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EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE MATERIAL VEGETAL (PIMENTÓN)

Cortés D.F, Parra D.F.

Biotecnología Animal 2018-1. Departamento de Producción Animal. Facultad de Medicina


Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia.

Isolation and Visualization of Nucleic Acid with Homemade Apparatus

RESUMEN
Se tomaron muestras de tejido vegetal en este caso de Pimentón para extraer ADN y
posteriormente realizar una electroforesis para visualizar los diferentes fragmentos de ADN
presentes en la muestra y cuan grandes son respecto a otros, además, determinar el tamaño
absoluto de los fragmentos de ADN examinados en el laboratorio. Cada grupo de estudiantes
de la materia de Biotecnología Animal, realizó los correspondientes procedimientos para
luego comparar con las demás muestras obtenidas. Cabe aclarar que estas pruebas se
realizaron netamente con fines académicos. Se realizó en el laboratorio de morfofisiologia
animal de la facultad de medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional.

ABSTRACT
Samples of plant tissue were taken in this case of Pimentón to extract DNA and then perform
an electrophoresis to visualize the different DNA fragments present in the sample and how
large they are with respect to others, in addition, determine the absolute size of the DNA
fragments examined at the laboratory. Each group of students in the field of Animal
Biotechnology, made the corresponding procedures to then compare with the other samples
obtained. It should be noted that these tests were conducted clearly for academic purposes. It
was carried out in the animal morphophysiology laboratory of the Faculty of Veterinary
Medicine and Zootechnics of the National University.

INTRODUCCIÓN
El presente informe contempla una serie de pasos que describiremos detalladamente a
continuación y la publicación conceptual de cada uno de los avances que se realicen en el
proceso de extracción. tras la sustracción de tejido proveniente de un Pimentón, se obtiene la
extracción del ADN, ésta requiere un orden de etapas elementales de separación en donde se
retira material que se encuentra alrededor del ADN para lograr su liberación en forma de
mota para su posterior separación. En el siguiente laboratorio, seguiremos minuciosamente
pasos adecuados para su extracción y visualización.

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en


función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas, la electroforesis de los
ácidos nucleícos es el método más empleado para separar, identificar y purificar moléculas o
fragmentos de ADN y ARN.
La extracción de ADN (ácido desoxirribonucleico) es un proceso vital con muchas
aplicaciones científicas. En la investigación y la medicina, sus usos incluyen secuenciación
del ADN, la detección de los virus y las bacterias, y la investigación de enfermedades y
trastornos con base genética. En el campo de la ciencia forense, es utilizado para la
identificación de los muertos y los vivos, así como el análisis de la escena de crimen. A pesar
de sus resultados sofisticados, la extracción de ADN es en realidad muy simple, y las técnicas
de extracción básicas funcionan igual de bien en un laboratorio de investigación o en casa. La
extracción de ADN comienza con la obtención de una muestra de ADN. Dado que todos los
organismos vivos contienen ADN, las opciones disponibles para la muestra son
prácticamente infinitas, y la elección por lo general se relaciona directamente con el tema del
objeto de estudio. El ADN humano es fácil de obtener por pequeños toques en el interior de
la mejilla con un hisopo de algodón. Las muestras de plantas pueden ser adquiridas cortando
una sección del material de origen.
El ácido desoxirribonucleico es una molécula que permite la continuidad y evolución de las
especies, el ADN almacena la información genética codificada, está presente en todas las
células de los seres vivos, por lo que siempre tiene la misma composición (acidos fosforicos,
bases nitrogenadas y pentosas). Para la extracción de las células donde se halla confinado, se
debe llevar a cabo una serie de pasos previos analiticos y diagnosticos los cuales llevaremos a
cabo, junto con ciertas precauciones de contacto que evitaran la contaminación por material
biológico, microbiológico y químico.

METODOLOGÍA
Materiales
● Pimentón
● Detergente y Sal común, se usaron en conjunto para crear una solución de lisis
● Macerador, se usó para homogeneizar la muestra
● Etanol refrigerado, se usa para precipitar y recuperar la mayor cantidad de ADN de la
muestra
● Centrifuga, la fuerza centrífuga deja el ADN difundido en una capa de la solución por
encima del exceso de material más pesado.
● Micropipetas
● Tubos de eppendorf
● Camara de electroforesis,La cámara de electroforesis usa una técnica para la
separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico. La
separación se realizó sobre un gel de agarosa.
● Agarosa, el gel de agarosa se comporta como un tamiz molecular y permiten separar
moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de
diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de
agarosa
● Fluorocromo SYBR Green, se usa como colorante para la cuantificación y
visualización de ADN en la electroforesis
● TBE 1X, de uso frecuente en electroforesis, en especial en gel de agarosa para separar
ácidos nucleicos.
● TE, el propósito del tampón TE es solubilizar el ADN o el ARN, al mismo tiempo que
lo protege de la degradación.

