Capítulo 2

Métodos
de la míuobiología
I omo resultado del pequeño tamaño de los microorganismos, la cantidad de informa-
V ción que puede obtenerse acerca de sus propiedades a partir del examen de los indí-
víduos es limitada; en la mayoría de los casos el microbiólogo estu diapoblaciones que con-
tienen millones o miles de millones de individuos. Tales poblaciones se obtienen al hacer
crecer los microorganismos, en condiciones más o menos bien definidas, como cultivos.
Un cultivo que contiene solamente una clase de microorganismo se conoce como cultívo
puro o axéníco. Un cultivo que contiene más de una clase de microorganismo se conoce
como cultívo míxto: en el caso especial de que contenga sólo dos clases de microorganis-
mos, deliberadamente mantenidos en mutua asociación, se trata de un cultivo bímembre.
La esencia de la microbiología la integran, por lo tanto, dos clases de operaciones: el
aíslamíenfo, que es la separación de un microorganismo determinado de las poblaciones
mixtas que existen en la naturaleza,y elcultivo, que es el crecimiento de poblaciones micro
bianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) bajo condiciones de laboratorio. Estas
dos operaciones entran en juego sin tener en cuenta la clase de microorganismo que está
manejando el microbiólogo; sonbásicamente iguales para el estudio de los virus, las bacte-
rias, los hongos, las algas y los protozoos e incluso para el de pequeños invertebrados. Ade-
más, en los últimos años se han extendido a los estudios de aislamiento de lineas de células
o de tejidos derivados de animales y plantas (cultívo de tejidos). La unidad de la microbio-
logía como ciencia, a pesar de la diversidad biológica de los organismos de que se ocupa, se
deriva de su base operativa común.
1g
TECNICAS DEL CULTIVO PURO
L..s ricroorganismos son ubicuos, por lo que la prepara-
::..: de un cultivo puro implica no sólo el aislamiento de
u¡, Jeterminado microorganismo a partir de una pobla-
;ior microbíana natural mixta, sino también el manteni-
nienio del individuo aislado y de su descendencia, en un
a:biente artificial al que se impide el acceso de otros
:i,-rercrganismos. Los microorganismos no requieren mu-
r.r,-1 3SpBCio para su desarrollo; de ahí que pueda crearse
.:: anbiente artificial dentro de los confines de un tubo
Ce ensal'o. de un matraz o de una placa de Petri, los tres
u¡os de recipientes más comúnmente utilizados para
::::ivar microorganismos. El recipiente de cultivo debe
es'"a¡ inicialmente estéril (libre de microorganismos vi-
'. t-S ) )' después de la introducción del tipo de microorga-
:l:s:no deseado debe estar protegido de una posterior
Ju-r'rtarTlinación externa. La fuente primaria de contami-
::a¡ion externa es la atmósfera, que siempre contiene mi-
,-:'oorganismos en suspensión. La forma de una placa de
Petri con su tapadera que la recubre está especialmente
Jiseñada para evitar la contaminación procedente de la
almosfera. La contaminación de los tubos y matraces se
evita al taponar sus orificios con un cierre apropiado.
Generalmente se usa un tapón de algodón, aunque aho-
ra se utilizan con frecuencia cubiertas metálicas o tapas de
ir-rSCE de plástico, especialmente para los tubos de ensayo.
La superficie externa de un recipiente de cultivo está,
r:: supuesto. sometida a contaminación y el interior del
del tubo puede contaminarse cuando se abre
=.zvaz o
: a:a inuoducir o retirar el material. Este peligro se redu-
--e al mrnimo pasando el orificio por la llama de un
:e-'.rero. inmediatamente después de retirar el tapón y,
:e :uevo. justo antes de volverlo a colocar.
El inóculo (es decir, el material microbiano utili-
z aJc para sembrar o inocular un recipiente de cultivo) se
:::oCuce generalmente con un hilo de metalo ((asa)) que
:' :apidamente esterilizada en una llama, inmediata-
:.31:e antes de ser utilizada. La t¡ansferencia de culti-
'.¡s irquidos puede hacerse también con pipetas. Para
3 s:e l-in. el extremo de la pipeta por donde se aspira se ta-
]lra con algodon y la pipeta se esteriliza envuelta en pa-
F. c dentro de recipientes metálicos o de vidrio, que
:ar'.ienen tanto la superfrcie interna como la externa li-
::es de contaminación hasta el momento de su utili-
z:.'ion.
Los riesgos de contaminación accidental pueden re-
Cucirse. además. transfrriendo los cultivos en una cam-
pana o una pequeña habitación cerrada cuyo aire ha sido
esp'ecialmente tratado para reducir su contenido en mi-
:roorsanismos. También pueden necesitarse campanas
especiales -y otras precauciones para evitar la liberación
::.-idental del organismo. si éste causa enfermedad, o si
Métodos de la microbiología
ha sido producido uülizando las técnicas del DNA re-
combinante (véase el capitulo I l).
Aislamiento de cultivos puros
por métodos de siembra en placa
La manera más fácil de obtener cultivos puros de los mi-
croorganismos que forman colonias discretas sobre me-
dios sólidos (como, porejemplo,lamayoríade las bacte-
rias, levaduras, muchos hongos y las algas unicelulares)
se lleva a cabo utilizando una de las modificaciones del
método de siembra en placa. Este método implica la se-
paración e inmovilización de los organismos particula-
res sobre o dentro de un medio nutriüvo solidificado por
agar o algún otro agente gelificante adecuado. Cada or-
ganismo viable da origen, al multiplicarse, a una colonia
de la cual pueden hácerse transferencias fácilmente.
Lasíembra por estría es, en general, el método más
útil de sembrar en placa. Un alambre con un aro en la
punta (<asa de cultivo>) se esteriliza e introduce en una
suspensión, convenientemente diluida, de organismos y
se utiliza luego para hacer una serie de estrías paralelas,
no superpuestas, sobre una placa de agar previamente
solidificada. El inóculo se va diluyendo progresivamen-
te con cada estría sucesiva, de tal manera que si las es-
trías iniciales proporcionan un crecimiento confluente, a
lo largo de las últimas estrías se van desarrollando colo-
nias bien aisladas (figura 2.1). Alternativamente, los ais-
lamientos pueden hacerse con placas sembradas por
vertido, para lo cual sucesivas diluciones del inóculo se
van colocando en placas de Petri estériles y se van mez-
clando con el medio de agar fundido, pero enfriado, que
se deja entonces solidificar. Las colonias subsiguientes
se desarrollan incorporadas en el agar.
FIGURA 2.1
Aislamiento de un cultivo puro
por el método de siembra por
estría. Una placa de Petri conte-
niendo agar nutritivo fue sem-
brada por estría con una sus-
pensión de células bacterianas.
Como resultado del desarrollo
posterior, cada célula dio ori-
gen a una colonia visible ma-
croscópica me nte.
El aislamiento de bacterias anaeróbicas por los mé-
todos de siembra en placa plantea problemas especia-
les. Siempre que los organismos en cuestión no mueran
rápidamente al ser expuestos al oxígeno, las placas pue-
den prepararse de la manera usual y luego incubarse en
recipientes cerrados, de los cuales se elimina el oxigeno
bien sea por absorción quimica o por evacuación. Para
Métodos de la microbioloqía
los anaerobios más sensibles al oxigeno, es preferible
una modificación del método de siembra porvertido, de-
nominado cultivo por dilución y agitación. Un tubo con
agar fundido y enfriado se inocula y se mezcla; aproxi-
madamente la décima parte de su contenido se transfie-
re a un segundo tubo el cual se mezcla a su vez y se utili-
zaparainocular un tercer tubo de la misma manera. Des-
pués de haber preparado de 6 a l0 diluciones sucesivas,
los tubos se enfrían rápidamente y se cierran hermética-
mente vertiendo sobre la superficie unh capa de vaselina
y parafina, con el fin de evitar así el acceso del aire a la
columna de agar(figura 2.2).Enestos cultivos,las colo-
nias'se desarrollan en profundidad dentro de la columna
de agar, y por lo tanto no son tan fácilmente accesibles.
Para hacer una transferencia de colonias se elimina el
cierre de vaselina-parafina con una aguja estéril y la co-
lumna de agar se extruye del tubo soplando suavemente
una corriente de gas libre de oxigeno a través de una pipe-
ta capilar introducida entre la pared del tubo y el agar. La
columna extruida se recoge en una placa de Petri estéril y
se secciona en discos con una cuchilla estéril, a fin de
permitir el examen y transferencia de las colonias.
Muchas bacterias mueren al ser expuestas aunque
sólo sea momentáneamente al aire; por lo tanto, el culüvo
con éxito de estos anaerobíos estríctos, como se les de-
nomina, exige medidas extraordinarias para excluir, en
todo momento, incluso trazas de oxígeno. Habitualmen-
te se utilizan dos técnicas principales para el cultivo de
bacterias en completa ausencia de oxígeno; son las técni-
cas del tubo rodante y las de lacómara anaeróbica con
19
FIGURA 2.2
Aislamiento de un cultivo puro de
bacter¡as anaeróbicas por el méto-
do de dilución en tubo. Puede ver-
se aquf una serie completa de dilu-
ciones. Obsérvese el crecimiento
confluente en los tubos más den-
samente sembrados (a la derecha)
), las colonias bien aisladas en los
dos tubos finales de la serie (a la iz-
quierda). Después que el agarhubo
solidificado, se cerró herméticamen-
te cada tubo con una mezcla de va-
selina y parafina estériles, para evi-
tar el acceso de oxfgeno atmosféri-
co que inhibe el crecimiento de las
bacterias anaeróbicas.
guantes. El procedimiento del tubo rodante, desarrolla-
do por R. E. Hungate, se usa para obtener cultivos puros
de anaerobios estrictos distribuyendo células en una fina
capa de agar depositado en la pared de un tubo de en-
sayo, en donde se desarrollan como colonias aisladas. El
tubo de ensayo contiene unos pocos mililitros de medio
con agar fundido que ha sido reducido quimicamente
para eliminar el oxígeno disuelto; el tubo es cerrado her-
méticamente con un tapón de goma de butilo (a través de
la goma ordinaria pasan pequeñas, pero letales, canti-
dades de oxígeno). El agar fundido se inocula con dilu-
ciones apropiadas de la fuente de bacterias, introducíén-
dolas a través de los tapones de goma con unajeringaes-
teril. [,os tubos se depositan luego tumbados sobre hielo
y se los hace rodar hasta que el agar se solidifica forman-
do una capa fina en la pared del tubo. Después de un perío
do de incubación, cuando las colonias son ya visibles, se
quita el tapón y las colonias aisladas se recogen con
una aguja o con un tubo capilar. Siempre que se destapa
un tubo, se impide la entrada de aire pasando continua-
mente una corriente de gas libre de O, (normalmente
CO2 ó Nr) al interior del tubo. Para asegurarse de que no
ha penetrado algo de aire inadvertidamente, se suele in-
cluir en el medio el colorante sensible al redox resazurí-
na, que vira de incoloro a rojo cuando el En alcanza un
valor de -0.042 V.*
* E. es el potencial de reducción efectivo de un medio. resul tante d: : : - - :.: -
.
ción entre la forma oxidada y la reducida de todos los compu:sr:: :: - ::
dad redox. Al construirmedios para el cultivo de anaerobics esr :: : : : :. :'
cial redox se baja mediante la inclusión de agentes r'¡..r::--: '-:-.
20
También pueden aislarse anaerobios estrictos utili-
zando las técnicas convencionales de siembra por estría
en placa, si se realizan todos los procedimientos dentro
de una cámara anaeróbíca,* que contiene una atmós-
fera reductora.
Si se quiere aislar un microorganismo a partir de una
población natural mixta, con frecuencia resulta posible,
siempre que la técnica sea buena, preparar una primera
serie de placas o de tubos sembrados por dilución en la
que muchas de las colonias desarrolladas estén bien se-
paradas unas de otras. Si se toma entonces material de
una de estas colonias y se transfiere a un medio apropia-
do, ipuede llamarse a esto cultivo puro? Aunque esto es
lo que se hace con frecuencia, un cultivo aislado de esta
manera puede distar mucho de ser puro. Es probable que
se inicie una colonia particular por dos macroorganis-
mos semejantes sembrados juntos en la placa para dar
una colonia mixta. Además, como los microorganismos
varian enonnemente en cuánto a sus requerimientos,
ningún medio y conjunto único de condiciones de creci-
miento permitirá el desarrollo de todos los microorganis-
mos presentes en una población natural. Ciertamente, es
probable que sólo una pequeña fracción de los microor-
ganismos inicialmente presentes sea capazde formarco-
lonias en cualquier medio dado. De ahí que pueda haber
miles de microorganismos que se depositaron también
enla superficie del agaryqué aunque nolograronuncreci-
miento visible macroscópicamente sigan siendo viables.
La probabilidad de que algunos de estos microorganis-
mos sean tomados y transferidos es muy elevada. Nun-
ca se debe tomar la colonía de una prímera placa para
preparar un cultivo puro. En lugar de esto, se debe sem-
brar por estría una segunda placa, utilizando una suspen-
sión preparada a partir de una colonia bien aislada. Si
todas las colonias de esta segunda placa resultan idénti-
cas, una colonia bien aislada de éstas puede ya utilizarse
para establecer un cultivo puro.
No todos los microorganismos capaces de crecer so
bre medios sólidos dan origen necesariamente a colonias
bien aisladas. Ciertas bacterias flageladas móviles (Pro-
teus, Pseudomonas, por ejemplo) pueden extenderse rá-
pidamente por la superficie ligeramente húmeda de la
placa recién preparada. Esto puede evitarse mediante el
uso de placas con la superficie bien seca, en las que las
células quedan inmovilizadas. Las espiroquetas y los or-
ganismos que muestran movimientos de deslizamiento
(mixobacterias, cianofíceas) pueden moverse sobre un
gel de agar o a través de é1, incluso cuando su superficie
está bien seca. En tales casos, el movimiento de los orga-
nismos en cuestión sirve de ayuda para su purificación,
* Una cámara anaeróbica es una caja hermética dentro de la cual se manejan
los objetos con las manos insertadas en unos guantes de goma unldos a la parte
frontal de la unidad. Una lámina transparente permite ver las manipulaciones
desde el exterior.
Métodos de la microbiología
ya que pueden separarsede otras clases de microorganis-
mos inmovilizados en el agar. Por lo tanto, la puriFrca-
ción puede conseguirse, en estos casos, permitiendo que
tenga lugar la emigración y transfiriendo repetidamente a
placas nuevas la parte que se adelanta del borde de la pe
blación emigrante.
La incorporación al medio de sustancias selecüva-
mente inhibidoras es también, a veces, de gran utilidad
cuando se hacen aislamientos de la naturaleza. A causa
de su especiFrcidad biológica, ciertos anübióticos son
especialmente úüles para este fin. Las bacterias varían
mucho en cuanto a su sensibilidad al anübiótico peni-
cilina, el cual puede utilizarse, por consiguiente, a ba-
jas concentraciones para impedir el desarrollo de las
bacterias sensibles existentes en la población inicial. A
concentraciones más elevadas, la penicilina es general-
mente tóxica para los organismos procarióticos, pero no
lo es para los eucarióticos. Es, pues, un agente de gran
utilidad para la puriflrcación de protozoos, hongos y al-
gas que estén contaminados con bacterias. Por el con-
trario, los organismos procarióücos son insensibles a
los antibióticos poliénicos, tales como la nistaüna, que
son generalmente tóxicos para los organismos eucariG
ticos. La incorporación de esta clase de anübióticos
al medio de aislamiento puede utilizarse a veces para
fa'cilitar la purificación de bacterias fuertemente conta-
minadas por hongos o amebas. Son muchas las variacie
nes sobre el tema de la toxicidad selectiva que pueden ser
utilizadas para facilitar aislamientos por medio del méte
do de siembra en placa.
Aislamiento de cultivos puros
en medios líquidos
Los métodos de siembra en placa son, en general, satis-
factorios para el aislamiento de bacterias y hongos, por-
que la gran mayoria de los representantes de estos gru-
pos pueden crecer bien en medios sólidos. Sin embar-
go, algunas de las bacterias de mayores tamaños ce-
lulares no han sido todavía cultivadas con exito en me-
dios sólidos, y muchos protozoos y algas son sólo también
cultivables en medio líquido. Aunque los métodos de
siembra en placa para el aislamiento de los virus se ha ex-
tendido mucho durante los últimos años, la manera más
fácil de aislar muchos de estos organismos consiste en el
uso de medios líquidos. En el caso de los vinrs, por su-
puesto que nunca se puede obtenerun cultivopuro' yaque
estos organismos son parásitos intracelulares obligados;
un cultivo bimembre, formado por un virus especifico y
su hospedador biológico, representa la meta de purifica-
ción para este grupo.
El sistema más sencillo de aislamiento en medios lí-
quidos es el método de las dilucíones. El inóculo se so-
 Vetodos de la microbiología
a una dilución en serie utilizando un medio estéril
i=€te
s: :nocula un gran número de tubos de medio con par-
ahcuotas de cada una de las diluciones sucesivas. El
=s
rcjeto de esta operación es inocular una serie de tu-
:--s con una suspensión microbiana tan diluida que la
::.-oabilidad de introducir siquiera un sólo individuo den-
:c de un tubo dado es muy pequeña: una probabilidad del
.tden 0,05. Cuando se siembra un gran número de tubos
:,1n un inóculo de estas dimensiones, puede calcularse
:ediante la teoría de probabilidades, que la fracción de
:-:bos que recibe un organismo es 0,048; la fracción que
:e:jbe dos organismos es 0,0012;lafracción que recibe
:es organismos es 0,00002. Como resultado de ello, si
;i tubo muestraa lgo decrecimiento subsiguiente, existe
:ra elevada probabilidad de que este crecimiento sea el
:esultado de la introducción de un solo organismo. La
probabilidad de que el crecimiento se haya originado a
panir de un solo organismo disminuye rápidamente a El fin que se pretende con el aislamiento es, normalmen-
nedida que aumenta el número medio de organismos en
el inóculo. Por lo tanto, es esencial aislar a partir de una
serie de tubos cuya gran mayoría no muestre ningún cre-
;imiento.
El método de las diluciones tiene, sin embargo, una
gran desventaja: sólo puede utilizarse para aislar el miem-
bro predomínante numéricamente de una población mi-
crobiana mixta. Casi nunca puede ser utilizado de mane-
ra eficaz para el aislamiento de microorganismos gran-
des que no crecen en medios sólidos (por ejemplo, proto-
zoos o algas) porque, por regla general, en la naturaleza
estos microorganismos se hallan en un número muy infe-
rior al de las bacterias. De ahí que la utilidad del método
de las diluciones sea limitada.
Cuando no puede aplicarse ni el método de siembra
en placa ni el de las diluciones, la única alternativa con-
siste en recurrir alaislamiento, microscópicamente con-
trolado, de una sola célula u organísmo a partir de la
poblacíón míxta, técnica conocida por el nombre de aís-
lamiento de una sola célula. La diFrcultad técnica del
aislamiento de una sola célula está en razón inversa alta-
maño del organismo que se quiere aislar; es relativamen-
te fácil de utilizar con microorganismos de tamaño celu-
lar grande, tales como algas y protozoos, pero resulta
mucho más dificil con bacterias.
En el caso de microorganismos grandes, la purifica-
ción implica la captura de un solo individuo con una pi-
peta capilar y la subsiguiente transferenciade este indivi-
duo, a través de varios lavados en volúmenes relativa-
mente grandes de medio estéril con el frn de eliminar los
contaminantes microbianos de menor tamaño. Las ope-
raciones sucesivas pueden realizarse a mano, controlán-
dolas por observación microscópica directa a aumentos
relativamente bajos, tales como los que ofrece un micros-
copio de disección.
La técnica de la pipeta capilar no se puede aplicar si
21
el organismo que se quiere aislar es tan pequeño que no
puede ser observado con aumentos de 100 diámetros o
menos, ya que no se puede conseguir la finura del control
necesaria para manipular directamente con una pipeta
capilar a aumentos más elevados. En este caso, puede
usarse un artificio mecánico, conocido con el nombre de
micromanipulador, junto con instrumentos de vidrio muy
finos, especialmente preparados. Un micromanipulador
es en esencia un reductor que permite efech¡ar con los
instrumentos movimientos muy suaves y precisamente
controlados sobre un área de operación muy pequeña
(una microgota) y bajo continua observación microsce
pica a elevados aumentos (500 a 1000 X).
Cultivos bimembres
te, la obtención de un cultivo puro. Sin embargo, existen
ciertos casos en los que no puede lograrse esto, o en los
que conseguirlo es tan dificil que no resulta práctico.
En tales circunstancias la alternativa consiste en ob-
tener el mejor grado de purificación en forma de culti
vo bímembre, el cual contiene solamente dos clases de
microorganismos. Como ya se ha dicho, un cultivo bi-
membre es, en principio, la única forma posible para
mantener los virus, ya que estos organismos son todos
parásitos intracelulares obligados de organismos celu-
lares. El parasiüsmo intracélular obligado es también
característico de varios grupos de microorganismos ce-
lulares. En todos estos casos, un cultivo bimembre repre-
senta la manera más asequible que se puede conseguir para
el cultivo bajo condiciones controladas de laboratorio.
La mejor manera de mantener en el laboratorio mu-
chos de los protozoos que se alimentan en la naturaleza
de microorganismos más pequeños, es en forma de culti-
vos bimembres, en asociación con sus presas microbia-
nas más pequeñas que ellos. Este es, porejemplo, el caso
de los ciliados, amebas y hongos mucosos. En tales cir-
cunstancias, la asociación, probablemente, no es nunca
oblígada, ya que cuidadosos estudios de nutrición, rea-
lizados con unos cuantos representantes de estos gn¡-
pos han demostrado que pueden crecer en cultivo puro.
Sin embargo, los requerimientos de nutrición de los pre
tozoos son con frecuencia complejos en extremo. de ma-
nera que la preparación de medios para el mantenimien-
to de los cultivos puros resulta alavez dificil y laborio-
sa. Con fines de mantenimiento de rutina, y también para
muchos fines experimentales, los cultivos bimembres
son satisfactorios.
El establecimiento de un cultivo bimembre es un.:
operación que se realiza en dos fases. Primero es :'t:::-
sario establecer un cultivo puro delorganismo q.re s.:.:
de alimento(elhospedadoren el caso de los r::us .'' :: . : -'

