Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Agrarias

Escuela de Agronomía

Efecto de la inoculación de bacterias

solubilizadoras de fósforo a través de
bioencapsulados en trigo (Triticum aestivum L.)

Memoria presentada como parte de los

requisitos para optar al Título de
Ingeniero Agrónomo

Claudio Andrés Ceballo Mellado

VALDIVIA – CHILE
2012
PROFESOR PATROCINANTE:

____________________________________
Ernesto Moya Elizondo
Ph.D., M.CV., Ing. Agr.
Departamento de Producción Vegetal
Universidad de Concepción

PROFESOR COPATROCINANTE:

____________________________________
Ricardo Fuentes
M.Sc., Ing. Agr.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal

PROFESORES INFORMANTES:

___________________________________
Mauricio Schöebitz
Dr., Ing.Agr.
CEBAS SCIC Murcia, España
 i

INDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN 1

SUMMARY 2

1 INTRODUCCIÓN 3

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5

2.1 Fósforo en los suelos 5

2.2 Nutrición fosforada del cultivo de trigo. 6

2.2.1 Demanda y suministro de fósforo. 7

2.2.2 Eficiencia de absorción de fósforo. 8

2.2.3 Requerimiento interno de fósforo. 9

2.2.4 Eficiencia de fertilización fosforada. 9

2.2.5 Roca fosfórica como fertilizante en los sistemas agrícolas. 9

2.3 Obtención de bacterias rizosféricas que generan beneficios para 12

los cultivos.

2.3.1 Bacterias promotoras de crecimiento vegetal. 12

2.3.2 Bacterias solubilizadoras de fósforo utilizadas como 13

biofertilizantes.

2.3.3 Ácidos orgánicos como medio para la solubilización de P. 14

 ii

2.4 Aislamiento y selección en el desarrollo de un biofertilizante 15

para su inoculación en cultivos agrícolas.

3 MATERIAL Y METODOS 17

3.1 Prueba de patogenicidad de cepas bacterianas. 17

3.2 Evaluación de capacidad de solubilización de fósforo por 17

bacterias cepa Pseudomonas fluorecens C139 y cepa Serratia
spp.T3 en sustrato de arena de cuarzo.

3.3 Proceso de encapsulación de cepa P. fluorecens C139 y cepa 18

Serratia spp. T3

3.3.1 Pruebas con distintas matrices de gelificación. 18

3.3.2 Pruebas de contaminación de almidón y alginato. 21

3.3.3 Preparación de cultivo bacteria para la preparación de 21

bioformulaciones

3.3.4 Bioencapsulación. 21

3.4 Evaluación de propiedades de los bioencapsulados. 22

3.4.1 Análisis de actividad del agua. 22

3.4.2 Ensayo para establecer la concentración de las bacterias 22

solubilizadoras de P y el grado de contaminación de las
biocápsulas.

3.5 Ensayo para establecer colonización de las dos cepas 23

solubilizadoras de P bioencapsuladas en raíces de trigo.
 iii

3.6 Ensayo para determinar el efecto de las dos bacterias 23

solubilizadoras de fósforo (P), cepa P. fluorecens C139 y cepa
Serratia spp. T3 en plantas de trigo bajo condiciones
controladas.

3.6.1 Semillas de trigo. 23

3.6.2 Sustrato. 24

3.6.3 Forma insoluble de P. 24

3.6.4 Sistema de fertilización por soluciones nutritivas 25

3.6.5 Condiciones experimentales de crecimiento. 26

3.7 Evaluación de los tratamientos 25

3.7.1 Determinación del peso seco 26

3.7.2 Determinación de altura de plantas. 26

3.7.3 Análisis de la concentración de fósforo en los tejidos. 26

3.8 Diseño experimental y análisis estadístico 27

4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 28

4.1 Determinación de matriz de bioencapsulación. 29

4.2 Prueba de contaminación de Almidón y Alginato. 29

4.3 Prueba de Patogenicidad con cepas aisladas la temporada 30

2011.

4.4 Resultados del ensayo de solubilización de roca fosfórica en 31

sustrato de arena de cuarzo.
 iv

4.5 Determinación de la concentración bacterial de las capsulas y el 32

grado de contaminación con otras bacterias.

4.6 Resultado del ensayo para establecer la colonización en raíces 33

de trigo inoculadas con las dos cepas solubilizadoras de fósforo
(P) bioencapsuladas.