Figuras 1 y 2. Muestra de pimentón macerado y con la solución de lisis en el tubo de eppendorf, para posteriormente
centrifugar la muestra.

Figuras 3, 4 y 5. Centrifugadora; después de centrifugar la muestra se retiró la solución de lisis, después de que la muestra
estaba seca se agregó Etanol, en el cual se puede observar una pequeña “mota” que en nuestro caso es una hebra de ADN.
Figuras 6 y 7. Fluorocromo SYBR Green que se usa como colorante para la cuantificación y visualización de ADN en la
electroforesis; Tampón TBE 1X, de uso frecuente en electroforesis, en especial en gel de agarosa para separar ácidos
nucleicos.

Figuras 8 y 9. La cámara de electroforesis usa una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un
campo eléctrico. La separación se realizó sobre un gel de agarosa.

Procedimiento Experimental
Primero se extrajo una muestra del material vegetal (Capscium annuum), su introdujo la
muestra en un tubo eppendorf junto con 500 ųl de solución lisis, la cual consistió en una
solución de 10 ml de detergente de cocina y una cucharada sopera de NaCl en 100 ml de
agua. Se homogeneizó la muestra con la ayuda de un tubo macerador, se incubaron los tubos
a 60ºC por 15 min en un baño maria. Se centrifugó la muestra en la microcentrifugadora
durante 5 min, se filtró y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo, agregando etanol en
una proporción de 2:1, revolviendo la solución y descartando el sobrenadante para
posteriormente secar la muestra. Se agregaron 200 ųl de solución XTE, se agregó TBE 1x a la
cámara de electroforesis y posteriormente se agregaron 2 ųl de fluorocromo SYBR Green
mezclado con 10 ųl de muestra, por último se aplicó el marcador de peso molecular conocido
lambda DNA Hind III.
RESULTADOS

Figura 10. Las cinco muestras de ADN tomadas, junto con el marcador de peso molecular Lamda DNA Hind III, vistas
desde un espectrómetro de UV visible.

DISCUSIÓN
La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN, pero que debido a los requerimientos de equipos y
de espacios adecuados no se lleva a cabo algunas veces en la enseñanza de las ciencias
biológicas, sin embargo la metodología usada en el presente experimento demuestra que
dichas limitaciones son fácilmente superables mediante el uso de elementos fácilmente
accesibles y sin ningún riesgo biológico como el bromuro de etidio, que es ampliamente
utilizado para la visualización de ADN y es este un reactivo altamente tóxico, sin embargo en
la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como el utilizado SYBR Green I,
desarrollados específicamente para reducir los riesgos (Duque, 2009)

La determinación de la calidad del ADN extraído se suele hacer con base en el grado de
degradación, ya que un ADN de alto peso molecular aparece como una banda definida en la
parte superior del gel a poca distancia de los pozos, mientras que el material parcialmente
degradado forma un barrido de fragmentos pequeños a lo largo del pozo (Valadez y Kahl;
2000).
En las muestras 1,2,3 y 5 tomadas de Capscium annuum se obervan bien definidas las bandas
patrón (Figura 10) lo que demuestra una gran concentración de ácidos nucleicos de buena
calidad, sin embargo en la muestra 4 no se aprecia una adecuada diferenciación de
fragmentos debido a una menor concentración de ADN, posiblemente producto de un error en
el procedimiento experimental tanto en la toma de la muestra de material vegetal, el
macerado de la misma como en la concentración de los diferentes reactivos empleados. Los
patrones del marcador de peso molecular (M) se observan difusos, debido a que los geles de
agarosa permiten una electroforesis rápida, sin embargo poseen una resolución limitada por
cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse (M.
Somma).

Aunque el marcador de peso molecular Lambda DNA/HindIII Marker empleado no está


diseñado para la cuantificación precisa del ADN, si puede utilizarse para una cuantificación
aproximada, dado que las bandas de la mayoría de muestras concuerdan con el segundo
fragmento del marcador de peso molecular, se estima que el ADN de la muestra obtenida se
compone aproximadamente de 9416 bp y posee una masa de 97.1 ng/0.5μg

CONCLUSIONES
● La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas en
función de su carga, tamaño y forma.
● A pesar de que la electroforesis en gel de agarosa sea una técnica simple y fácil, posee
dotes de separación eficaces.
● Mediante la realización de este laboratorio, observamos y analizamos cómo cada uno
de los materiales tienen su propia función. La solución de lisis sirve para romper la
membrana plasmática y nuclear e incluso la pared celular. El alcohol etílico sirve para
precipitar el ADN.

REFERENCIAS
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Valadez, E; Kahl, G. 2000. Huellas de ADN en genomas de plantas: teoría y protocolos de laboratorio. Mundi-

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