parásitos intracelulares obligados, la presa en el caso de
los protozoos). Una vez logrado esto, el parásito o depre-
dador puede ser aislado por cualquiera de los diversos
métodos descritos (siembra en placa en presencia del or-
ganismo que le sirve de alimento, dilución en un medio
líquido, aislamiento de una sóla célula) e introducido en
el cultivo puro del organismo que sirve de alimento.
El mantenimiento con éxito de los cultivos bimembres
requiere un gran cuidado ya que es esencial mantener
un equilibrio biológico razonablemente estable entre los
dos componentes. El medio debe permitir el suficiente
desarrollo del organismo que sirve de alimento para sa-
tisfacer las necesidades del parásito o depredador, pero
no tanto que sobrepase en crecimiento a su asociado y
origine productos metabólicos que sean perjudiciales para
éste.
TEORÍA Y PRÁCTICA
DE LA ESTERILIZACIÓru
La esterilizaciónes un tratamiento quedeja el objeto tra-
tado líbre de todo organísmo vivo. Puede lograrse me-
diante exposición a agentes letales físicos o químicos o,
en el caso especial de las disoluciones, por filtración.
Para entender la base de la esterilización por agentes
letales es necesario describir brevemente la cinética de
la muerte de una población microbiana. El único criterio
válido de muerte en el caso de un microorganismo es la
pérdída irreversíble de Ia capacidad de reproducirse.
Esto se determina generalmente mediante métodos cuan-
titativos de siembra en placa, en los que los supervivien-
tes se detectan porque forman colonias. Cuando una po-
blación microbiana pura se expone a un agente letal, la
cinética de la puerte es casi siempre exponencial..eInú-
mero de supenrivientes disminuye en progresión geomé-
trica con el tiempo. Esto refleja el hecho de que todos los
miembros de la población son igualmente sensibles; la
probabilidad determina el tiempo que se requiere, de he-
cho, ¡ara la muerte de un individuo dado. Si en un siste-
ma de coordenadas se representa el logaritmo del núme-
ro de supervivientes en función del tiempo de exposi-
ción, se obüene una línea recta (figura 2.3): su pendien-
te negativa define la tasa de mortalidad.
La tasa de mortalidad nos dice solamente quéfrac-
ción de la población inicial sobrevive a un determinado
periodo de tratamiento. Para determinar el número real
de sobrevivientes es preciso conocer, además, eltamaño
inícial de la población, tal como se ilustra gráficamente
en la figura2.4. De acuerdo con esto, para establecer los
procedimientos de esterilización hay que tener en consi-
deración dos factores: la tasa de mortalidad y el tamaño
de la población inicial.
Métodos de la microbiología
Tiempo Tiempo
(a) (b)
FIGURA 2.3
Orden exponencial (logarftmico) de muerte en las bacterias. Los
mismos datos se han puesto en escala logarftmica en (a) y arit-
mética en (b); /V es el número de bacterias que sobreviven.
FIGURA 2.4
Relación entre la tasa de mortali-
dad y eltamaño de la población res-
¿ pecto al tiempo requerido para la
C''
o
destrucción de cultivos bacterianos;
A/ es el número de bacterias que so-
breviven. Los cultivos I, C V D tie-
nen idénticas tasas de mortalidad.
Tiempo El cultivo A tiene una tasa inferior.
En la práctica de la esterilización, la población mr-
crobiana que ha de ser destruida es casi siempre mixta.
Como los microorganismos difieren ampliamente en su
resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen
significativos son el tamaño de la población inicial y la
tasa de mortalidad de los miembros más resistentes dela
población mixta. Éstos son casi siempre las endosporas,
altamente resistentes, de ciertas bacterias. Por consi-
guiente, para asegurarse de la fiabilidad de los métodos
de esterilización, los objetos que se utilizan son suspen-
siones de esporas de resistencia conocida.
Teniendo en cuenta la cinética de la muerte micro-
biana, podemos formular el flrn práctico de la esteriliza-
ción mediante un agente letal de una manera ligeramente
más refinada: la probabílidad de que el objeto tratado
contenga síquiera un supervivíente debe ser infinita-
mente pequeña. Por ejemplo, si queremos esterilizar un
litro de un medio de cultivo, esta meta puede lograrse
para todos los fines prácticos si el tratamiento no deja
más de un sobreviviente por cada 106 litros. Bajo tales
circunstancias, la probabilidad de fallo es ciertamen-
te muy pequeña. L,os procedimientos rutinarios de esteri-
lización se plantean siempre de forma que proporcionen
un amplio margen de seguridad.
Esterilización por calor
El calor es el agente letal más ampliamente utilizado
para la esterilización. Los objetos pueden ser esteriliza-
Métodos de la microbiología
dos por calor seco, aplicado en un horno en atmósfera de
aire o por calor húmedo, que proporciona el vapor ca-
liente. De estos dos métodos, la esterilización por calor
seco requiere una duración e intensidad mucho mayores
porque la conducción del calor es menos rápida en aire
seco que en aire húmedo. Además, las bacterias pueden
sobrevivir en estado de desecación completa y, en este
estado, la resistencia intrínseca al calorde las célulasve-
getaüvas bacterianas está enormemente aumentad4 casi
hasta el nivel característico de las esporas. Por consi-
guiente, la tasa de muerte es mucho más baja para las cé-
lulas desecadas que para las hidratadas.
El calor seco se usa principalmente para esterilizar
material de vidrio y otros materiales sólidos estables al
calor. [,os objetos se envuelven en papel o se les protege
de otra forma de la contaminación posterior y son ex-
puestos a una temperatura de 170"C durante 90 minu-
tos en un horno.
El vapor debe ser utilizado para la esterilización por
c alor de disoluciones acuos as. El tratami ento suele llevar-
se a cabo en un recipiente metálico llamado autoclave,
que puede llenarse de vapor a una presión superior a la
atmosférica. La esterilización puede lograrse así a tem-
perahrras que están considerablemente por encima del
punto de ebullición del agua. Las autoclaves de labe
ratorio se emplean generalmente a una presión de vapor
de una atmósfera por encima de la presión atmosférica,
lo cual corresponde a una temperatura de lz0"C.Inclu-
so las esporas que sobreviven después de varias horas so-
metidas a ebullición, mueren rápidamente a 120"C. [,os
volúmenes pequeños de líquido(hastaunos 3 litros) pue-
den ser esterilizados exponiéndolos durante 20 minu-
tos; si hay que esterilizarvolúmenes mayores, debe alar-
garse el tiempo de tratamiento.
La temperatura de 120'C dentro de la autoclave se
conseguirá, a la presión indicada, sólamente sí la atmós-
fera consta únícamente de vapo¿ Por lo tanto, al iniciar la
operación debe ser expulsado todo el aire que original-
mente estaba en el recinto de la autoclave y ser reempla-
zado por vapor; esto se logra mediante el uso de una
válvula de vapor que pennanece abierta mientras está
saliendo aire a través de ella, pero que se cierra cuando la
atmósfera está saturada de vapor de agua. Si queda algo
de aire seco dentro de la cámarade esterilización,la presión
parcial del vapor será más baja que la indicada en el manG
metro y la temperatura será, por consiguiente, inferior.
Por esta raz ón, una autoclave debe estar siempre equipada
con un medidor de presión y un medidor de temperatura.
La temperatura del interior de la cámara de esteriliza-
ción puede vigilarse incluyendo entre los objetos que se
van a esterilizar papeles indicadores especiales, que cam-
bian de color si el tratamiento térmico ha sido adecuado.
23
Esterilización por tratamiento químico
Muchas de las sustancias usadas para preparar medios
de cultivo son demasiado lábiles frente al calor para
ser esterilizadas en la autoclave. Para tales sustancias
resultaría extremadamente útil un método químico fia-
ble de esterilización. El requerimiento esencial para un
agente químico esterilizante es que seavolátíl así como
tóxico, de manera que pueda ser fácilmente elimina-
do del objeto esterilizado después del tratamiento. El
mejor candidato disponible es elóxido de etileno, un lí-
quido que hierve a 10,7'C. Puede añadirse a las disolu-
ciones en forma liquida (a una concentración final aprc
ximada de 0,5 a 1,0 por ciento) a una temperahrra de 0 a
4oC, o bien puede usarse como gas esterilizante a tempe-
raturas por encima de su punto de ebullición. Sin embar-
go, es químicamente inestable y sedescompone endisolu-
ción acuosa dando etilenglicol, que no es volátil y puede
tener efectos no deseables. Además, el óxido de etileno
es explosivo y tóxico para los seres humanos, por lo que
es preciso adoptar precauciones especiales para su ma-
nejo. Por estas razones la esterilización con óxido de eti-
leno no se ha convertido en procedimiento de rutina en
el laboratorio. Se usa, sin embargo, en la industria para la
esterilización de placas de Petri y de otros objetos de
plástico que se funden a temperaturas superiores a los
100'c.
Esterilización por filtración
El principal método de laboratorio usado para esterilizar
disoluciones de materiales termolábiles es lafiltracíón a
trávés de filtros capaces de retener los microorganismos.
La acción de estos filtros es casi siempre compleja. [.os
microorganismos quedan retenidos en parte por el pe-
queño tamaño de los poros del filtro y en parte por adsor-
ción a las paredes de los poros durante su paso a través
del filtro. La importancia de la adsorción está indicaCa
por el hecho de que un filtro puede retener eficazmente
microorganismos aún cuando el tamaño medio del dia-
metro de los poros sea algo mayor que el tamaño medio
de las células que son retenidas. La esterilización por fil-
tración está sometida a una principal limitación teorica.
Como los virus van en tamaño hasta las dimensiones
de las grandes moléculas de proteína, no quedan necesa-
riamente retenidos en los filtros que pueden apoderarse
de los microorganismos celulares más pequeños. Por
consiguiente, nunca es posible tener certeza de que. por
los métodos de Frltración que dejan una disolucion libre
de bacterias, se van a eliminar también los virus.
24 Métodos de la microbiología