4.7 Resultados del ensayo para determina el efecto de las dos 34

bacterias solubilizadoras fósforo (P), cepa P. fluorecens C139 y
cepa Serratia spp.T3 en cultivo de trigo bajo condiciones
experimentales.

4.8 Resultados del ensayo para determinar el efecto de la bacteria 38

solubilizadora de fósforo (P) cepa Serratia spp.T3 en cultivo de
trigo en condiciones experimentales.

5 CONCLUSIONES 42

6 BIBLIOGRAFIA 43

7 ANEXOS 49
 INDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1 Principales depósitos de roca fosfórica existentes en Chile y sus 10

características generales.

2 Contenido de anhídrido fosfórico y óxido de calcio de fosfatos 11

solubles en agua y de rocas fosfóricas que se comercializan en el
sur de Chile.

3 Mezcla de concentraciones de de carragenano y Cloruro de calcio 20

evaluadas para determinar una adecuada gelificación con el
objetivo de ser utilizado en una matriz de encapsulación.

4 Mezcla de concentraciones de almidón y alginato evaluadas para 20

determinar una adecuada gelificación en CaCl2 al 1,5% con el
objetivo de ser utilizado en una matriz de encapsulación.

5 Concentraciones de fósforo (P) soluble promedio obtenido después 31

de una semana de incubación con bacterias solubilizadoras de P en
sustrato de arena de cuarzo.

6 Recuento Unidades Formadoras de Colonias (UFC), de bacterias 32

solubilizadoras de fósforo y contaminantes observados en
biocápsulas de alginato y almidón incubadas en medio agar
Pikovskaya.
 vi

7 Recuento unidades formadoras de colonias en medio agar 33

Pikovskaya y concentración bacterial por mililitro observada en
raíces de trigo cv. Pandora inoculadas con dos cepas
solubilizadoras bioencapsuladas.

8 Efecto de la inoculación de bacterias solubilizadoras de fósforo (P) 34

cepa Pseudomonas fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3 sobre
biomasa aérea, biomasa radical, altura de plantas y concentración
de fósforo (P) en los tejidos de platas de trigo bajo distintos
tratamientos fosforados.

9 Efecto de la inoculación de bacterias solubilizadoras de fósforo (P) 38

cepa Serratia spp. T3 sobre la biomasa aérea, biomasa radical,
altura de plantas y concentración de fósforo (P) en el tejido de
plantas de trigo crecidas bajo condiciones de déficit de fósforo
soluble disponible para las plantas.
 vii

INDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Ensayo de patogenicidad de cepas bacterianas con actividad 30

solubilizadora de P en cortes de papa

2 Valores promedio de concentración de fósforo (P) en plantas de trigo 36

de los distintos tratamientos de niveles fosforados (0Absoluto, 0ppm,
3ppm) y de inoculación con bacterias solubilizadoras de fósforo cepa
P. fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3.

3 Valores promedio de concentración de fósforo (P) en plantas de trigo 39

de los distintos tratamientos de niveles fosforados y de inoculación
con bacterias solubilizadoras de fósforo cepa Serratia spp. T3.
 viii

INDICE DE ANEXOS

Anexo Página

1 Medios de cultivo utilizados 49

2 Caracterización del alginato, polisacárido utilizado en la producción 49

de bioencapsulados

3 Descripción Roca Fosfórica BIFOX 50

4 Prueba de viabilidad y contaminación de las biocápsulas. Recuento 51

Unidades Formadoras de Colonias, para establecer el grado de
presencia de otras bacterias.

5 Concentraciones de P soluble después de una semana de 52

incubación en sustrato de arena de cuarzo incubado con dos
bacterias solubilizadoras de fósforo.

6 Recuento unidades formadoras de colonias y cálculo de 52

concentración bacterial por mililitro aisladas de raíces de trigo
inoculadas en medio Pikovskaya.

7 Mediciones obtenidas de experimento realizado con plantas de trigo 53

inoculadas con bacterias solubilizadoras de fosforo cepa
Pseudomonas Fluorecens C139, cepa Serratia spp. T3 y sin
inoculación (S/B).

8 Mediciones obtenidas de experimento realizado con plantas de trigo 54

inoculadas con bacterias solubilizadoras de fósforo cepa Serratia
spp.T3 y sin inoculación (S/B).

