicionado.

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 Lave el electrodo con agua destilada. Siguiendo el procedimiento anterior, tome 5 mL
de la solución de L-alanina 0,05 M y titule con NaOH 0,025 M hasta alcanzar un pH de
12,5. Para cada volumen de NaOH adicionado, registre el valor de pH de la solución
resultante.
 Repita todo el procedimiento utilizando la solución de L-lisina 0,05 M.

 Disposición final de los residuos generados en la práctica. Todos deben ser

depositados en el recipiente indicado para tal fin.

CUESTIONARIO PREVIO AL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1. Consulte los valores de pK de los grupos carboxilo y amino correspondientes al
aminoácido L-alanina y L-lisina. Para cada aminoácido, determine el punto isoeléctrio
(pI) y el pH de una solución 0,05 M. Haga los cálculos suponiendo que el aminoácido
se encuentra como clorhidrato. Hágalos también considerando que el aminoácido se
encuentra como la sal de sodio.
2. Haga los cálculos para la titulación de 5 mL de solución 0,05M del aminoácido L-
alanina, considerando que adiciona alícuotas de 1 mL de HCl 0,05M hasta pH 1,5.
3. Haga los cálculos para la titulación de otros 5 mL de solución 0,05 M del mismo
aminoácido considerando que adiciona NaOH 0,05 M hasta pH 12,5.
4. Haga una gráfica de la curva de titulación para el aminoácido y dibuje las estructuras
del aminoácido a pH 1.5, en el punto isoeléctrico, y a pH 12.5.
5. Incluya una respuesta a las siguientes preguntas de consulta:
a. ¿Pueden comportarse los aminoácidos como un buffer intracelular? ¿Por qué? ¿En
qué rangos de pH? Argumente su respuesta. Tenga en cuenta el rango de valores
del pKa de los grupos carboxilo y amino de los 20 aminoácidos.
b. ¿Cómo separaría los aminoácidos R, H, D y E de una mezcla a pH 7?
c. Calcule el pI del péptido N-E-A-L.

PARA EL INFORME DE LABORATORIO:

o Construya una tabla de datos y los gráficos correspondientes a las curvas de titulación
de pH versus miliequivalentes de HCl y de NaOH adicionados para cada aminoácido.
Analice e interprete sus resultados.

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o De las respectivas curvas de titulación, determine los valores de pKa y el pI de los
aminoácidos utilizados. Además, calcule la fracción ionizada de los diferentes grupos a
pH 7 (utilice la ecuación de Henderson-Hasselbalch).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Segel, I. H. 1976. Biochemical Calculations. How to Solve Mathematical Problems in

General Biochemistry.Second Edition. John Wiley & Sons, Inc., New York.
2. Boyer, R. 2000. Modern Experimental Biochemistry. Addison Wesley Longman, San
Francisco.
3. Nelson, D. L., Cox, M. M. 2000. Lehninger Principles of Biochemistry, Worth Publishers,
Third Edition, New York.