cial, en términos cuanütaüvos. La materia sólida de las

FUNDAMENTOS DE IA NUTRICIÓN células (tabla 2.1) contiene, además de hidrógeno y oxí'
M ICROBIANA geno (que pueden derivarse metabólicamente del agua),
carbono, nitrógeno, fosforo y azufre, en orden decre-
Para crecer, los microorganismos deben tomar del am- ciente de abundancia. Estos seis elementos suponen al-
biente todas las sustancias que requieren para la síntesis rededor del 95 por ciento del peso seco de la célula. En la
de sus materiales celulares y para la generación de ener- fracción restante se incluyen muchos otros elementos.
gía. Estas sustancias se denominan nutríentes. Un me- Los esh¡dios de nutrición demuestran que elpotasío, mag'
dio de cultivo debe contener, por lo tanto, todos los nu- nesío, calcío, híerro, manganeso, cobalto, cobre, molíb
trientes necesarios en cantidades apropiadas a los reque-
rimientos específicos de los microorganismos para los
que ha sido ideado. Sin embargo, los microorganismos son
extraordinariamente diversos en cuanto a sus propieda- TABLA 2.2
des fisiológicas específlrcas y, por consiguiente, en cuan- Funciones fisiológlcas generales
to a sus requerimientos de nutrientes específicos. Literal- de los principales elementos
mente hablando, son miles los medios diferentes que
se han propuesto para su cultivo, pero en las descripcio-
Elemento Funciones fts io lógicas
nes de estos medios no se especifican, con frecuencia, las
razones que justifiquen la presencia de varios de los com-
ponentes. No obstante, la fórmula de un medio de culü- Hidrógeno Constituyente del agua celular, mate-
riales celulares orgánicos.
vo puede y deberia estar basada en principios científicos,
Oxígeno Constituyente del agua celular, mate-
losfundamentos de la nutríción, que vamos a compen- riales celulares orgánicos; como Or,
diar brevemente como preliminar a la descripción de los aceptor de electrones en la respira-
medios de cultivo. ción de los aerobios.
La composición química de las células, bastante Carbono Constituyente de materiales celulares
constante en todo el mundo vivo, indica los principales orgánicos.
materiales requeridos para el crecimiento. Elagua supe Nitrógeno Constituyente de proteínas, ácidos nu-
ne entre el 80 y el 90 por ciento del peso total de las cleicos, coenzimas.
células y porlo tantoes siempre elprincipal nutriente esen-
Azufre Constituyentes de proteínas (como ami-
noácidos cisteína y metionina); de
algunos coenzimas (por ejemplo,
CoA, cocarboxilasa).
Fósforo Constituyente de ácidos nucleicos, fos-
TABLA 2.7 folípidos, coenzimas.
Conposiclón elemental aproxlmada Potasio Uno de los principales cationes inor-
de la célule microblana gánicos de las células, cofactorde al-
gunos enzimas
Magnesio Importante catión celulaq cofactor inor-
Elemento Porcentaje del peso seco gá'nico en muchas reacciones enzi-
máticas, incluyendo aquellas que re-
Carbono 50 quieren ATP; funciona uniendo los
Cxígeno 20 enzimas a los substratos; constih¡-
Nitrogeno t4 yente de las clorofilas.
Hidrógeno 8 Manganeso Cofactor inorgánico de varios enzimas,
Fósforo 3 a veces reemplazando al Mg.
Azufre I Calcio Importante catión celular, cofactor de
Potasio I algunos enzimas (por ejemplo, pro-
Sodio I teinasas).
Calcio 0,5 Hierro Constituyente de citocromos y otras
Magnesio 0,5 hemo o no hemoproteínas; cofactor
Cloro 0,5 de cierto número de enzimas.
Hierro 0,2 Cobalto Constituyente de la vitamina B,, y de
Todos los demás - 0,3
Cobre,
sus coenzimas derivados.
Constituyentes inorgánicos de enzimas
Procedencia: Datos para una bacteria. Escherichía col¡, reunidos
cinc, níquel especiales.
por S. E. Luria, en The Bacteria (1. C. Gunsalus y R. Y. Stanier, molibdeno
editores). Vol. l, Cap. I (Nueva York: Academic Press, 1960).
Métodos de la microbiología
deno y c¡nc son requeridos por casi todos los organis-
mos. Las funciones conocidas de estos l5 elementos en
la celula están resumidas en la tabla 2.2.
Todos los elementos metálicos requeridos pueden
proporcionarse como nutrientes en forma decatíones de
sales inorgónicas. El potasio, el magnesio, el calcio y el
hierro se requieren en cantidades relativamente grandes
¡' deberian incluirse siempre, como sales, en los medios
de cultivo. [,os requerimientos cuantitativos de manga-
nes, cobalto, cobre, molibdeno y cinc son muy peque
ños, tanto que con frecuencia resulta técnicamente difi-
cil demostrar que son esenciales, ya que están presentes
en cantidades adecuadas como contaminantes de los
componentes principales de los medios. Con frecuencia
se hace referencia a ellos como elementos traza o micro-
nutrientes. Un elemento no metálico, el fósforo, puede
us¿use también como nutriente cuando se administra en
forma inorgánica como fosfatos.
Convendría hacer notar que algunos grupos biológi-
cos tienen requerimientos minerales adicionales que son
específicos. Por ejemplo,las diatomeas y ciertas otras al-
gas sintetizan paredes celulares que estiin fuertemente
impregnadas de sllice y tienen por lo tarito un reque-
rimiento especial de silicio, que se administra en forma
de siücato. Aunque en la mayoría de los microorganismos
no pueda demostrarse un requerimiento de so dio , ciertas
bacterias madnas, las cianobacterias y las bacterias fo
tosintéticas, lo requieren a concentraciones relativamen-
te elevadas. En estos grupos no puede ser reemplazado
por otros cationes univalentes.
Las neces idades de c arb o n o, nít ró g e no, az ufre y oxl-
geno no pueden describirse de forma tan simple porque
los organismos difieren respecto alaforma química es-
pecífica bajo la cual se les deben administrar estos ele-
mentos como nutrientes.
Requerimientos de carbono
[,os organismos que realizan fotosíntesis y las bacterias
que obtienen energía a partir de la oxidación de com-
puestos inorgánicos usan típicamente la forma más oxi-
dada del carbono, el COr, como única o principal fuente
de carbono celular. La conversión del CO, en constih¡-
yentes orgánicos de la célula es un proceso de reducción
que requiere un aporte neto de energía. Por lo tanto, en
estos grupos frsiológicos, una considerable parte de la
energía derivada de la luz o de la oxidación de com-
puestos inorgánicos reducidos debe gastarse para la re-
ducción del CO, hasta el nivel de la materia orgánica.
, Todos los demás organismos obtienen el carbono
principalmente apartirde nutrientes orgánicos. Como la
mayoría de los substratos orgánicos están en el mismo
25
nivel general de oxidación que los constihryentes orgáni-
cos de la célula, no suelentenerque sufrirunareducción
primaria para servirde fuentes de carbono celular. Ade-
más de sufragar las necesidades biosintéücas de carbe
no'a la célula, los substratos orgánicos deben aportar los
requerimientos energéticos de la célula. Por consiguien-
te, mucho del carbono presente en el substrato orgánico
entra en las rutas del met¿bolismo que proporcionaener-
gay posteriormente es excretado de nuevo de la célula
como CO, (el principal producto del metabolismo respi-
ratorio productor de energía) o como una mezcla de CO,
y productos orgánicos (los productos finales típicos del
metabolismo fermentaüvo). Asl pues,los substratos or-
gánicos tienen usualmente un doble papel nutritivo.' sir-
ven a lavez de fuente de carbono yde fuente de energía.
Muchos microorganismos pueden utilizar un solo com-
puesto orgónico para suplir por completo ambas necesi-
dades. Oüos, sin embargo, no pueden crecer si sólo se
les proporciona un compuesto orgánico y necesitan un
número variable de compuestos orgánicos adicionales
como nutrientes. Estos nutrientes orgánicos adicionales
tienen una función puramente biosintética, siendoreque-
ridos como precursores de ciertos constituyentes orgáni-
cos de la célula que el organismo es incapaz de sinteti-
za¡. Estos se denominanfactores de crecímíenfo y sus
funciones se describen con mayor detalle a continuación.
[,os microorganismos son extraordinariamente di-
versos tanto respecto alaclase como alnúmero de com-
puestos orgánicos que pueden usar como fuente princi-
pal de carbono y energía. Esta diversidad se manifiesta
en el hecho de que no hay níngún compuesto orgánico
que exista en la naturaleza que no pueda ser utilízado
como fuente de c arbo no y energía p o r algún m ícroo rga-
nismo. De ahí que, es imposible describir de forma conci-
sa la naturalezaquímica de las fuentes orgánicas de car-
bono de los microorganismos. E sta extraordinari a v ari a-
ción respecto a los requerimientos de carbono es uno
de los aspectos fisiológicos más fascinantes de la micre
biología.
Cuando se examinan los requerimientos de carbono
orgánico de microorganismos particulares, algunos
muestran un elevado grado de versatilidad, mientras que
otros están exüemadamente especializados. Ciertas bac-
terias del grupo de las Pseudomonas, Wr ejemplo, pue-
den usar uno cualquiera de 90 compuestos orgánicos
como única fuente de carbono y energía. En el otro extre-
mo del espectro están las bacterias que oxidan el meta-
no, las cuales sólo pueden utilizar dos substratos organr-
cos, metano y metanol, y ciertas bacterias que descom-
ponen la celulosa, que sólo pueden usar ese compuesto.
Lamayoríade los organismos que dependen de fr¡eo-
tes de carbono orgánico, (o probablemente todos ) '¿-E-
bién requieren CO, como nutriente en ca¡üdades r-:)
pequeñas, porque este compuesto es utilizado 3r ;:,:¡
r
26 Métodos de la microbiología

cuantas reacciones biosintéticas. Sin embargo, como el
CO, es normalmente producido en grandes cantidades
por los organismos que usan compuestos orgánicos, el
requerimiento biosintético se puede suplir a través del
propio metabolismo del carbono orgánico y de la fuente
de energía. No obstante, la eliminación completa de
CO, con frecuencia retrasa o impide el crecimiento de
los microorganismos en medios orgánicos, y unas cuantas
bacterias y hongos, incluso, requieren una concentra-
ción relativamente alta de CO, en la atmósfera (5 a l0
por ciento) para conseguir un desarrollo satisfactorio en
los medios orgánicos.
Requerimientos de nitrógeno y azutre
El nitrógeno y el azufre se encuentran en los compues-
tos orgánicos de la célula principalmente en forma redu-
cida como grupos amino y sulfihidrilo, respoctivamen-
te. La mayoría de los organismos fotosinteticos, así como
muchas bacterias no fotosintéticas y hongos, asimilan
estos dos elementos en estado inorgánicooxidado, como
nitratos y sulfatos; su utilización implica, pues, una re-
ducción preliminar. Algunos microorganismos son inca-
paces de realizar la reducción de uno de ellos, o bien de
ambos aniones, por lo que se les deben administrar los
elementos enforma reducida. El requerimiento de una
fuente de nitrógeno reducido es relativamente común y
puede satisfacerse mediante la provisión de nitrógeno en
forma de sales de amonio. El requerimiento de azufre re-
ducido es más raro; puede cumplirse administrando un
sulfuro o un compuesto orgá,nico que contenga un grupo
sulfhidrilo (por ejemplo, cisteína).
Los requerimientos de nitrógeno y azufre pueden sa-
tisfacerse también con frecuencia, con nutrientes orgáni-
cos que contengan estos dos elementos en combinación
orgánica reducida (aminoácidos o productos más com-
plejos de la degradación de las proteínas, como las pepto
nas). Tales compuestos pueden, desde luego, ser también
fuentes de carbono yenergía, que satisfagan simultánea-
mente los requerimientos celulares de carbono, nitróge-
no, azufre y energía.
Algunas bacterias pueden utilizar también la fuente
natural más abundante de nitrógeno, el Nr. Este proceso
de asimilación del nitrógeno se denominaflijación del ni-
trógeno e implica la reducción preliminar del N, a amo-
niaco.
Factores de crecimiento
Cualquier compuesto orgánico que un organismo requie-
ra como precursor o como consütuyente de su material
orgánico celular, pero que no puede sintetizar a partir de
fuentes de carbono más sencillas, debe ser administrado
como nutriente. Los nutrientes orgánicos de este tipo son
conocidos colectivamente como factores de crecímíen-
to. Caen dentro de tres clases, en cuanto a estructura
quimica y función metabólica:

TABLA 2.3
Relación con los coenzimas de algunas vitaminas hidrosolubles

Reacciones enzimáticas que implican

l'itamina Coenzima la forma de coenzima

Ácido nicoünico Coenzimas de piridin-nucleótido Deshidrogenaciones

(niacina) (NAD+ y NADP+)
Riboflavina Flavina-nucleótido Algunas deshidrogenaciones, transporte de electrones
(vitamina B,) (FAD y FMN)
Tiamina Pirofosfato de tiamina Descarboxilaciones y al gunas reacciones de transferenci a
(vitamina B,) (cocarboxilasa) de grupos
Piridoxina Piridoxal fosfato Metabolismo de aminoácidos
(vitamina Br) Transaminación
Desaminación
Descarboxilación
{,cido pantoténico Coenzima A Oxidación de cetoácidos, metabolismo de ácidos grasos
Acido fólico Acido tetrahidrofólico Transferencia de unidades de un carbono
Biotina Biotina Fijación de COr, transferencia de carboxilos
Cobalamina Diversos derivados Reacciones de reordenación molecular
(vitamina B,r) de la cobalamina
Métodos de la microbiotogía
l. Amínoácídos, requeridos como constihryentes
de las proteínas.
2. Purinas y pirímidínas,requeridas como constitu-
)'entes de los ácidos nucleicos.
3. Vítaminas, un cor{unto diverso de compuestos
orgánicos que forman parte de grupos prostéticos o cen-
tros activos de ciertos enzimas (tabla 2.3).
Como los factores de crecimiento cubren plenamen-
rc necesidades específicas de la biosíntesis, son reque-
ridos en pequeñas cantidades en relación a la fu ente prin-
cipal de carbono celular que debe servir de precursor
general del carbono celular. Unos 20 aminoácidos di-
ferentes entran en la composición de las proteínas, porlo
"'ual la necesidad de cualquier aminoácido específico
que la célula no puede sintetizar no es muy grande. El
mismo razonamiento es aplicable a la necesidad especí-
27
miento en sí mismo puede no ser absolutamente eser
cial; si la reacción bloqueada ocure en uno de los me
mentos iniciales de su biosíntesis, los precursores orgá_
nicos que siguen al paso bloqueado pueden ret capaóes
de satisfacer las necesidades de la célula como nutrieo-
tes específicos. un análisis detallado del requerimiento
de un determinado factor de crecimiento exhibido por un
cierto número de microorganismos diferentes, general-
mente revela que se diferencian en la forma o formas qul-
micas particulares del factor de crecimiento que tequie-
ren. Esto puede quedar ilustrado al considerarel requeri-
miento, bastante común, de vitamina B, (tiamina), que
tiene la siguiente estruchrra:
CH.
T', I

.C:9-CH2-CH2OH
fica de una purina o una pirimidina: en la estn¡ctura de Nzc-c-cH, -N\*\cH
ircs ácidos nucleicos entran cinco compuestos distintos
de estas clases. [,os requerimientos cuantitativos de vita-
ttl
cH3-c\N-cH
b

minas son todavía menores, ya que los varios coenzimas

de los que son precursores üenen funciones catalíücas y,
por consiguiente, están presentes a niveles de unas pocas
partes por millón en la célula, como se muestra en la
¡abla 2.4.
La biosintesis de aminoácidos, purinas, pirimidinas
1' coenzimas, implica dpicanente, series complejas de
reacciones individuales escalonadas, que serán discuti-
das en el capítulo 5. La incapacidad de realizar alguna
de estas reacciones escalonadas hace a un organismo de-
pendiente de la administración del producto final como
tactor de crecimiento. Sin embargo, el factor de creci-
Pirimidina Tiazol
Algunos microorganismos requieren la molécula en-
tera como factor de crecimiento. Existen, sin embargo,
microorganismos que, si se les dan las dos mitades de la
molécula como nutrientes, pueden juntarlas. Otros re-
quieren sólo la porción corespondiente a la pirimidina,
porque pueden sintetizar el tiazol. Otros necesitan sólo
la porción tiazólica, porque pueden fabricar y añadir la
porción pirimidina. Para cada tipo de organismo men-