9 Análisis estadístico realizado en los distintos experimentos 56

conducidos en esta tesis.
 1

RESUMEN

El laboratorio de Bacteriología y Bio-insumos de la Universidad Austral de Chile ha

trabajado en la selección de distintas cepas bacterianas con capacidad solubilizadora
de fósforo inorgánico insoluble que han sido aisladas de diferentes medios naturales y
agrícolas. En esta memoria fue desarrollada una metodología para evaluar en un
periodo de dos meses las bacterias con mayor potencial de solubilización y su efecto
sobre plantas de trigo, dado los altos costos, recursos y tiempo que requieren los
ensayos en campo. Para este estudio se seleccionaron dos cepas, Pseudomonas
fluorecens C139 y Serratia spp. T3.

En este estudio se realizaron tres ensayos de los cuales el primero permitió evaluar el
comportamiento solubilizador de P de las cepas seleccionadas sobre distintas
concentraciones de roca fosfórica en sustrato de arena de cuarzo, luego un segundo
ensayo para evaluar la colonización de estas mismas dos cepas de las raíces de
plantas de trigo. El tercer ensayo evaluó el efecto de la inoculación con biocápsulas
de las dos cepas sobre plantas de trigo bajo distintas concentraciones deficitarias de
fósforo más roca fosfórica agregada a un sustrato arena de cuarzo para evaluar la
entrega adicional de fósforo que realiza dicha cepa bacteriana solubilizando la roca
fosfórica que se encontraba mezclada con el sustrato.

Se pudo observar una colonización exitosa de las bacterias a las raíces de las plantas
y un aporte adicional de fósforo a las plantas en el periodo de dos meses producido por
la solubilización de la roca fosfórica utilizada en el sustrato como fuente insoluble de
fósforo. Los resultados muestran un aumento significativo en la concentración de
fósforo en el tejido de las plantas crecidas bajo condiciones subóptimas de fósforo
soluble, pero no se presentan diferencias significativas en biomasa aérea, radical ni en
altura de plantas.
 2

SUMMARY

The laboratory of Bacteriología y Bio-insumos at the Universidad Austral de Chile has

worked in the selection of phosphate solubilizing bacterial strains, which have been
isolated from different natural and agricultural sources. In this thesis, a methodology to
assess during a period of two months the bacteria with higher potential for phosphorus
solubilization and their effects on wheat plants was assessed. This work was
conducted because the high costs, resources and time required for field testing. For this
study we selected two bacterial strains, Pseudomonas fluorecens C139 and Serratia
spp. T3.

In this study, three experiments were conducted. The first experiment allowed to
evaluate the performance of the selected P solubilizer strains on different
concentrations of phosphate rock in quartz sand substrate. A second experiment was
conducted to evaluate the colonization of the two strains on wheat roots. The third test
evaluated the effect of inoculation with biocapsules of the two bacterial strains on wheat
plants under different concentrations of soluble phosphorus deficit plus phosphate rock
added to a substrate of quartz sand. This experiment evaluated the additional release
of phosphorus that makes the bacterial strains solubilizing the phosphate rock mixed
with the substrate.

It was observed a successful colonization of bacteria to the plant roots and an extra
supply of phosphorus to plants in the period of two months produced by solubilization of
phosphate rock used as an insoluble source of phosphorus in the substrate. The
results showed a significant increase in the phosphorus concentration in plant tissue
under phosphate deficit, but not significant differences were observed for aboveground
biomass, root biomass and plant height.
 3

1 INTRODUCCION

La intensificación de la agricultura a través del uso excesivo de fertilización química ha

