Rodríguez Álvarez Alfonso Laboratorio de genética y toxicología 01/03/2018

Resumen del artículo: Label-free detection of EcoRI endonuclease activity via

fluorescentDNA logic gate
Xiafei Zhang, Rui Cheng, Zhilu Shi, Yan Jin∗

Las enzimas o endonucleasas de restricción pueden reconocer y cortar en sitios específicos de las
secuencias del DNA. Esta función específica es esencial los campos de la farmacología y la
biotecnología para para catalizar procesos de replicación, recombinación, reparación de DNA,
clonación molecular, entre otras funciones. La EcorI, es una enzima de restricción ampliamente
utilizada en los laboratorios de biología molecular y actualmente se siguen estudiando su actividad
e inhibición por medio de ELISA, HPLC, electroforesis en gel, microscopia de fuerza atómica, estudios
electroquímicos y métodos colorimétricos, teniendo todos estos en común el excesivo uso de
tiempo, de DNA, entre otras desventajas. Por esto se busca encontrar otro método que represente
ventajas en comparación a los anteriormente mencionados y debido al aumento en el uso de
técnicas con el uso de la fluorescencia se prosiguió a desarrollar esta nueva metodología.

Se diseñó un “logic gate”, la cual es una molécula que realiza una operación lógica en base a
inductores químicos o físicos produciendo un efecto. En este caso se utilizaron K+ y EcoRI como
inducciones, así como para el doblez del DNA en cuádruplo y la señal de fluorescencia de N-methyl
mesofosforína IX (NMM) como efecto. Esto fue utilizado debido a la regulación de la fluorescencia
de los inductores previamente mencionados. El análisis de resultados se llevó a cabo por medio de
la medición de fluorescencia, para la cual primero se llevó a cabo n ensayo para la actividad de EcorI,
una espectroscopia de dicroísmo circular la cual mide la diferencia entre la absorción de luz
polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha por compuestos ópticamente activos, así como
una electroforesis en gel y una evaluación del inhibidor de EcorI

Los resultados indicaron que la medición de fluorescencia fue exitosa ya que por medio de los
inductores fue posible modificar la intensidad de la fluorescencia que generaban de manera intensa
el NMM y el cuádruplo de DNA. Se obtuvo un rango lineal de 0.0001 U/µL a 0.03 U/µL con un límite
de detección de 6.8x10-5 U/µL.

Conclusión

Se logró desarrollar un método para el monitoreo cuantitativo de la actividad e inhibición de la

enzima de restricción EcoRI, esto en base al análisis de fluorescencia que en comparación con los
otros métodos reportados, no utiliza técnicas ni modificaciones sofisticadas.

Bibliografía

Zhang, X., Cheng, R., Shi, Z., & Jin, Y. (2017). Label-free detection of EcoRI endonuclease activity via
fluorescent DNA logic gate. Sensors and Actuators B: Chemical, 244, 387-392.
doi:10.1016/j.snb.2016.12.144