TABLA 2.4
Concentraciones de varias vitaminas hidrosolubles
(en partes por millón de peso seco) en células bacterianas

Enterobacter Pseudomonas Clostridium

l'iamina aerogenes fluorescens butvrícum

Ácido nicoünico 240 2ro 250

Riboflavina 44 67 55
Tiamina ll 26 9
Piridoxina 7 6 6
Acido 140 9l 93
- pantoténico
Acido fólico t4 9
Biotina 4 7

\ota: En la célula, estas sustancias están presentes en forma de coenzimas, pero como su valoración cuantita-
uva después de su extracción depende de la conversión en las correspondientes vitaminas, los datos se presen-
nn de esta forma.
Tomado de R C. Thompson, Texas Unív. Pub\.4237,87 (19421.
r-
28
cionado es diferente el requerimientnmlnimo del factorde
crecimiento. Sin embargo, en cada caso, lo que el orga-
nismo acaba necesitando es la molécula de tiamina ente-
ra, y si este compuesto se administracomo nutrientepue-
de ser utilizado como factor de crecimiento por todos los
üpos descritos. Pero incluso la molécula de tiamina ente-
ra no es el compuesto que estos organismos deben fabri-
car finalmente como componente esencial de sus molé-
culas. El compuesto funcional es el coenzima cocarboxi-
lasa, que actua de gnrpo prostético en varias reacciones
enzimáticas. Este coenzima es el pirofosfato de tiamina
y üene la estructura siguiente:
NH. oo
Ír. t"' il
cH2o-P-o
I
NZC-C CH,
til *"-t:t
*\cH b
II
OH
CH' to*-t"
Funciones del oxígeno en la nutric¡ón
Como elemento constituyente del agua y de compuestos
orgánicos, el oxígeno es un componente universal de las
células y siempre lo proporciona en grandes cantidades
el nutriente principal, el agua. Sin embargo, muchos or-
ganismos requieren además oxígeno molecular(Oz). Son
organismos que dependen de la respiración aeróbica para
cubrir sus necesidades energéticas y para ellos el oxígeno
molecular funciona como agente oxidante terminal. Ta-
les organismos se denominan aerobios estrictos.
En el otro extremo fisiológico están aquellos micro-
organismos que obtienen energía mediante reacciones
que no implican la utilización de oxígeno molecular y
para los cuales esta forma química del elemento no actúa
de nutriente. Ciertamente, para muchos de estos grupos
fisiológicos, el oxigeno molecular es una sustancia tóxi-
ca que o bien los mata o bien inhibe su crecimiento. Tales
organismos son anaerobíos estrictos.
Algunos microorganismos son anaerobios faculta-
tívos, capaces de crecer tanto en presencia conno en au-
sencia de oxígeno molecular. Considerados metabólica-
mente los anaerobios facultativos caen dentro de dos
subgnrpos. Algunos, como las bacterias del ácido lácüco'
tienen un metaboüsmo productor de energía que es exclu-
sivamente fermentativo, pero no son sensibles a la pre-
sencia del oxígeno. A éstos se los denomina, con mayor
precisión, anaerobíos aerotolerantes. Otros (como, por
ejemplo, muchas levaduras y las bacterias coliformes)
pueden pasÍu de un metabolismo respiratorio a otro fer-
mentativo. Tales anaerobios facultativos usan O, como
agente oxidante terminal cuando lo tienen a su disposi-
Métodos de la microbiología
ción, pero pueden también obtener energía en su ausen-
cia, mediante reacciones de fermentación.
Entre los microorganismos que son aerobios estric-
tos, algunos crecen mejor a presiones parciales de oxí-
geno considerablemente más bajas (0,2 atmósferas) que
las presentes en el aire. Se denominan microaerófilos.
Esto refleja probablemente la posesión de enzimas que
se inactivan bajo condiciones fuertemente oxidantes y
que, por lo tanto, pueden mantenerse en estado funcio-
nal sólo a bajas presiones parciales de Or. Muchas bacte-
rias que obtienen energía por oxidación de hidrógeno
molecularmuestran esta conductay se sabe que la hidro-
tl
'.oH
f
OH
genasa, el enzima implicado en la utilización del hidrG
geno, es fácilmente inactivada por el oxígeno.
Categorías de nutrición entre los microorganismos
Originalmente se admitieron dos clases de nutrición prin-
cipales entre los organismos: los autotrofos, representa-
dos por las plantas, que pueden usar nutrientes comple-
tamente inorgánicos, y los heterotrofos, representados
por los animales, que requieren nutrientes orgánicos.
Hoy dia, estas categorias son insuficientes para abarcar
la variedad de modelos alimenticios que se sabe existen
en el mundo vivo, y se han hecho varios intentos de cons-
truir sistemas más elaborados de clasificación nutriti-
va. Tal vezla más útil, aunque relativamente sencilla,
clasificación es la que se basa en dos conceptos: la na-
turaleza de la fuente de energía y la naturaleza de la
fuente princípal de carbono. Con respecto a la fuente
de energía existe una dicotomia básica: los organismos
fotosintéticos, que son capaces de utilizar la luz como
fuente de energía, denomin adosfototrofos, y los organis-
mos que dependen de una fuente de energía química,
denominados quimiotrofos. Los organismos capaces de
usar CO, como fuente principal de carbono se denomi-
nan autotrofos y los organismos dependientes de una
fuente orgánica de carbono se denominan heterotrofos.
Utilizando estos criterios, se pueden distinguir cuatro
clases de nutrición principales:
l. Fotoautotrofos,que utilizan la luz como fuente de
energia y el CO, como principal fuente de carbono. Esta
 Métodos de la microbiología
:ategoria incluye la mayoria de los organismos fotosin-
:eticos: vegetales, algas y muchas bacterias fotosinté-
'i c as.
2. Fotoheterotrofos, que utilizan la luz como fuente
Ce energia y compuestos orgánicos como fuente princi-
:al de carbono. Esta.categoría incluye algunas de las
':acterias rojas y
verdes.
-1. Químíoautotrofos, que utilizan una fuente de ener-
¡a quimica y CO, como fuente principal de carbono.
Obtienen energia por oxidación de compuestos inorgá-
¡icos reducidos, tales como NHf, NO; Hr, formas redu-
;idas delazufre (HrS, S, SrO3-) o el ion ferroso. De to-
dos los seres vivos, solamente pertenecen a esta catego-
na nutritiva algunos grupos de bacterias. Como resul-
'-ado de su capacidad distintiva de crecer en medios es-
'¡ictamente minerales, en ausencia de luz, estos organis-
:nos son denominados a veces químíolitotrofos (de la
palabra griega líthos, roca).
4. Quimioheterotrofos, gue usan una fuente quími-
:a de energía y un substrato orgánico como principal
ruente de carbono. La precisa distinción entre fuente de
energia y fuente de carbono, característica de las tres ca-
tegorías precedentes, pierde su claridad en el contexto de
la quimioheterotrofía, en donde tanto el carbono como
la energía pueden obtenerse usualmente del metabolis-
ryto de un úníco compuesto orgáníco. [.os quimiohetero-
uofos incluyen todos los animales metazooos,los prote
zoos, los hongos y la gran mayoría de las bacterias. Den-
tro de esta muy compleja categoría nutritiva pueden ha-
cerse ciertas subdivisiones. ^ Una se basa en el estado
-frsíco en el que los nutríentes orgánicos entran en Ia
célula. Los osmotrofos (por ejemplo, bacterias y hon-
gos) ingieren todos los nutrientes en forma disuelta; los
_fagotrofos (como por ejemplo, los protozoos) pueden
ingerir partículas de alimento sólidas mediante el meca-
nismo denominado fagocifosl's (véase la página 62).
Debe hacerse hincapié en que la marcada versatili-
dad de muchos microorganismos hace que la aplicación
de este sistema de categorías nutritivas sea, hasta cierto
punto, arbitraria. Por ejemplo, muchas algas fofoauto-
t¡óficas pueden crecer también en la oscuridad, como
quimioheterotrofos. La quimioheterotrofira es en este as-
pecto otro modo alimenticio posible para ciertos hetero-
trofos y quimioautotrofos. Más o menos convencional-
mente, tales organismos se asignan a la categoría carac-
terizada por los requerimientos de nutrición más sim-
ples. Asi pues, la fotoautotrofia tiene preferencia sobre la
quimiotrofia y la autotrofia sobre la heterotrofia. Los
calificativos de estricto yfacultatívo se utilizan con fre-
cuencia para indicar la ausencia (o presencia) de versa-
tilidad nutriüva. Así, un fotoautotrofo estricto es for-
zosamente dependiente de la luz como fuente de energia
y del CO, como principal fuente de carbono, pero un
fotoautotrofo facultativo no lo es.
¿9
Con el fin de tener en cuenta el requerimiento de fac-
tores de crecimiento, a veces se emplean otros dos tér-
minos adicionales: prototrofia y auxotrofia. Un proto-
trofo puede obtener todo el carbono que necesita de la
fuente principal de carbono. Un auxotrofo requiere, ade-
más de la fuente principal de carbono, uno o más nutrien-
tes orgánicos (factores de crecimiento). Tanto la proto-
trofia como la auxotrofia pueden ocurrir entre los orga-
nismos asignados a cualquiera de las cuatro categorias
nutritivas principales definidas bajo el punto de vista de
los requerimientos de energía y de fuentes principales de
carbono. Por ejemplo, la auxotrofia representada por un
requerimiento absoluto de una o más vitaminas, es ca-
racterística de muchas algas y bacterias fotoautotróficas.
CONFECCIÓN DE MEDIOS
DE CULTIVO
Al confeccionar un médio de cultivo para un organismo
cualquiera, la meta principal consiste en proporcionar
una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, a
concentraciones que permitan un buen crecimiento. Po-
dría parecer razonable, a primera vista, preparar un me-
dio lo más rico posible aportando todos los nutrientes en
exceso. Sin embargo, esta manera de enfocar el pro-
blema no es acertada. En primer lugar, muchos nutrien-
tes se hacen inhibidores del crecimiento o resultan tóxi-
cos al elevar su concentración. Esto ocurre con substra-
tos orgánicos tales como sales de ácidos grasos (por
ejemplo, acetato) o incluso con los azúcares, si la con-
centración es suficientemente elevada. Algunos consti-
tuyentes inorgánicos pueden hacerse también inhibido-
res si se suministran en exceso; muchas algas son muy
sensibles a la concentraciónde fosfato inorgánico. En se-
gundo lugar, aun cuando el crecimiento pueda tener lu-
gar en un medio concentrado, las actividades metabóli-
cas de la población microbianaéñ-lréó¡mié¡to munmo-
rirento determinado llegarán a cambiar la naturalezadel
medio ambiente hasta el punto de hacerse altamente des-
favorable, con lo cual la población se hace hsiológica-
mente anormal o muere. Esto puede ocurrir por un cam-
bio drástico en la concedtracióndel ion hidrógeno (pH).
por acumulación de metabolitos orgánicos tóxicos. o.
en el caso de los aerobios estrictos, por agotamiento
del oxígeno. Como el fin que en general persigue el mr-
crcibióIogo es estudiar las propiedades y el compc''rta-
miento de los microorganismos sanos, es convenien:e
limitar el crecimiento total de los cultivos propor.-:--:.3:-
doles cantidades limitantes de un nutriente. E n el := s : ::
los quimioheterotrofos, la principal fuente de :a:>: - : ..
selecciona generalmente con este fin. Eienrl:; :: :. --
|*""".* 30
TABLA 2.5
Cuatro medios de cultivo de complejidad creciente
Ing red ie n te
Ingredíentes comunes
MEDIO ] MEDIO
Agua, I litro NHoCl. I g Glucosa," 5
KrHPOo, I g NHoCl,
MgSOo . 7H2O, 200 mg
FeSOn . 7H2O, l0 mg
CaCl, l0 mg
Elementos traza (Mn,
Mo, Cu, Co, Zn) como
sales inorgánicas,
0,02-0,5 mg de cada uno
" Si los medios se esterilizan en autoclave, la glucosa debe ser esterilizada por separado y añadida en condiciones asépti-
cas. Cuando los azúcares son calentados en presencia de otros ingredientes, especialmente fosfatos, se descomponen par-
cialmente, dando sustancias que resultan muy tóxicas para algunos microorganismos.
centraciones apropiadas de los nutrientes se podrán ver
en los diversos medios que se describen más adelante.
El punto de arranque racional para la preparación de
medios es componer una base mineral qve proporcione
todos los nutrientes que pueden suministrarse a cual-
quier organismo en forma inorgánica. Este medio base
puede suplementarse luego, si es necesario, con una fuen-
te de carbono, una fuente de energia, una fuente de nitrG
geno y algún factor de crecimiento requerido. Estos su-
plementos variarán, naturalmente, de acuerdo con las
peculiaridades de la nutrición del organismo en particular
que se desea cultivar. Un medio compuesto por comple-
to de nutrientes quimicamente definidps se denomina
.medío s.íntético. Uno que contiene ingredientes de com-
posióión química desconocida se denomina medío com-
plejo.
Podemos ilustrar estas ideas fundamentales conside-
rando la composición de cuatro medios de complejidad
quimica creciente, cada uno de los cuales es adecuado
para el cultivo de ciertas clases de bacterias quimiotrófi-
cas (tabla 2.5). Los cuatro medios comparten una base
mineral común. El medio I está suplementado con NH4CI
a una concentración de I g/litro, pero no se le ha añadido
fuente de carbono. Sin embargo, si se incuba en aerobio-
sis, el CO, de la atmósfera estará a disposición como
fuente de carbono. En la oscuridad, los únicos microor-
ganismos que pueden crecer en este medío son las bacte-
ri as nitrific ante s quimi autotróficas, tale s como N i t ro s o -
mona¡ las cuales pueden obtener carbono del CO, y
energía de la oxidación aeróbica del amouiaco; el ame
niaco les proporciona además la fuente de nitrógeno.
Métodos de la microbiología
s adíc io n a le s
2 ¡t4EDIO 3 MEDIO 4
g Glucosa, 5 g Glucosa, 5g
I g l)IHoCl, I g Extracto de
Acido nicoti- levadura, 5g
nico,0,l mg
El medio 2 está suplementado adicionalmente con
glucosa a una concentración de 5 g/liüo. Bajo condicie
nes aeróbicas, favorecerá el crecimiento de muchas bac-
terias y hongos, ya que la glucosa puede usarse común-
mente como fuente de carbono y energía para el creci-
miento aeróbico. Si se incuba en ausencia de oxígeno,
puede ayudar también al desarrollo de muchas bacte-
rias anaeróbicas estrictas o facultativas, capaces de ob
tener carbono y energía de la fermentación de la gluco-
sa. Obsérvese, sin embargo, que este medio no es apto
para ningún microorganismo que requiera factores de
crecimiento; contiene un solo compuesto carbonado.
El medio 3 está suplementado adicionalmente con
una vitamina, ácido nicotinico. Puede favorecer, por lo
tanto, el crecimiento de todos aquellos organismos capa-
ces de desarrollarse en el medio 2, junto con otros, como
la bacteria Proteus vulgaris, que requieren ácido nicotí-
nico como factor de crecimiento.
En los t¡es medios descritos hasta ahora, se conoce la
naturaleza química de cada uno de los ingredientes; son
pues buenos ejemplos de medios sinteticos. El medio 4
es un medio complejo en el que el NH4CI y el ácido
nicotínico del medio 3 han sido reemplazados porun nu-
triente de composición desconocida, extracto de leva-
dura, a una concentración de 5 g/litro. Puede ayudar al
crecimiento de una gran parte de los microorganismos
quimioheterotróflrcos, tanto aeróbicos como anaeróbi-
cos, que no tengan requerimientos de factores de creci-
miento, ya sean relativamente sencillos o sumamente
complejos. El extracto de levadura proporciona una gran
variedad de constituyentes niFogenados orgánicos (pro
 31

lrSLr 1.6
t{ s*Jilo p arz L euco no stoc mesenteroides

I litro
. -:\--,)t E\ERGIA
,- -:.lsa 25e
:-- : \-: DE :iITROGENO
\H.CI 3g
!o'iS\INERALES
!i!l.Po. 600 mg FeSO . 7H2O l0 mg
('.HPO. 600 mg MnSOo . 4HrO 20 mg
\l¡SO.. THrO 200 mg NaCl l0 mg
r. -.}] ORGÁNICO
{-'erato sodico 2oe
r U\OACIDOS
f :-a-Alanina 200 mg l-Lisina 250 mg
i-Arginina 242 mg ot -Metionina 100 mg
--.)sparagina 400 mg ol-Fenilalanina 100 mg
--Acido aspártico 100 mg l-Prolina 100 mg
:-Cisteina 50 mg nl-Serina 50 mg
l-Acido glutámico 300 mg ot-Treonina 200 mg
Glicocola 100 mg nl-Triptófano 40 mg
r--Histidina . HCI 62 mg t-Tirosina 100 mg
ol-Isoleucina 250 mg nl-Valina 250 mg
ol-Leucina 250 mg
?I- RINAS Y PIRJMIDINAS
Sulfato de adenina. HrO l0 mg Uracilo t0 mg
Guanina.HCl .zH,O l0 mg Xantina . HCI t0 mg
\ITAMINAS
Tiamina. HCI 0,5 mg Biboflavina 0,5 mg
Piridoxina. HCI 1,0 mg {,cidonicotínico 1.0 mg
Piridoxamina. HCI 0,3 mg Acido paminobenzoico 0,1 mg
Piridoxal . HCI 0,3 mg Biotina 0,001 mg
Pantotenato cálcico 0,5 mg Ácido fólico Ó.Ol mg