traído serios problemas en algunos agro-sistemas en el mundo, principalmente de
contaminación de las aguas. Además, se suma a lo anterior el gran gasto energético
que es necesario para la producción de estos insumos agrícolas. Sin embargo, su uso
es necesario para que los cultivos alcancen producciones rentables para el agricultor.
El fósforo es el segundo nutriente más utilizado en la agricultura a nivel mundial por lo
cual existe una alta demanda para satisfacer las necesidades de cultivos de alto
rendimiento. En el sur de Chile, los suelos, por sus características mineralógicas y por
su origen volcánico, retienen fuertemente el fósforo en la matriz del suelo
principalmente por el tipo de arcillas que poseen y porque este nutriente precipita con
el aluminio y el hierro. Por esto, la eficiencia de utilización de los fertilizantes fosforados
es baja en estos suelos, por lo cual significa un problema para los agricultores.
Los fertilizantes químicos son en la actualidad la principal fuente de aporte nutricional
para los cultivos y su uso es necesario para el desarrollo de la agricultura moderna. Sin
embargo, los excesos de nitrógeno pueden infiltrarse en las aguas subterráneas o ser
arrastrados a cursos de agua. Esta sobrecarga de nutrientes provoca la eutrificación de
lagos, embalses y estanques y da lugar a una explosión de algas que suprimen otras
plantas y animales acuáticos, dañando los ecosistemas acuáticos por otra parte los
fertilizantes fosforados requieren de procesos químicos y utilización de ácidos para su
solubilización. No obstante lo anterior, el uso de biofertilizantes puede complementar la
nutrición de cultivos, reduciendo el impacto que tienen la contaminación que pueden
causar los fertilizantes químicos. La biofertilización está basada en microorganismos
que influyen sobre el abastecimiento de nitrógeno y fósforo hacia el vegetal; además,
éstos cumplen otras funciones no menos importantes, tales como: estimular el
desarrollo radicular asociado a la liberación de fitohormonas y efecto protector contra
distintas enfermedades de la raíz y el follaje. El desarrollo radical extra es materia
orgánica que se incorpora al suelo, produciendo beneficios significativos en la mayor
retención de agua y nutrientes, mejor estructura del suelo y mejor permeabilidad.
La biofertilización es una tecnología agrícola que puede ayudar a mitigar el impacto
económico y ambiental que generan los fertilizantes tradicionales. Así, la inoculación
 4

de microorganismos tales como hongos micorrízicos, bacterias fijadoras de N y/o

solubilizadores de fósforo en las semillas o en el suelo producen efectos aditivos en el
desarrollo de cultivos como mayor rendimiento, mejor calidad fitosanitaria y aumento
en el contenido de materia orgánica del suelo. Considerando las ventajas asociadas
al uso de los biofertilizantes y la problemática medio ambiental asociada al mal uso y
costos de los fertilizantes químicos es necesario el desarrollo de biofertilizantes para
lograr una agricultura sustentable. En este aspecto, el laboratorio de Bacteriología y
Bio-insumos de la Universidad Austral de Chile ha trabajado en la selección de
distintas cepas bacterianas con capacidad solubilizadora de fósforo inorgánico
insoluble que han sido aisladas de diferentes medios naturales y agrícolas. Estas
bacterias solubilizadoras han sido sólo evaluadas bajo condiciones in Vitro, y
requieren que se evalúe su efecto sobre en especies vegetales de importancia
comercial.

Basado en los antecedentes anteriores, se plantea la hipótesis que la inoculación con 2

cepas solubilizadoras de fósforo aisladas in-vitro produce mayor absorción de fósforo y
mayor crecimiento en plantas de trigo (Triticum aestivum L.) debido al aumento en la
disponibilidad de este nutriente en el suelo.

Objetivos generales
Desarrollar una metodología para evaluar el efecto de la adición de bacterias
solubilizadoras de P sobre plantas de trigo crecidas bajo condiciones controladas en un
periodo de dos meses.

Objetivos específicos
- Determinar el efecto de las distintas cepas solubilizadoras de P sobre el desarrollo
y la biomasa total de las plantas de trigo.
- Determinar la concentración fósforo foliar para establecer la absorción de fósforo
como indicador de la solubilización realizada por distintas cepas bacteriales.
- Establecer que cepa tienen un mayor efecto promotor de crecimiento sobre los
cultivos de trigo.
 5

2 REVISION BIBLIOGRAFICA

2.1 Fósforo en los suelos.

El fósforo después del nitrógeno, es el nutriente inorgánico más requerido por plantas y
microorganismos y además, en el suelo es un factor limitante del desarrollo vegetal a
pesar de ser abundante tanto en formas inorgánicas como orgánicas (ALEXANDER,
1980). Las plantas deben absorberlo del suelo, donde se encuentra en muy baja
concentración, normalmente en niveles que varían entre 5 y 30 mg kg-1. Estos índices
bajos del nutriente se deben a que el fósforo soluble reacciona con iones como el
calcio, el hierro o el aluminio que provocan su precipitación o fijación, disminuyendo su
disponibilidad para los vegetales (RODRÍGUEZ Y FRAGA 1999). Los fosfatos
inorgánicos aplicados como fertilizantes químicos también son inmovilizados en el
suelo y como consecuencia no son solubles para ser aprovechados por los cultivos
(PEIX, et al. 2001). Por lo tanto se considera, que la solubilización de distintas rocas
fosfatadas y de otras fuentes de fósforo inorgánico por los microorganismos del suelo
es una alternativa fundamental para incrementar la cantidad de nutriente disponible
para las plantas (ILLMER Y SCHINNER 1992).

El fósforo, aplicado a los suelos como fertilizante para suplir los requerimientos del
cultivo, reacciona con la fase sólida quedando parte importante del P retenido en forma
no disponible; en consecuencia la disponibilidad del fósforo aplicado dependerá de la
capacidad de retención y deserción que presenten los suelos.

En los suelos de origen volcánico del sur de Chile, Andisoles y Ultisoles, el fósforo
reacciona con el alofan, óxidos hidratados de hierro y aluminio, lo que implica que se
presenten valores de retención de P aplicado superiores al 85% en los Andisoles y
alrededor de 70 % en los Ultisoles (HONORATO et al. , 1984). En Chile, el nivel de
suficiencia para el P disponible (P-Olsen) para un amplio grupo de cultivos ha sido
estimado en 16 mg kg-1 de P, entre ellos el cultivo de trigo en Andisoles (RODRÍGUEZ ,
1990).
 6

2.2 Nutrición fosforada del cultivo de trigo.

Los altos rendimientos a alcanzar por un cultivo requerirán fertilizaciones debido a que
el suelo no es capaz de suministrar el total de nutrientes requerido. De esta forma se
corrigen deficiencias naturales de ciertos elementos en el suelo, como es el caso del
fósforo y adicionalmente devolver al suelo los elementos retirados producto de la
exportación producida por la cosecha de los cultivos (BATTEN, 1992).
La productividad a alcanzar es el rendimiento posible de obtener dependiendo de las
condiciones del agro ecosistema. Este rendimiento potencial se ve claramente reflejado
a través de dos tasas. La tasa de crecimiento y la tasa de desarrollo del cultivo
(PINOCHET, 2000)

Para conocer los requerimientos de fósforo por parte del cultivo de trigo es necesario
determinar la absorción fósforo del mismo. La absorción de fósforo del cultivo es una
variable derivada que resulta de la combinación entre la productividad de materia seca
y la concentración interna de fósforo del cultivo. A través de este parámetro derivado
se puede determinar la tasa de absorción de fósforo, la translocación de fósforo, la
absorción directa hacia los granos y el índice de extracción en la cosecha.

Ambos parámetros determinan la eficiencia interna de uso de fósforo, siendo este

dependiente de la acumulación y posterior translocación desde los órganos fuente
hacia el grano, reflejándose en el requerimiento interno de fósforo. Fundamentalmente,
las interrelaciones entre el clima y el cultivo están reflejadas en la demanda del
nutriente, las interrelaciones entre el suelo y el cultivo en el suministro del nutriente y el
efecto de manejo de fertilizantes en las relaciones suelo-cultivo a través de la eficiencia
de fertilización. De esta forma la formulación general para la estimación de la dosis de
fertilización es la siguiente.
 7

La estrategia de aminorar la baja fertilidad de P para la producción en suelos ácidos

con las aplicaciones de corrección de P se limita económicamente y ambientalmente,
debido a las altas cantidades de fertilizante fosfatado necesario y la alta capacidad de
fijación de P en estos suelos (HINSINGER, 2001)

2.2.1 Demanda y suministro de fósforo. La demanda de fósforo es dependiente del

cultivo y del estado de desarrollo y se genera en función del rendimiento a alcanzar del
cultivo, el índice de cosecha y su requerimiento interno. Por su parte, el suministro se
entiende como el aporte de nutriente por parte del suelo. Según RODRIGUEZ et al.
(2001), el suministro de fósforo en el suelo depende de dos parámetros: la
disponibilidad de P-Olsen en el suelo y la eficiencia de absorción radicular de fósforo
del cultivo.