Procedencia: De H. E. Sauberlich y C. A. Baumann. <A Factor Required for the Growth oÍ Leuconos-
toc citrovorum>>.J. Bíol. Chem. 176, 166 (1948).

ductos de la rotura parcial de las proteínas) que pueden
cubrir los requerimientos generales de nitrógeno, y con-
tiene además la mayoría de los factores de crecimiento
orgánico que suelen necesitar los microorganismos.
[,os medios complejos son, por lo tanto, útiles para el
cultivo de una amplia gama de microorganismos, inclui-
dos aquellos en los que no se conocen sus requerimien-
tos precisos de factores de crecimiento. Aun cuando
los requerimientos de factores de crecimiento de un mi-
croorganismo hayan sido determinados con precisión, con
frecuencia resulta más cómodo hacer crecer el orga-
nismo en un medio complejo, especialmente si los reque-
rimientos de factores de crecimiento son numerosos. Este
punto queda ilustrado en la tabla 2.6, que describe la
composición de un medio sintético que favorece el cre-
cimiento de la bacteria del ácido láctico Leuconostoc
mesenteroídes. Estabacteria puede también ser cultiva-
da satisfactoriamente en el medio complejo 4. En este
caso particular, por lo tanto, el extracto de la levadura del
medio 4 debe suplir los siguientes requerimientos: el
ácido orgánico, acetato, l9 aminoácido, 4 purinas y piri-
midinas y l0 vitaminas.
[,os medios descritos en la tabla 2.5 pueden favore-
cer el desarrollo de microorganismos solamente si se
cumplen además ciertos otros requerimientos para el cre-
cimiento. Estos incluyen una temperatura de incuSa-
ción conveniente, condiciones osmóticas favora':.:= ',
una concentración de iones hidrógeno dentro del :. i::::
de tolerancia del organismo en cuestión. Puede: :.i:::.-
tarse ajustes quimicos para acomodar las :--: : ,-
32
nes osmóticas y la concentración del ion hidrógeno a las
necesidades de algunos microorganismos para los que
estos medios son satisfactorios en cuanto a su contenido
en nutrientes.
Control del pH
Aunque un medio determinado puede ser adecuado para
la inícíacíón del crecimiento, el posterior desarrollo de
una población bacteriana puede estar severamente limi-
tado por los cambios quimicos que se producen por el
crecimiento y metabolismo de los propios organismos.
Por ejemplo, en los medios que contienen glucosa, los
ácidos orgánicos que pueden producirse como resultado
de la fermentación pueden resultar inhibidores delcreci-
miento.
Por el contrario, la descomposición microbiana o la
utilización de los componentes aniónicos de un medio,
tiende a hacer a éste más alcalino. Por ejemplo, la oxida-
ción de una molécula de succinato sódico libera dos io-
nes sódicos en forma de una sal muy alcalina, carbonato
sódico. La descomposición de las proteínas y aminoáci-
dos puede también hacer el medio alcalino como resulta-
do de la producción de amoníaco.
Para evitar cambios excesivos en la concentración
del ion hidrógeno, con frecuencia se añade al medio un
amortiguador ( <buffer> ) o bien carbo nato s ín s olubl e s.
[,os amortiguadores a base de fosfatos, que constan
de mezclas de fiosfatos unibásicos y bibásicos (por ejem-
plo, KTHPO. y KHTPO.) son los más útiles. El KH2PO4
es una sal débilmente ácida, mientras que el KTHPO. es
ligeramente alcalino, por lo que una disolución equimo-
lecular de los dos está muy próxima a la neutralidad, con
un pH de 6,8. Si se añade una cantidad limitada de un
ácido fuerte a esta disolución, parte de la sal básica se
convierte en la ligeramente ácida:
K2HPO4 + HCI ----- KHzPOn + KCI
Sin embargo, si se añade una base fuerte, tiene lugar la
conversión contraria:
KzHPOn + HrO
KH2PO. + KOH
-
Por lo tanto, la disolución actua de amortiguador en cuan-
to que resiste cambios radicales en la concentración de
ion hidrógeno cuando se produce ácido o álcali en el
medio. Utilizando diferentes proporciones de fosfato áci-
do y básico, pueden establecerse diferentes valores de
pH, que oscilan entre 6,0 y 7,6 aproximadamente. Sin
embargo, unabuena acción amortiguadora sólo se obtie-
ne en el estrecho m¿ugen de pH entre 6,4y 7,2, porque la
capacidad de una disolución amortiguadora está limita-
da por las cantidades de sus ingredientes básicos y áci-
dos. De ahi que cuanto más ácido es el amortiguador ini-
Métodos de la microbiología
cial, menor es su capacidad para evitar incrementos en la
concentración de iones hidrógeno (descensos del pH) y
mayor para reaccionar con los álcalis. Inversamente,
cuando más alcalino es el amortiguador inicial menor es
su capacidad para evitar incrementos en el pH y mayor
para evitar una acidificación.
I-os fosfatos son ampliamente utilizados para la pre-
paración de medios porque son los únicos agentes ínor-
gánicos que tienen acción amortiguadora en la escala fi-
siológicamente importante en torno a la neutralidád, y
porque son relativamente atóxicos para los microorga-
nismos. Además, proporcionan una fuente de fósforo,
que es un elemento esencial para el crecimiento:-A con-
centraciones elevadas, el fósforo se hace inhibidor, de tal
manera que la cantidad de fosfato de amortiguación que
puede ser utilizada en un medio está limitada por la tole-
rancia del organismo en particular que se va a cultivar.
Generalmente, pueden ser tolerados por las bacterias y
los hongos unos 5 g de fosfatos de potasio por litro de
medio.
Cuando en un cultivo se produce una gran cantidad
de ácido, las pequeñas cantidades de amortiguador que
se utilizan resultan insignificantes para el mantenimien-
to de un pH conveniente. En tales casos pueden añadir-
se carbonatos a los medios, como <álcalis de reserva>,
para neutralizar los ácidos a medida que se van formando.
En presencia de iones hidrógeno, el carbonato es trans-
formado en bicarbonato y el bicarbonato es convertido
posteriormente en ácido carbónico, gü€ se descompone
espontáneamente dando CO, y agua. Esta sucesión de
reacciones, todas ellas libremente reversibles, pueden
resumirse asi:
COr' + HCo3 + H2cO3 :Co2 + H2O
Puesto que el H2CO3 es un ácido extremadamente
débil y que además se descompone por pérdida de CO,
que va a la atmósfera, la adición de carbonato impide el
acúmulo de iones hidrógeno y por tanto de ácidos libres
en el medio. [,os carbonatos solubles tales como el
NarCOr son fuertemente alcalinos y por lo tanto no son
adecuados para su uso en los medios de cultivo. Por el
contrario, los carbonatos ínsolubles son ingredientes muy
útiles para muchos medios de cultivo. De estos carbona-
tos insolubles, la caliza(CaCOr) finamente pulverizada
es el más empleado. Por su insolubilidad, el carbonato
cálcico no crea en el medio condiciones fuertemente
alcalinas, especialmente si se usa junto con otros amor-
tiguadores. Sin embargo, cuando el pH del liquido cae
por debajo de 7,0 aproximadamente, el carbonato se des-
compone con desprendimiento de COr. Actua pues como