El fósforo se encuentra formando parte de dos fracciones: una fracción pasiva y otra
activa. El fósforo de la fracción pasiva es el resultado de reacciones de adsorción en
que el fósforo queda retenido en el interior de las arcillas y de óxidos de Fe y Al, de
reacciones de precipitación muy insolubles y de reacciones ligadas a la materia
orgánica muy estabilizada en el suelo. La fracción pasiva se caracteriza por no estar en
equilibrio directo con el fósforo que se encuentra en la solución y por no participar en la
disponibilidad de fósforo durante la temporada de cultivo. El fósforo de la fracción
activa proviene de las mismas reacciones de adsorción y precipitación, principalmente
en la superficie de las arcillas y se encuentra en un equilibrio rápido con el fósforo de la
solución del suelo. Por ello, el fósforo activo determina la disponibilidad de fósforo en el
suelo para los cultivos (RODRÍGUEZ et al., 2001). El fósforo en la solución se
encuentra en dos formas disponibles para la planta; H2PO4 y HPO4. La concentración
en la cual estén presentes estos va a depender del pH que presente el suelo, con
 8

valores de pH mayor a 7,2 se hace presente la forma HPO4 y a su vez pH menor a 7,2
incrementa su concentración la forma H2PO4 (MENGEL y KIRKBY, 1982).

El fósforo extractable es medido por el método Olsen (NaHCO3, pH 8,5) que representa
la fracción de fósforo activo y esta correlacionado con el fósforo absorbido por los
cultivos. De este modo el P-Olsen es un indicador de la disponibilidad de fósforo en el
suelo (RODRIGUEZ et al., 2001). El fósforo luego de su aplicación comienza a
disminuir a través del tiempo como P-Olsen. Esto se debe a una adsorción hacia el
interior de la matriz coloidal. Esta disminución del fósforo extractable Olsen trae
consigo un incremento del fósforo no extractable Olsen y en consecuencia la dificultad
de los cultivos para absorber el fósforo activo del suelo. La fracción residual de fósforo
aplicado que permanece como fósforo extractable Olsen en el tiempo ha sido descrita
como una función potencial, la cual es dependiente del tiempo y temperatura e
independiente del tipo de suelo y de la cantidad de fósforo aplicado (RODRIGUEZ et
al., 2001).

A medida que los cultivos se van desarrollando, estos van generando una demanda de
nutriente, la cual se utiliza para satisfacer sus procesos metabólicos. Esta demanda es
variable para cada cultivo, la cual va a depender del potencial genético que ellos
tengan, por lo tanto, el cómo se exprese este potencial va depender del clima, suelo y
nivel tecnológico utilizado. Dicho de otra manera, la demanda, en este caso del fósforo;
va depender del rendimiento esperado del cultivo, el índice de cosecha y su
requerimiento interno.

2.2.2 Eficiencia de absorción de fósforo. La eficiencia de absorción de fósforo del

cultivo determina la recuperación del fósforo del fertilizante aplicado. Este parámetro va
a estar directamente relacionado con el cultivo y es afectado por el sistema radical del
cultivo, la capacidad de exploración del mismo, que se asocia a interceptar zonas de
alta concentración de fósforo activo dadas por los gránulos de fertilizantes
(RODRIGUEZ et al., 2001).

En cualquier suelo factores que limiten en el desarrollo radicular, y que alteran el

transporte del fósforo de la solución a la superficie de las raíces pueden afectar a la
 9

eficiencia de absorción. Así el manejo del régimen hídrico del suelo, las condiciones
físicas por el excesivo laboreo en los cultivos, y las deficiencias de otros nutrientes,
modifican la eficiencia de absorción de los cultivos así como también la producción
máxima alcanzable (RODRIGUEZ, 1993).

2.2.3 Requerimiento interno de fósforo. El requerimiento de fósforo es la

concentración mínima óptima del nutriente demandado por el cultivo para su óptimo
crecimiento (RODRÍGUEZ et al., 2001). El requerimiento interno determinado para el
trigo en Chile es de 0,17% (PINOCHET, 2000).

2.2.4 Eficiencia de fertilización fosforada. Determina la cantidad de P que quedara

disponible para el cultivo luego de aplicar un fertilizante fosforado. La parte que no es
recuperada es la fracción de fósforo aplicada no extractable de P-Olsen, y corresponde
a la reacción rápida inicial de adsorción de fósforo en la superficie de la matriz coloidal.
El tamaño de la fracción de fósforo aplicada no extractable de fósforo Olsen, depende
de la capacidad de retención de fósforo del suelo (cp). Este índice está muy
correlacionado con el aluminio extractable del suelo a diferencia del pH (RODRIGUEZ,
1993).

Factor de conversión Olsen es un factor de retención de fósforo en el suelo. Este factor

permite estimar la cantidad (kgha-1) de fósforo necesaria aplicar en un suelo para
obtener 1 ppm de fósforo extractable Olsen en el suelo. (RODRIGUEZ et al., 2001).

FCO =Prof *Da / cpP ( ppm P Olsen/ppm P aplicado)

FCO = Factor conversión Olsen (kg P/ha/ppm Olsen)

Prof = Profundidad (dm)
Da = Densidad aparente (gcm3)
cp = capacidad de retención de P

2.2.5 Roca fosfórica como fertilizante en los sistemas agrícolas. Con el término
rocas fosfóricas se conoce a los minerales que contienen P como es el caso de las
apatitas, incluyendo fluorapatita, cloroapatita e hidroxiapatita. Hay grandes depósitos
 10

en Rusia, Estados Unidos, África del Norte y China; también existen importantes
reservas en Brasil, Perú y México (SPERBER 1958a; HOFFLAND, 1992). Aunque no
tan importantes, los depósitos chilenos se ubican entre la II y IV Región (Cuadro 1).
Estos depósitos están conformados de fosforitas de origen sedimentario marino con
algunos depósitos de apatita asociados a rocas ígneas metamórficas. Se consideran
las reservas totales de fosforita en 3,7 x108 ton métricas con un contenido que varía
entre 6 y 30% P2O5, (ROJAS, 2006). En el cuadro 2 se hace una comparación de
contenido P2O5 y CaO de fertilizantes solubles y de diferentes fuentes de rocas
fosfóricas que se comercializan en la Región de Los Lagos y Los Ríos.

CUADRO 1 Principales depósitos de rocas fosfóricas existentes en Chile y sus

características generales.
Minerales Rocas Localización Ley promedio Toneladas
Fosfóricos Asociadas del deposito P2O5 % Métricas
APATITA Ígnea y Sector 12-30 4 millones
metamórfica, occidental de la
granítica, II y IV
intrusivas Regiones. 12-30
Pampa No
Soledad estimado
(Chañaral)
FOSFORITAS Rocas Mejillones, II 6,2 56 millones
sedimentarias Región
marinas, Bahía Inglesa 7-17 88 millones
Carbonato de Bahía Salado
fluorapatitas o III Región 5-20 30 millones
francolitas Tongo y
Guanaqueros
IV región 4-22 200 millones
Arauco VIII
Región
FUENTE: Adaptado de VALDEBENITO y GUTIERREZ. 1979; OSSES., 1986.
 11

CUADRO 2 Contenido de anhídrido fosfórico (P2O5) y óxido de calcio (CaO) de

fosfatos solubles en agua y de rocas fosfóricas que se comercializan
en el sur de Chile.
Fosfatos solubles en agua. P2O5 (%) CaO (%)
Fosfato monoamónico 50 2.4
Fosfato diamónico 45 1
Superfosfato triple 45 20
Superfosfato normal 23 32

Rocas fosfóricas insolubles en agua.

Bifox Caldera-Chile 18 33
Sechura Sechura-Perú 30 48
Tribono La Serena-Chile 20 27

FUENTE: SIERRA 1990.

El fósforo contenido en la roca fosfórica es asimilado por la planta de acuerdo al origen

de ésta y es mayor según el grado de sustitución isomórfica de la apatita (CO3 por
PO4) lo que reduce el tamaño de los cristales y aumenta la superficie específica de los
agregados. Dentro de los factores de suelo que afectan la efectividad de las rocas
fosfóricas se encuentran el pH, calcio, aluminio intercambiable, contenido de fósforo,
mineralogía de las arcillas y porcentaje de materia orgánica (TISDALE et al., 1993).
Para un efecto favorable en la aplicación de la roca fosfórica el pH debe ser bajo
(ácido) menor a 6,5, dado que se ha estimado que el efecto de este material fertilizante
a un pH mayor pierde efectividad.