: 3URA 2.5
l: :rias de Streptococcus creciendo sobre un medio con agar
: - e :ontiene una suspensión de carbonato cálcico. El ácido lácti-
--: c.oducido ha disuelto el carbonato cálcico, lo que origina zo-
-:s claras en torno a cada colonia.
agente,neutralizante de cualquier tipo de ácido que apa-
:ezca en un cultivo, convirtiéndolo en sus sales cál-
::c45.
La adición de CaCO3 a los medios con agar utiliza-
Jos para el aislamiento y cultivo de bacterias producto-
:3-r de ácidos, ayuda a conservar las condiciones neu-
:as. Además, como las colonias productoras de ácidos
{suelven la caliza precipitada y quedan rodeadas por
z-1nas claras, pueden ser fácilmente reconocidas sobre el
:':ndo opaco del medio (figura 2.5).
En algunos casos, ni los amortiguadores ni los carbo-
:atos insolubles pueden ser utilizados para mantener un
pH relativamente constante en un medio de cultivo. Sur-
gen problemas especiales, por ejemplo, cuando en un
nedio en el que la presencia de carbonato no es desea-
'rle se forman grandes cantidades de ácido. Todavía se
:ncuentran dificultades más serias cuando se trata de
--ontrolar el pH ligeramente alcalino en medios en don-
je se producen sustancias básicas, como resultado del
;recimiento bacteriano. Esto es por el hecho de que
.os amortiguadores fosfato no son efectivos en el inter-
valo de pH entre 7,2 y 8,5 y se dispone de muy pocos
amortiguadores adecuados para ese intervalo. Por lo tanto,
en ciertos casos es necesario ajustar el pH del cultivo, bien
sea periódicamente o de una manera continua, mediante
la adicion aséptica de ácidos o bases fuertes. En algunos
laboratorios y en plantas industriales se usan para estos
ines dispositivos mecánicos muy elaborados. Con su
a¡'uda se puede hacer una titulabión continua del medio y
:l pH se mantiene casi constante.
33
[,os medios descritos en la tabla 2,5 son todos ligera-
mente alcalinos al principio porque contienen la sal alca-
lina KrHPOo. Muchos organismos prefieren condicio-
nes neutras o ligeramente ácidas, que pueden conseguir-
se mediante el uso de amortiguadores apropiados.
Prevención de precipitados minerales:
agentes quelantes
Un problema molesto que se encuentra con frecuencia
en la preparación de medios sintéticos es la formación de
un precipitado después de la esterilización, especialmen-
te si el medio tiene una concentración relativamente alta
de fosfato. Esto es resultado de la formación de comple-
jos insolubles entre los fosfatos y ciertos cationes, espe-
cialmente calcio y hierro. Aunque generalmente no afec-
tan al valor nutritivo del medio, pueden hacer diñcil la
observación y la valoración cuantitativa del desarrollo
microbiano. Este problema puede evitarse esterilizando
por separado las sales de calcio y hierro en disolución con-
centrada y añadiéndolas luego al medio esterilizado y
frío. Alternativamente, se puede incorporar al medio una
pequeña cantidad de un agente quelante que forme un
complejo soluble con estos metales y de esta forma les
impida formar un complejo insoluble con los fosfatos. El
agente quelante más comúnmente utilizado para este fin
es el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), a la con-
centración del 0,01 por ciento, aproximadamente.
Control de la concentración de oxígeno
El oxígeno es un nutriente esencial paralas bacterias ae-
róbicas estrictas. [.os microorganismos aeróbicos pue-
den crecer fácilmente en la superFrcie de placas de agar y
en capas de un medio liquido poco profundo. En los culü-
vos líquidos en resposo, el crecimiento generalmente
ocurre en la superficie. Debajo de la superficie, sin em-
bargo, las condiciones se hacen anaeróbicas y el creci-
miento no es posible. Para obtener grandes poblaciones
en cultivos liquidos es, por lo tanto, necesario airear el
medio. En el laboratorio se utilizan varios tipos de dispo-
sitivos de agitación que mueven constantemente el me-
dio y de este modo lo airean. Otro método de aireacion
consiste en el paso continuo de una corriente de aire es-
téril a través del culüvo. Para asegurar una gran super-
ficie de contacto entre el gas y el liquido, el aire puede se:
introducido a través de un <dispersador> poroso que .c
distribuye en forma de burbujas muy finas.
Sin embargo, incluso una aireación visorcs3 i-: :
ser con frecuencia insuficiente para manten3: -:.. :.- --
centración adecuada de oxieeno disuelto. N:¡ -: .,' '--1::
lfllllllllllLrP*"
34
de utilización de O, por el cultivo puede ser superior a la
tasa de su difusión en el medio de culüvo.
Todos estos métodos tienen como finalidad mante-
ner concentraciones de O, en el punto de saturación con
respecto a la presión parcial de O, en el aire. El mante-
ner concentraciones constantes de O, disuelto inferiores
a la de saturación exige un continuo ajuste de la tasa de
aireación en respuesta a las concentraciones de oxígeno
disuelto detectadas por un sensor que es unelectrodo de
oxígeno o alternativamente exige que el cultivo sea airea-
do con una mezcla gaseosa en la cual la presión parcial
de O, sea inferior a la del aire.
Técnicas para el cultivo de anaerobios estrictos
Muchos de los microorganismos estrictamente anaerG
bicos más sensibles mueren rápidamente por contacto
con el oxÍgeno molecular. La exposición de los cultivos
al aire, debe, por ello, reducirse al mínimo o evitarse to-
talmente. Además, muchos anaerobios estrictos pueden
iniciar el crecimiento sólo en medios con bajo potencial
redox, Er(- 150 mV, o incluso menos). El uso de me-
dios que estén prerreducidos, por la inclusión de agentes
reductores tales como cisteína, tioglicolato, NarS o as-
corbato sódico, es por lo tanto un factor de capital impor-
tancia para el cultivo de muchos anaerobios. Una vez
preparados, estos medios deben, naturalmente, prote-
gerse de la exposición al aire, tanto durante su almacena-
miento como durante su empleo. Mientras se usan, esto
puede lograrse haciendo pasar una corriente de CO, o N,
libres de O, por el orificio del recipiente de cultivo abierto.
[,os cultivos liquidos de anaerobios estrictos se pre-
paran normalmente en tubos o matraces completamente
llenos de medio y cerrados con tapones de goma o de plás-
tico con rosca El aislamiento en medios sólidos puede
realizarse por diversos métodos. [.os organismos capaces
de tolerar una exposición transitoria al aire pueden aislar-
se por siembra masiva en tubos, o bien sobre placas sem-
bradas por estria, que se colocan después de su inocula-
ción en jarras anaeróbicas de cierre herméüco. Luego se
hace que la atrnósfera de la vasija quede libre de Or, bien
sea por evacuación del mismo y rellenado con un gas iner-
te (por ejemplo, Nr), bien por destnrcción química del oxi-
geno, o por una combinación de ambos métodos. Los or-
ganismos incapaces de tolerar siquiera una exposición
momentánea al aire. se suelen aislar usando <tubos ro-
dantes>.
Aunque los tubos rodantes permiten realizar el aisla-
miento y subcultivo de los anaerobios más estrictos, no
estám bien acondicionados para el crecimiento de cultivos
que van a ser utilizados en estudios de genética o de fisio-
logía. Por consiguiente, cada vez se utilizan más las cá-
maras anaeróbicas, que tienen una atmósfera reductora
Métodos de la microbiología
a una presión ligeramente superior a la presión del aire
que las rodea (para asegurarse de que el gas no se pierde a
través de agujeros que no han sido detectados). Dentro
de estas cámaras anaeróbicas se puede realizar toda la
g¿rma de técnicas microbiológicas y bioquimicas.
Suministro de dióxido de carbono
Un problema frecuentemente encontrado en el cultivode
fotoautotrofos y quimioautotrofos es el de suministrar
dióxido de carbono en cantidades suficientes. Aunque la
difusión del dióxido de carbono de la atmósfera dentro
del medio de cultivo permite que haya desarrollo, la con-
centración de dióxido de carbono en la atmósfera es muy
baja (0,03 por ciento en atmósfera abierta y algo supe-
rior dentro de los edificios), por lo que las tasas de creci-
miento de los autotrofos están con frecuencia limitadas
por la disponibilidad de dióxido de carbono bajo estas
condiciones. La solución consiste en gasear los cultivos
con aire que ha sido artificialmente enriquecido con diG
xido de carbono y que conüene del I al5 porcientode este
gas. El control del pH se convierte en un problema por las
razones ya discutidas (p. 32) y, si se adopta esta solu-
ción, debe tenerse cuidado de modificar la composición
I
del amortiguador del medio. En el caso de los autotrofos
que pueden crecer bajo condiciones anaeróbicas en fras-
cos cerrados (por ejemplo, las bacterias rojas y verdes
del azufre) el requerimiento de CO, puede solucionarse
mediante la incorporación de NaHCO, al medio. L,os bi-
carbonatos solubles no pueden ser utilizados en los me-
dios expuestos al aire porque la rápida pérdida de CO,
que pasa a la atmósfera, hace que el medio se hagaextre-
madamente alcalino.
Suministro de luz
Para el cultivo de microorganismos fototróficos (algas,
bacterias fotosintéticas) /a luz esun requerimiento esen-
cial. El suministro de una iluminación adecuada, al mis-
mo tiempo que se controla la temperatura, no es una ta-
rea sencilla. En el cultivo de organismos que no son
fotosintéticos, el control de la temperatura se consigue
mediante el uso de incubadores con un dispositivo que
actúa de termostato y mantiene el valor deseado. Sin em-
bargo, la mayoría de los modelos comercialmente dispe
nibles no llevan sistema de iluminación interna y no pue-
den ser usados para el cultivo de organismos fototrG
hcos.
Exponiendo los cultivos a la luz del día puede obte-
nerse una iluminación relativamente incontrolada y dis-
continua. Debe evitarse la exposición directa a la luz del
sol, porque la intensidad puede ser demasiado elevada y
lt::ccos de la microbiología
r ==peratura
puede subir hasta un punto en donde el
-*----iento se detiene. Muchos microorganismos foto-
pueden tolerar una iluminación continua y su
=:i.¡os
rsa:rollo es mucho más rápido bajo estas condiciones,
¡:"i io que las fuentes de luz artificial son más ventajo-
,¿-. El espectro de emisíón de la lámpara empleada es
- f,rrante. Las fuentes de luz fluorescente üenen la ven-
'i.- a practica de que producen relativamente poco calor,
!c cual no resulta dificil mantener una temperatura
=::
¡¡nveniente. Sin embargo, sus espectros de emisión son
:e:-:cientes, en comparación con la luz solar, en la zona
* Longitudes de onda más largas del espectro visible y del
.:r:arrojo cercano. Son satisfactorias para el cultivo de
i-gas )' cianobacterias, que realizan la fotosíntesis con
- de tongitudes de onda inferiores a 700 nm, pero pro-
:roporcionan poca luz fotosinteticamente efecüva, o nin-
irna para las bacterias rojas y verdes, que usan longitu-
:es de onda entre 750 y I 000 nm. Las únicas fuentes de
. ¿z artificial adecuadas para esas bacterias fotosinteticas
son las lámparas de incandescencia, pero, si se utilizan
e,evadas intensidades, la disipación del calor resulta un
:roblema. La solución más fácil consiste en sumergir las
r asijas de cultivo en un baño de plástico o de cristal lle-
:ro de agua, que pueda ser sometido a iluminación lateral
1' mantenido a la temperatura deseada haciendo circular
agua. La otra solución es construir una cámara de luz con
iluminación incandescente interna en la que la tempera-
rura pueda ser controlada por ventilación o refrigeración.
MEDIOS SELECTIVOS
Está claro que no hay un medio ni un conjunto de condi-
ciones que puedan favorecer el crecimiento de todos los
üpos diferentes de organismos que existen en la naturale-
za. Por el contrario, cualquier medio que es adecuado
para el crecimiento de un organismo específico es, en
cierto modo, selectivo para el mismo. En un medio ino-
culado con una variedad de organismos, sólo aquellos
que puedan crecer en él se reproducirán y todos los otros
se exünguirán. Además, si los requerimientos de nu-
trición de un organismo son conocidos, es posible di-
señar un conjunto de condiciones que favorezcan espe-
cíficamente el desarrollo de este organismo en particu-
lar, permitiendo asi su aislamiento a partir de una pobla-
ción natural mixta, aún cuando el organismo en cuestión
sea un componente minoritario de la población total. I-os
microorganismos pueden obtenerse selectivamente de
hábitats naturales (por ejemplo, suelo o agua) bien sea
por aíslamiento directo o por enriquecimíento.
35
Aislamiento directo
Si una población microbiana mixta se extiende sobre la
superFrcie de un medio selectivo solidificado con agar
(o con algun otro agente geliflrcante), cada célula del
inóculo capüzde desarrollarse crecerá y formará una ce
lonia. La dispersión espacial de la población microbiana
sobre un medio sólido reduce considerablemente la com-
petencia por los nutrientes: bajo estas circunstancias,
aun los organismos que crecen relativamente despacio
serán capaces de producir colonias. La siembra directa
en placa sobre un medio selectivo es la técnica de elec-
ción cuando se desea aislar una considerable diversidad
de organismos, todos ellos capaces de crecer bajo las
condiciones de cultivo empleadas.
Enriquecimiento
Si una población microbiana mixta se introduce en un
medio selectivo líquido, hay una competencia directa
por los nutrientes entre los miembros de la población que
se desarrolla. Por ello, los medios de enriquecimiento lí-
quidos tienden a seleccionar los microorganismos de
más elevada tasa de crecimiento entre todos los miem-
bros de la población que se ha introducido, y que son ca-
paces de crecer bajo las condiciones suministradas.
La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no
sólo está determinada por la composición del medio usa-
do. El resultado del enriquecimiento en un medio dado
puede ser significativamente modificado por la varia-
ción de otros factores tales como la temperatura, el pH,
la fuerza iónica, la iluminación, la aireación o la fuente
de inóculo. Por ejemplo, el medio 2 delatabla 2.5 puede
ser utilizado para cultivar o enriquecer bacterias entéri-
cas pertenecientes a los géneros Escheríchia y Entero-
bacter. Los miembros del primer género son habitantes
normales del tracto intestinal de animales homoterrnos,
en tanto que los del segundo son habitantes comunes del
suelo. Las cepas de Escheríchia están adaptadas natu-
ralmente a crecer a temperaturas algo más elevadas que
las cepas de Enterobacter, y también son menos sensi-
bles al efecto tóxico de las sales biliares. En consecuen-
cia, o bien la incubación a una temperatura elevada
(45"C) o bien la inclusión de sales biliares harán que el
medio 2 sea selectivo para Escherichia.
La selección de la temperatura puede usarse tambien
con gran efectividad para el aislamiento de cianobacte-
rias, que se parecen mucho a las algas en los aspectos n:-l-
tritivos y metabólicos. Tanto las algas como las ::a-
nobacterias pueden crecer en un medio mineral s:r-: =
incubado en presencia de luz a 25'C. Sin enbi:¡:. .
desarrollo de las algas puede impedirse casi c'o: : r:: :-
36 Métodos de la microbiología

to por incubación a la temperatura de 35'C, ya que éstas
tienen en general temperaturas máximas inferiores a las
de las cianobacterias.
Un medio de enriquecimiento que no sea inicialmen-
te altamente selectivo puede adquirir una selectividad muy
aumentad a para un tipo particular de organisnro como
resultado de los cambios químicos producidos por este
organismo durante su desarrollo. Asi pues, las bacterias
fermentadoras y las levaduras son típicamente más tole-
rantes que otros organismos ante los productos orgáni-
cos finales que ellas mismas excretan a partir de los
ca¡bohidratos; por ello, en un medio rico en carbohidra-
tos, su desarrollo tenderá a suprimir los microorganis-
mos competidores.
En el aislamiento de bacterias formadoras de endos-
poras (géneros Bacillus y Clostridium) la competencia
de las bacterias que no esporulan puede eliminarse total-
mente con un pretratamiento del inóculo. La pasteuriza-
ción del inóculo, que supone una breve exposición a una
temperatura elevada (2 a5 minutos a 80"C) destruye las
células vegetativas sin afectar a las esporas, que son mu-
cho más resistentes al calor.
Métodos de enriquecimiento
para algunos grupos fisiológicos especializados
El cultivo de enriquecimiento es una de las técnicas más
efrcaces a disposición del microbiólogo. Para el aisla-
miento de microorganismos a partirde los hábitats natu-
rales, puede desarrollarse un número casi infinito de per-
mutaciones y de combinaciones de las diferentes varia-
bles ambientales, alimenticias y fisicas. Las técnicas de
enriquecimiento proporcionan un medio para aislardela
naturaleza a voluntad tipos microbianos conocidos, apre
vechando sus requerimientos específicos, y puede, ade-
más, ser perfeccionado indeFrnidamente para obtener or-
ganismos todavía no descritos, capaces de crecer en am-
bientes diseñados por los cienüficos. Aquí vamos a in-
tentar resumir unos cuantos de los procedimientos de en-
riquecimiento que pueden usarse para aislar a partir de la
naturaleza los principales grupos fisiológicos de micre
organismos, especialmente bacterias.
Medios sintéticos de enriquecimiento
para quimioheterotrofos
La nutrición y las condiciones ambientales necesarias
para el enriquecimiento de varios grupos de quimiohete-
rotrofos en medios sintéticos están esquematizados en la
tabla 2.7 .
Para el enriquecimiento de organismos fermentado-
res, la naturaleza química del substrato orgánico es im-
portante; para que sea atacado por fermentación, no
debe estar ni demasiado oxidado ni demasiado reducido.
[,os azúcares son excelentes substratos fermentativos,
pero otras muchas clases de compuestos orgánicos, del

T ABLA 2.7
Factores ambientales primarios que determinan el resultado final según el método
de enriquecimiento para bacterias quimioheterotróficas utilizando medios sintéticos

como única (Grupo Azotobacter)

Aeróbico Preferentemente substrato -N,fuente de nitrógeno
no fermentable Nitrógeno combinado (Aerobios, p.ej.
presente Pseudomonas,
Acinetobacter\
Sustancias
orgánicas
NO; como aceptor (Bacterias
de electrones desnitrificantes)
sin iluminacion
Preferentemente substrato SOl- como aceptor (Reductores de
no fermentable de electrones sulfato)
CO, como aceptor
t- de electrones
(Bacterias
metanogénicas)
- Anaerobico

I Substrato
fermentable -
f.{, como única fuente
de nitrógeno

Nitrógeno combinado
presente
(Clostridium
pasteuríanum
y especies
afines)
(Bacterias
fermentadoras, p. ej.
Enterobacter)
Vétodos de la microbiología
rismo nivel aproximado de oxidación, pueden ser tam-
:ien fermentados. [,os cultivos de enriquecimiento de-
ben ser incubados anaeróbicamente no sólo porque algu-
rcs organismos fermentadores son anaerobios estrictos,
sino también para evitar la competencia de formas aerG
bicas. No debe usarse nitrato como fuente de nitrógeno,
)'a que permitirá también el crecimiento de bacterias des-
itrihcantes (véase más adelante). Puede añadirse car-
'ronato
cálcico si los organismos en que se está enrique-
;iendo el cultivo producen ácido o son sensibles al
:irismo.
Tres grupos fisiológicos especiales de bacterias qui-
rnioheterotróñcas que pueden usar compuestos inorgá-
nicos distintos del oxígeno molecular como oxidantes
¡erminales del metabolismo respiratorio pueden ser enri-
quecidos en medios sintéticos, bajo condiciones anaeró-
bicas. En estos casos deben evitarse los substratos orgá-
nicos fácilmente fermentables, tales como los azúcares.
Pa¡a las bacterias desnitrificantes se incluye nitrato como
oxidante terminal y acetato, butirato o alcohol etílico
como fuente de carbono y energía. Para las bacterias sul-
tato-reductoras se incluye una cantidad relativamente
_erande de sulfato, ya que es el oxidante terminal específi-
co: lactato o malato, pero no acetato, proporcionan la
mejor fuente de carbono y energia. Para las bacterias re-
ductoras del carbonato (productoras de metano), el CO,
debe estar presente como oxidante y compuestos tales
como el Hr, acetato o formiato, como fuente de energía.
Debe tenerse también en cuenta aquí que en los enrique-
cimientos para bacterias reductoras del sulfato y del car-
bonato es deseable el uso del amoniaco como fuente de
nitrógeno; la adición de nitrato favorecerá el desarrollo
de reductores del nitrato. Del mismo modo, el enriqueci-
miento en reductores de carbonato y de nitrato, debe
mantenerse al mínimo la concentración de sulfato, para
evitar el crecimiento excesivo de sulfato-reductores.
Obviamente, las condiciones aeróbicas son esencia-
les para el enriquecimiento de microorganismos que ob.
tienen la energía de la respiración aeróbica. Tanto los
substratos fermentables como los que no lo son, son nu-
trientes orgánicos satisfactorios. Sin embargo, si se utili-
za un substrato fermentable, el cultivo debe estar meticu-
losa y continuamente aireado, porque el agotamiento del
oxígeno por respiración favorece el enriquecimiento de
anaerobios. Los compuestos fácilmente fermentables ge-
neralmente estimulan el crecimiento de anaerobios fa-
cultativos. Por ello, cuando en los medios de enriqueci-
miento se incluye glucosa u otros azúcares, aparece En-
terobacter como uno de los principales organismos, tan-
to en condiciones aeróbicas como anaeróbicas.
El uso de substratos no fermentables da normalmen-
te como resultado el enriquecimiento de organismos que
son aerobios estrictos, siendo los más comunes algunos
miembros del género Pseudomonas. Por ejemplo, pue-
t/
den obtenerse cepas de P. putida capaces de oxida¡ el
benzoato al utilizar benzoato sódico ( I g/litro) como úni-
co nutriente orgánico. Si se utiliza asparagina (2 g/litro)
como única fuente de carbono y de nitrógeno en el me-
dio, las cepas de P. putida y deotras especies relaciona-
das que oxidan la asparagina se convierten en las predo-
minantes.
Las sales de amonio se usan generalmente como fuen-
te de nitrógeno en medios sintéticos de enriquecimiento
p¿ua aerobios. Si no se ha proporcionado ningún com-
puesto de nitrógeno combinado, pueden obtenerse culti-
vos de bacterias aeróbicas flrjadoras de nitrógeno del
género Azotobacter. Las especies de Azotobacter pue-
den utilizar una gran variedad de substratos orgánicos,
incluidos alcoholes, butirato, benzoato y glucosa, como
únicos nutrientes orgánicos.
Enriquecimiento de organismos
quimioautotróficos y fotosi ntéticos
Para el enriquecimiento de organismos quimioautotrófi-
cos y fotoautotróflrcos deben omitirse del medio los com-
puestos orgánicos y debe usarse CO, o bicarbonato como
única fuente de carbono(tablas 2.8y 2.9).Lasformas fb-
tosintéticas requieren luz,en tanto que las quimioautotrG
ficas deben cultivarse en la oscuridad para evitar el desa-
rrollo de tipos fotosintéticos. Durante la incubación de
los cultivos deben mantenerse condiciones bien aeróbi-
cas o bien anaeróbicas, dependiendo de que el organis-
mo necesite o no oxígeno. Una excepción a esta regla se
encuentra en el cultivo selectivo de las algas y cianobac-
terias. Como estos organiimos producen oxigeno en su
metabolismo, no existe virtualmente ninguna diferencia
en que los cultivos sean incubados bajo condiciones aerG
bicas o anaeróbicas.
Los medios que se ideen para el enriquecimiento y
propagación de organismos fotosintéticos deben conte-
ner sodio porque se sabe que este elemento es requerido
por las bacterias fotosintéticas.
Para el enriquecimiento de bacterias rojas no del azu-
fre, el medio debe incluir un substrato orgánico adecua-
do, y, en algunos casos, bicarbonato. El substrato no
debe ser fácilmente fermentables; suele usarse acetaro.
butirato o malato. El bicarbonato debe añadirse si el
substrato (por ejemplo, butirato) está más reducido que
el material de la célula, porque la fotosíntesis va acornpa-
ñada de un consumo neto de COr. Con substratos iales
como el malato, que son metabolizados con una prc.J -:-
ción neta de COr, la adición de bicarbonato es i:.:::--. =-
ria. Como las bacterias fotoheterotróficas rec -.:-:- : - -
frecuencia diversos factores de crecimientc. s'-: : .'=: -.
se al medio una pequeña cantidad de er r::: . :: : : : - -:
 illltllilllllr,lL lllllll r ll il rl r

38 Métodos de la microbiología

TABLA 2.8
Factores ambientales primarios que determinan el resultado final según el método
de enriquecimiento para algunas bacterias quimioautotróficas

NHf como substrato (Bacterias oxidadoras del

oxidable amoniaco, p. e., Nitrosomonas)
NO; como substrato (Bacterias oxidadoras del
Aeróbico (oxígeno oxidable nitrito, p. e." Nitrobacter)
como aceptor de H, como substrato (Bacterias del
electrones) oxidable hidrógeno)
Ausencia de S ó SrO3- como (Thiobacillus)
compuestos substrato oxidable
orgánicos
en el medio Anaeróbico (NO; S ó SrOS- como (Thíobacillus
como aceptor de substrato oxidable denitrificans)
electrones)
Anaeróbico (CO, H, como substrato (Bacterias
como aceptor oxidable metanogénicas)
de electrones)

TABLA 2.9
Factores ambientales prlmarios que determinan el resultado final según el método
de enriquecimiento para microorganismos fotosintéticos

N, como única (Cianobacterias)

Ausencia d. J- fuente de nitrÓgeno
sulfuro l__ Presencia de nitre (Algas)
Ausencia de geno combinado
compuestos
orgánicos
presenciade Elevada concentra- (Bacterias verdes
sulfuro; _[- ción de sulfuro del azufre)
Luz como |.- condiciones [__ Baja concentra- (Bacterias rojas
tuente --l anaeróbicas ción de sulfuro del azufre)
de energía
Presencia de (Bacterias rojas o verdes
L compuesto Condiciones no del azufre)
orgánicos anaeróbicas

Empleo de medios comple.ios
p¿rra enriquecimiento
Algunas bacterias no pueden ser enriquecidas en medios
definidos porque tienen requerimientos de nutrición ex-
tremadamente complejos. Sin embargo, tales organis-
mos, en algunos casos, pueden obtenerse de la naturale-
za mediante el uso de medios complejos especialmente
concebidos. Las bacterias del ácido láctico ilus'aan este
punto. Estos organismos están caracterizados por su no-
taHe resistencia al ácido láctico que ellas mismas produ-
cen al fermentar el azúcar. Para el enriquecimiento de
bacterias del ácido láctico se usa un medio escasamente
amortiguado, que contenga glucosa y una fuente rica en
factores de crecimiento (por ejemplo: 20 g de glucosa y
l0 de extracto de levadura por litro). Después de la ino-
culación, preferentemente con materiales naturales ricos
en bacterias lácticas (por ejemplo: sustancias vegetales,
leche cruda, aguas residuales), el medio se incuba bajo
condiciones anaeróbicas. Los primeros organismos que
se desarrollan son generalmente bacterias tales como
Enterobactery Escheríchia. Sin embargo, a medidaque
que el ácido láctico se va acumulando, las condiciones
se van haciendo cadavez menos favorables para las pri-
meras bacterias, mientras que las del ácido láctico conti-
núan desarrollándose. Con el tiempo la acidez del me-
Métodos de la microbiología
dio se hace tan elevada que predominan las bacterias del
acido láctico, y la mayor parte de los otros organismos
son destruidos.
Otro buen ejemplo de medio complejo, que es bas-
tante selectivo para un grupo específico de organismos,
es el ideado para el enriquecimiento de las bacterias
del ácido propiónico. Estos organismos producen en la
fermentación ácido propiónico, ácido acético y COr.
Aunque pueden fermentar la glucosa fácilmente, no pue-
den competir ni con^Enterobacter ni con las bacterias del
acido láctico en medios con glucosa, porque crecen rela-
tivamente despacio y no toleran las condiciones ácidas.
Sin embargo, las bacterias del ácido propiónico pueden
fermentar también ácido láctico, que no es un substrato
apropiado para la mayor parte de los otros organismos
fermentativos. Esta capacidad es la clave de su enrique-
cimiento. Si un medio neutro que contenga 20 g de lacta-
to sódico y l0 g de extracto de levadura por litro se inocu-
la con materiales naturales que contengan bacterias del
acido propiónico y se incuba a 30'C bajo condiciones
anaeróbicas, se obtiene un enriquecimiento de estos or-
ganismos. El queso suizo es el mejor inóculo para los cul-
tivos, ya que las bacterias del ácido propiónico son los
pnncipales agentes de su maduración.
[,os medios complejos pueden ser utilizados con éxi-
to para el cultivo selectivo de las bacterias del ácido acé-
tico. Estas bacterias están especialmente adaptadas a
ambientes que contienen elevadas concentraciones de
alcohol. Son además mucho menos sensibles que otras
bacterias a la inhibición por el ácido acético que ellas
producen, a partir del alcohol, en la respiración. Para en-
riquecerlas, un medio complejo que contenga alcohol se
inocula con materiales en los que se encuentren estas
bacterias y luego se incuba bajo condiciones aeróbicas.
Las frutas, flores y la cerveza sin pasteurizar (de barril)
son buenas fuentes de inóculo. Un medio que contenga
40 ml de alcohol y l0g de extracto de levadura por litro,
ajustado a pH 6,0, puede ser utilizado también para el en-
riquecimiento. La cervezay la sidra son también excelen-
tes medios de enriquecimiento porque estas bebidas fermer¡.
tadas se parecen mucho a los medios nafurales en los que
predominan las bacterias del ácido acético. Aunque es
preciso asegurar una gran superficie de contacto con el
aire, generalmente no hay que airear vigorosamente el
medio inoculado porque muchas bacterias del ácido acé-
tico crecen mejor en un velo que forman sobre la super-
ficie.
M ¡CROSCOPIA ÓPTICA
Con el fin de comprender el papel indispensable de-
sempeñado por el microscopio en el estudio de los micre
39
organismos, es necesario apreciar las limitaciones intrín
secas del ojo como instn¡mento amplificador. El tamaño
aparente de unobjeto observado porelojohumano estádi-
rect¿mente relacionado con el ámgulo que el objeto sub
tiende en el ojo; de ahí que si se reduce a la mitad su dista+
cia al ojo, se duplica su tamaño aparente. Sin embargo, el
ojo no puede enfocar los objetos sihrados a menos de unos
25 cm, aproximadamente. Ésta es, en consecuencia, la
distancia de máxima ampliación efectiva. Para poder ser
visto, un objeto debe subtender en el ojo un ámgulo de loo
mayor. Para una distancia de25 cm esto corresponde a
una partícula con un diámetro aproximado de 0,1 mm.
La mayoría de las células (y por ello de la mayoría de
los microorganismos unicelulares) son demasiado peque-
ños para ser detectados por el ojo humano, sin otra ayudq
y para observar su forma y estnrchrra, es por lo tanto esen-
cial el microscopio. I-s función del sistema de lentes am-
plificadoras de este instn¡mento, interpuesto entne la mues-
tra y el ojo, consiste en gran parte en aumentar el ángulo
aparente que subtienden en el ojo los objetos que están
dentro del campo del microscopio. Además de este factor
de amplificación son de gran importancia otros dos facto-
res más: el contraste y la rcsolución Para poder ser perci-
bido a través del microscopio, un objeto deben poseer un
cierto grado de contraste consu medio circundante; con
el fin de producir una imagen amplificada clara, el mi-
croscopio debe poseer unpoder de resolucióz suficiente
para permitir la percepción, como objetos separados, de
dos puntos adyacentes muy próximos en la imagen.
El microscopio óptico
Como se expuso en el capitulo l, Leeuwenhoek descu-
brió el mundo microbiano mediante el uso de microsce
pios simples que tenian una sola lente biconvexa de dis-
tancia focal corta. El desanollo y perfeccionamiento de
los más complejos microscopios compuestos que ahora se
emplean necesito casi dos siglos de invesügación en ópti-
ca aplicada.
Un moderno microscopio contiene tres sistemas se-
parados de lentes (figura 2.6). El condensador, inter-
puesto entre la fuente de luz y la muestra, rectiñca los ra-
yos de luz en el plano del campo del microscopio. Elob-
jetívo produce una imagen ampliada del campo micros-
cópico dentro del microscopio, y el ocular amplía más
esta imagen y permite que sea percibida por el ojo.
Las lentes tienen dos defectos ópticos inherentes. No
logran enfocar simultáneamente todo el campo del mi-
croscopio (aberración esJéríca) y producen irisaciones
en torno a los objetos que están en el campo microscópi-
c i ó n c ro m áti c a). E stos defectos pueden elimi-
co (ab e rra
narse en gran parte colocando lentes correctoras adicie
40 Métodos de la microbiología
lmagen en
l'. r'l la retina
>\a/r/-_ _ Cristalino

l-
/\
ri
/\ Sistema de
lentes del ocular
/i
H-
i ;
lmagen de
la muestra

Tubo

I
tl
Platína
.\r '.4e
''l- J
Sistema de
lentes del objetivo
Control del foco ;i
rJ _ Muestra
del condensador lrtl
iltl
iltl

l-
Condensador Sistema de
lentes del condensador
Foco de iluminación
integrado

Fuente de luz
A
a
(b)

FIGURA 2,6
M icroscopio compuesto moderno (a) en el que se señalan sus partes principales. Representación esquemática (b) del sistema óptico de un
microscopio compuesto. El paso de la luz que se muestra está generalizado; no se ha intentado mostrar los fenómenos de refracción de
cada una de las distintas lentes. La luz producida por la bombilla es dirigida al sistema de lentes del condensador que o bien la colima (ilu-
minación deKóhlerl obienlaenfocasobrelamuestra(iluminacióncrítical. Despuésdepasarporlamuestra, laluzatraviesael sistemade
lentes del objetivo. que forma dentro del tubo del microscopio una imagen aumentada de la muestra. Esta imagen es luego amplificada de
nuevo por el sistema de lentes del ocular. el cual, actuando en conjunción con el cristalino del microscopista, forma la imagen final de la
retina.

nales, adyacentes a una lente amplificadora primaria.
Como consecuencip, tanto la lente ocular como la lente
objetivo de un micróscopio compuesto modemo son múl-
tiples y han sido ideadas para reducir al mínimo estas
aberraciones.
Un ajuste correcto de la lente condensador es de im-
portancia crítica para proporcionar una imagen clara.
Cuando se utilizan grandes aumentos, el condensador
debe situarse de manera que proporcione la ílumina-
ción de Kóhler, con la cual la muestra es iluminada por
rayos paralelos de luz.
Poder de resolución
Las propiedades ñsicas de la luz establecen un límite fijo
a la amplificación efectiva obtenible con un microsce
pio óptico. A causa de la naturalezaondulatorio de la luz,
un objeto muy pequeño aparece como si fuera un disco
rodeado por una serie de anillos luminosos y oscuros.
Dos puntos adyacentes pueden distinguirse como sepa-
rados, o <<resueltos>>, solamente si los anillos que los ro-
dean no se superponen. La distancia mínima entre dos
puntos que pueden distinguirse uno de otro se conoce
como límíte o poder de resolucíón y determina la máxi-
ma ampliFrcación útil del microscopio óptico. El ümite
de resolución (d) está definido por la ecuación
0.5;
d- (2.1 )
Nsen r
en donde tr es la longitud de onda de la fuente de luz em-
pleada, a es la mitad del ángulo de la lente objetivo yNes
el índice de refracción del medio que hay entre la mues-
Métodos de la microbiología
tra y la superficie frontal de la lente objetivo. Los térmi-
nos del denominador(N sen a), comúnmente conocidos
como apertura numérica, describen las propiedades de la
lente objetivo. Hasta un cierto límite, un incremento de
la apertura numérica de la lente objetivo incrementa el
poder de resolución. Si el medio que hay entre la mues-
tra y el objetivo es el aire, el diámetro posible de la lente
limita la apertura numérica a 0,65 aproximadamente. El
valor de l/ puede incrementarse llenando el espacio in-
termedio con aceite, gü€ tiene un índice de refracción
mucho más elevado que el aire. Conlentes de inmersíón
en aceite la apertura numérica puede aumentarse hasta
un valor de 1,4, aunque los valores de 1,25 son los más
comunes. Bajo las mejores condiciones que se pueden
obtener, la resolución máxima del microscopio óptico se
aproxima a los 200 nm, con la luz visible de la longitud de
onda más corta (aproximadamente de 426 nm). En otras
palabras, dos puntos que estén a menos de 200 nm de dis-
tancia no pueden resolverse en dos imágenes separadas.
El contraste y su realce
en microscopia óptica
Cuando un pequeño objeto biológico, tal como una célu-
la microbiana, se observa en estado vivo, está normal-
mente suspendido en un medio acuoso, comprimido en
una Frna capa que queda entre el portaobjetos y el cubre-
objetos. La percepción de un objeto así depende del he-
cho de que muestre cierto grado de contraste con el
medio acuoso circundante, como resultado de que atra-
vés de él se transmite menos luz que a través del medio.
Esta transmisión de luz reducida está causada por dos
factores: la luz absorbida por la célula y la luz refractada
fuera del paso óptico del microscopio por diferencia en-
tre los índices de refracción de la célula y del medio
circundante. Con la excepción de las estructuras celu-
lares fuertemente pigmentada (por ejemplo, los clore
plastos) los objetos biológicos absorben muy poca luz en
la región visible del espectro y por ello el contraste que
genera una célula viva es atribuible, casi por completo, a
la refracción de la luz. Sin embargo, su grado de contras-
te puede aumentarse muchísimo por procedimientos
de tinción: tratamiento con colorantes que se hjan se-
lectivamente, bien sea a toda la célula o a ciertos compG
nentes celulares, produciendo una absorción mucho ma-
yor de la luz incidente. La mayoría de los tratamientos de
tinción matan a las células y además, como un paso preli-
minar a la tinción, las células usualmente se Jijan me-
diante un tratamiento quimico destinado a reducir al
mínimo los cambios de estructura postmortem. Entre los
frjadores comúnmente utilizados figuran el ácido ósmico
y los aldehídos, especialmente el glutaraldehido. Sin em-
bargo, en microscopia óptica, el calor es el fijador más
41
FIGURA 2.7
Cápsulas bacterianas, puestas
de manifiesto al dispersar las
células en tinta china. El orga-
nismo que se muestra es Baci-
llus megaterium (X 2 1 6O). Cor-
tesía de C. F. Robinow.
comúnmente utilizado, a pesar de que con frecuencia in-
duce cambios en la forma o en el tamaño de la célula.
Al disponerse de una amplia variedad de microsco-
pios de contraste de fases (véase más adelante), actual-
mente resulta raro tener que teñir las células para hacer-
las visibles; la manera más sencilla, y para muchos fines
la más satisfactoria, de observar los microorganismos
con un microscopio óptico es en estado vivo, comopre-
paraciones húmedas. El principal valor de los procedi-
mientos de tinción está, en p ro p o rc í o n a r i nfo rm a c i ó n e s -
pecífica de la estntctura ínterna o de las propiedades
químícas de las células. Por ello, los métodos de tinción
especiflrcos para el ácido desoxirribonucleico pueden re-
velar la estructura y localización de la región nuclear y
puede ser utilizada toda una variedad de métodos espe-
ciales de ünción para demostrar la presencia de depósitos
intracelulares de sustancias de reservatales como glucG
geno, polifosfato y poli-B-hidroxibutirato. La tinción de
Gram (véase la p. 15 5 ) y la tinción ácidorresistente (véa-
se la p. 548) se uülizan para obtener información acerca
de la composición de las capas de la pared celular de las
células bacterianas. Los denominados colorantes nega-
tivos, que no penetran en las células, son a veces útiles
para revelar capas superficiales de muy bajo índice de re-
fracción, tales como las cápsulas y las capas mucosas
que con frecuencia rodean las células microbianas. Estas
pueden hacerse visibles añadiendo tinta china al medio
de suspensión; como las partículas de carbón no pueden
penetrar a través de la cápsula, ésta aparece como una
zona clara que rodea a la célula (véase la figura 2.7).
AuueNro DEL coNTRASTE poR MICRoScoPIA DE
FASES El relativamente bajo contraste de las células
vivas, tal como se ven con un microscopio óptico con-
vencional, puede aumentarse grandemente mediante el
uso de un instrumento con un sistema óptico modificado
conocido como mícroscopío de contraste defases (figu-
42
ra2.8). La microscopia de contraste de fases está basa-
da en el hecho de que la velocidad de la luz es inversa-
mente proporcional a los índices de refracción de los me-
dios a través de los cuales se propaga. Como la frecuen-
cia de las ondas de la luz es independiente del medio a
través del cual pasa la fase de un rayo de luz que pasa por
un objeto de indice de refracción más elevado que el me-
dio circundante será retrasada relativamente. Un sis-
tema de anillos en el condensador y en el objetivo sepa-
ran los rayos difractados de la muestra de aquellos otros
que no lo están; los dos conjuntos de rayos se recombi-
nan después de que los rayos difractados hayan pasado a
través de un anillo de cristal que introduce una diferen-
cia de fase adicional. El desplazamiento total de la fase
es igual a la mitad de una longitud de onda y, por lo tanto,
cuano los rayos se vuelven a combinar en el plano de la
imagen, la interferencia destructiva aumenta grandemen-
te el contraste de las células o de las estructuras intrace-
lulares, que difieren ligeramente en su índice de refrac-
ción respecto al de su entorno.
Plano de la imagen
Elemento
cambiador de la fase
Lente objetivo
Rayos sin
difractar
\\ll"
N--- Muesrra
\ directamente relacionado con la longitud de onda de la
Le nte
condensador It \\
Diafragma
a nular
F¡GURA 2.8
Representación esquemática del microscopio de contraste de
fases.
Métodos de la microbiología
MrcnoscoprA DE coNTRASTE DE INTERFERENCTA [J¡¿
alternativa óptica para aumentar el contraste es la mi-
croscopia de contraste de interferencia. En un microsce
pio de interferencia, la muestra está iluminada por dos
haces coherentes de luz polarizada en un plano, cuyos
planos de polarización forman ángulo de 90". Después
de pasar por el objetivo, estos dos haces son desplaza-
dos lateralmente, uno en relación al otro, pero muy lige-
ramente (una cantidad aproximadamente igual al limite
de resolución del microscopio). En las zonas fronterizas
entre áreas con diferente índice de refracción existen di,
ferencias de fase entre los dos haces de luz, como sucede
en el microscopio de contraste de fases: estas diferencias
de fase son manipuladas con el ñn de incrementarel con-
traste. Aunque el microscopio de contraste de interferen-
cias no produce halos en torno alas estn¡cturas, tal como
aparecen con el microscopio de contraste de fases, tiene
como desventajas que no produce imágenes claras si el
objeto que se observa es muy delgado y, además, es
mucho más caro. Por ello, la microscopia de contraste de
fases es en general el método preferido para la observa-
ción de preparaciones húmedas de la mayoría de las bac-
terias.
It-Utr¡INnCION EN CAMPO oSCURO Cuando la luz incide
sobre un pequeño objeto, parte se dispersa haciendci que
el objeto aparezca luminoso y por ello visible sobre un
fondo oscuro. La técnica deíluminación en campo oscu-
ro explota este fenómeno y permite detectar objetos tan
pequeños que de otro modo no proporcionan suficiente
contraste. Tal iluminación se consigue mediante el uso
de una clase especial de condensadorque enfoca sobre la
muestra un cono hueco de luz (figura 2.9) cuyos rayos di-
vergentes no entran en el objetivo. Sólo la luz dispersada
por la muestra penetra en el objetivo y es observada.
Microscopia ultravioleta y de fluorescencia
Como el poder de resolución del microscopio óptico está
luz empleada, puede lograrse una ligera mejora de la re-
solución (unas dos veces) mediante el uso de una fuente
de luz ultravioleta. Dado que el vidrio es opaco a la luz
ultravioleta de longitudes de onda cortas, el sistema de
lentes debe ser de cuarzo y debe utilizarse una cámara fe
tográfica para registrar la imagen, ya que el ojo no puede
percibir la luz ultravioleta. Su carestja y complejidad han
limitado el uso de la microscopia ultravioleta. No obs-
tante, una modificación conocida como mícroscopía de
fluorescencía tiene muchos usos biológicos importantes.
Ciertos compuestos químicos que absorben luz ultra-
violeta devuelven parte de la energía radiante como luz
 microbiología
Lente objetivo
Portaobjetos
Lente
condensador
Diafragma
Luz
= GURA 2.9
ieoresentación esquemática de la
iluminación en campo oscuro.
de longitud de onda más larga, situada en la región visi-
ble: este fenómeno se denominafluorescencía. Cuando
un objeto fluorescente se'expone a la luz ultravioleta,
puede ser percibido como un cuerpo brillantemente colo-
reado sobre un fondo negro. Este es el.fundamento de la
microscopia de fluorescencia. Solamente las lentes del
condensador deben ser de cuarzo, ya que es la luz visi-
ble emitida por la muestra fluorescente la que es transmi-
tida a través del microscopio. El principal uso de la mi-
croscopia de fluorescencia en biologia implica la técnica
de inmunofluorescencfa. Cuando un animal es inmuni-
zado con un antigeno específico (por ejemplo, un tipo
particular de bacteria) su suero contiene proteínas que
son anticuerpós, capaces de unirse específicamente al
antígeno inmunizante empleado. Los anticuerpos pue-
den hacerse intensamente fluorescentes por conjugación
química con un colorante fluorescente, y cuando se com-
binan con el anügeno específico éste también se hace
fluorescente. Por lo tanto, mediante microscopia de fluo
rescencia es posible detectar especificamente las célu-
las de un tipo particular de bacterias en una población
microbiana mixta tratada con un antisuero fluorescente
dirigido contra esa bacteria. Esta técnica ha sido tam-
bién utilizada para estudiar el modo de crecimiento de la
pared celular bacteriana (véase el capitulo 6).
43
M IC ROSCOPIA ELECTRÓru ICA
El desarrollo del miscrocopio electrónico es uno de los
principales logros de la ñsica aplicada en el siglo xx y ha
revolucionado nuestro conocimiento de la estructura bio
lógica. Se basó en el descubrimiento de que un campo
electromagnético actúa sobre un haz de electrones de
manera análoga a la acción de una lente de cristal sobre
un haz de fotones. Un haz de electrones tiene las propie-
dades de una onda electromágnética de muy cortalongi-
tud de onda; cuando se acelera a través de un campo
eléctrico, su longitud de onda es inversamente propor-
cional alaraiz cuadrada del voltaje de aceleración. Una
longitud de onda de sólo 0,04 nm, unas 10 000 veces
más corta que la de la luz visible, se obtiene de forma ruti-
naria con voltajes de aceleración de unos 100 kV. El li-
mite de resolución de un microscopio electrónico es, en
consecuencia, varios órdenes de magnitud inferior que el
del microscopio ópüco [véase la Ec. (2.1)l y permite
pues el empleo de aumentos mucho más efectivos. El paso
de los electrones a través de un microscopio electrónico
de transmisión está dirigido de manera análoga al paso de
los rayos de luz a través de un microscopio óptico (figu-
ra2.6). Un haz de electrones proyectado desde un cañón
electrónico se hace pasar por una serie de lentes electre
magnéticas. La lente condensadora colima el haz de elec-
trones en la muestra y,'mediante una serie de lentes
amplificadoras, se produce una imagen ampliada. La
imagen se hace visible al permitir que interfiera con una
pantalla fluorescente (semejante a la cara frontal del
tubo de rayos catódicos de un aparato de televisión).
Como los electrones sólo pueden viajar en el vacío, debe
evacuarse todo el trayecto de los electrones a través del
instrumento; en consecuencia, las muestras deben estar
completamente deshidratadas antes de examinarlas.
Además, sólo pueden ser observadas muestras muy del-
gadas (de un grosor de l0 nm o menos), ya que el poder
de penetración de los electrones en la materia es débil.
Sin embargo, recientemente se handesarrollado micros-
copios electrónicos con voltajes de aceleración de un
millón de kV y sus haces de electrones pueden penetrar
en células intactas de más de un micrometro de grosor.
Estos instrumentos son extremadamente grandes y cos-
tosos y por ello sólo existen unos pocos.
En un microscopio electrónico de transmisión, el con-
traste es el resultado de la dispersión diferencial de los
electrones por la muestra, estando el grado de disper-
sión en función del número y de la masa de átomos que se
hallen en la trayectoria de los electrones. Dado que la
mayoria de los elementos constituyentes de los na:e:.:-
les biológicos son de baja masa, el contraste de e,:,: s :.:-
teriales es débil. Puede resaltarse grandemerii3 3- : -_:.-
ción> con las sales de varios metales pesai:: ]_: : :--
44
plo, plomo, tungsteno, uranio). Estas pueden Fdarse di-
rectamente a la muestra (tinción positiva) o bien pueden
usarse para incrementar la opacidad de los electrones en
el campo circundante (tinción negativa). La tinción ne-
gativa es especialmente valiosa para el examen de es-
tructuras muy pequeñas tales como particulas víricas,
moléculas de proteina y flagelos bacterianos (véase la fi-
gura 6.43). Sin embargo, las células (incluso las de mi-
croorganismos muy pequeños) son demasiado gruesas
para ser examinadas satisfactoriamente en preparacio-
nes enteras. La observación de su estructura fina interna
exige que sean fijadas, deshidratadas, embebidas en un
plástico y seccionadas. f.os cortes ultrafinos (no más
gruesos de 50 nm) se tiñen luegopositivamente con sales
de metales pesados y finalmente se montan para su
examen.
Otras dos técnicas preparativas, elsom breado metá-
lico y lacriofractura, se usan frecuentemente para la ob'
servación de muestras biológicas con el microscopio elec-
trónico de transmisión. Para el sombreado metálico la
muestra desecada se expone con un ángulo agudo a una
corriente dirigida de un metal pesado (platino, paladio u
oro) produciendo así una imagen que revela la estructu-
ra tridimensional del objeto (véase, por ejemplo, la fi-
gura 6.2). En el proceso de criofractura, la muestra se
congela y luego el bloque congelado se fractura con una
cuchilla quedando expuestas varias superficies externas
e internas de la muestra.Lasuperficie fracturada se som-
brea, con un ángulo agudo, con un metal pesado y luego
se evapora sobre la superficie del metal una capa de car-
bono que actúa de soporte. La muestra sombreada se
destruye después por tratamiento químico y la réplica es
examinada. Puede utilizarse una técnica muy semejante,
que difiere únicamente en que deja un período de tiempo
para la sublimación de parte del hielo circundante, antes
del sombreado. Este <criograbado> de la superficie pro
porciona un mayor relieve entre las estructuras y el me-
dio acuoso que las rodea. Estas técnicas han resultado
especialmente valiosas para el estudiode la estructura de
la membrana y de la pared de las células, ya que la frac-
tura plana con frecuencia sigue la superficie de una capa
de la pared o bien la región interior (hidrofóbica) de las
membranas unitarias (véase, por ejemplo, la figura 3.5).
Microscopio electrónico de barrido
El microscopio óptico y el electrónico de transmisión
operan de una manera fundamentalmente igual: un haz
ancho de energía electromagnética (formado por foto-
nes o por electrones) se hace pasar a través de la mues-
tra; como resultado, al pasar el haz emergente a través de
unas lentes (de cristal o electromagnéticas) se forma una
imagen ampliada. En ambos ihstrumentos se utiliza el
Métodos de la microbiología
principio de refracción de la eneryía electromagnéüca
por medio de l.entes, para formar una imagen aumentada
de la muestra. El microscopio electrónico de barrído
hace uso de un principio totalmente diferente para la
formación de la imagen, es decir el de la amplificación
electrónica de señales generadas al irradiar la superficie
de la muestra con un haz muy estrecho de electrones.
Esta irradiación hace que la muestra desprenda elec-
trones de baja energía (secundarios) que pueden ser re-
cogidos sobre una placa cargada posiüvamente (unrÍno-
do) generando de este modo una señal eléctrica que es
proporcional al número de electrones que inciden en el
ánodo. Como este número de electrones depende del nú-
mero desprendido (que a su vez es función del ángu-
lo de una determinada región de la superficie en relación
alhazde electrones) y del número reabsorbido por el nú-
mero de protuberancias circundantes en la superficie de
la muestra, la señal eléctrica puede ser uülizada para ge-
nerar una imagen de la muestra (figura 2.lO). Mediante
el uso de un generador de barrido se hace que el haz de
electrones atraviese la muestra siguiendo un rastreo de
Cañón electrónico (genera
el haz de electrones)
Lentes electromagnéticas
(coliman el haz de electrones)
Haz de electrones
Muestra
Tubo de rayos catódicos
FIGURA 2.10
Representación esquemática de un microscopio electrónico de
barrido.
trama o barrido. La señal generada por los electrones se-
cundarios que inciden sobre el ánodo se ampliFrca y se
utiliza para modular la intensidad de un punto que barre
un tubo de rayos catódicos (esencialmente igual que el
tubo de imagen de un receptorde televisión) poniéndola
Métodos de la microbiología
en preciso registro con la pauta de barrido del haz de
electrones. De este modo, en el tubo de rayos catódicos
aparece una imagen amplificada de la topografia de la
superhcie de la muestra. La profundidad de foco de este
LECTU RAS ADICIGNALES
Libros
MeyNeLl, G. C. y E. Mevuetr, Bacteríología Experi-
mental. Teoría y práctica. Barcelona: Omega, 1969.
Nonrus, J. R, D. W. R¡ssoNs, C. Boors y T. BnnceN
(editores). Methods ín Microbíology. Londres y Nueva
York: Academic Press, 1969-actualidad. Una obra de refe-
rencia en muchos volúmenes.
45
instrumento es de varios miümetros y su gama de ampli-
ficación efectiva abarca desde uns 20 X a más de
20 000 X. Un ejemplo del tipo de imagen obtenido se
muestra en la figura 18.5.
Gerurenor, P., R. G. E. Munmy, R N. Cosnrlow, E.
W., NesrnR, W.A. Wooo, R N. Knrec y G.B.Pruu-ps.
Manual of Methods for General Bacteriolo¿y. Washing-
ton: American Society for Microbiology, 1981.
SprNcrR, M. Fundamentals of Líght Mícroscopy. Nueva
York: Cambridge University Press, 1982.
SI¡RR, M. P., H. Srolp, H. G. Tnüpnn, A. Bnrlows y
H. G. ScHr.ecer. (editores). The Prokaryotes. Nueva York,
Heidelberg y Berlín: Springer-Verlag, 1981. Un extenso
compendio(endos volúmenes) de los métodos de enriqueci-
miento de la mayor parte de grupos bacterianos.