La reactividad de las rocas fosfóricas está determinada por su composición química y

puede ser evaluada experimentalmente por su solubilidad en extractantes ácidos
diluidos (CAMPILLO, 1991), basados en ensayos de solubilización de fósforo de la
roca en citrato de amonio, ácido cítrico y ácido fórmico.
 12

2.3 Obtención de bacterias rizosféricas que generan beneficios para los cultivos
agrícolas.

Hiltner en 1904 observó por primera vez la acumulación de microorganismos en la

zona radical y propuso el término “rizósfera” como la zona mas próxima a las raíces
donde existe una interacción entre la planta los microorganismos y el suelo-. Los
exudados radicales de las plantas, conformados por diversas substancias crean
alrededor de estas zonas un ambiente nutricional enriquecido que favorece el
crecimiento bacteriano, dentro de estos exudados se encuentran carbohidratos y
aminoácidos. Sin embargo, la composición y cantidad de exudados varían con la
especie presente y las condiciones abióticas, tales como el agua y la temperatura.
(MAYZ-FIGUEROA, 2004).

2.3.1 Bacterias promotoras de crecimiento vegetal. En la microflora conviven

distintos géneros bacterianos. Estos se encuentran preferentemente interactuando con
las raíces de las plantas. Dicha acción puede ser benéfica, perjudicial o neutral desde
el punto de vista del desarrollo y crecimiento vegetal. Aquellas bacterias rizosféricas
capaces de impactar positivamente sobre el crecimiento de cualquier especie vegetal
son comúnmente conocidas como rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas
(PGPR o “plant growth promoting rhizobacteria” para su sigla en inglés) (GLICK et al.,
1999).

Existen varios mecanismos por los cuales PGPR afectan positivamente a las plantas,
tales como: capacidad de producir sustancias biológicamente activas o reguladores del
crecimiento vegetal (fitohormonas, ácidos orgánicos, sideróforos, etc.), fijación de
nitrógeno atmosférico, solubilización de fosfatos insolubles y producción de antibióticos
que suprimen microorganismos del suelo deletéreos. La producción de sustancias
biológicamente activas o de reguladores de crecimiento es uno de los principales
mecanismos a través del cual PGPR influyen en el crecimiento de las plantas y el
desarrollo (ARSHAD y FRANKENBERGER, 1998).

Se puede considerar a una rizobacteria como PGPR para ser usada en cultivos
agrícolas, cuando presente las siguientes cuatro características: (a) Que no requieran
 13

de la invasión interna de tejidos en plantas, como ocurre en hongos micorrízicos que

forman arbúsculos o Rhizobium que produce nódulos en las raíces de fabáceas (b)
Que tengan una elevada densidad poblacional en la rizósfera después de su
inoculación, ya que una población que declina rápidamente tiene una baja capacidad
competitiva con la microflora nativa del suelo. (c) Que presenten capacidad de
colonización efectiva en la superficie de la raíz y, como consecuencia, puedan influir
positivamente en el crecimiento de la planta. (d) Que no produzcan daño en el hombre
ni a otros microorganismos. Por lo tanto, el uso de PGPR que potencien el crecimiento
y rendimiento de los cultivos pueden convertirse en una emergente tendencia en la
agricultura del futuro (PAL et al., 2000).

2.3.2 Bacterias solubilizadoras de fósforo utilizadas como biofertilizantes.

Biofertilizar comúnmente se refiere al uso de microorganismos del suelo para
incrementar la disponibilidad y el consumo de nutrientes minerales para las plantas.
Algunas bacterias PGPR actúan directamente ayudando a proveer de nutrientes a la
planta huésped o indirectamente influenciando positivamente al crecimiento y
morfología radicular o ayudando a otras relaciones simbióticas beneficiosas. No todas
las PGPR son biofertilizadoras, pero muchas estimulan el crecimiento ayudando al
control de organismos patógenos. (VESSEY, 2003)

Existen una variedad de géneros de bacterias con la capacidad de solubilizar fosfato:

Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium,
Micrococcus,Aerobacter, Flavobacterium, Mesorhizobium, Azotobacter, Azospirillumy,
Erwinia, Enterobacter, Escherichia, Mycobacterium, Serratia (SPERBER, 1958;
GOLDSTEIN, 1986; NAHAS 1996; RODRÍGUEZ y FRAGA, 1999; KUMAR et al.,
2001). Estos microorganismos crecen en medios con fosfato tricálcico, apatita u otros
materiales insolubles similares como única fuente de fosfato y no sólo asimilan el
elemento, sino que solubilizan una gran proporción del mismo, liberándolo en
cantidades superiores a sus demandas nutricionales. El principal mecanismo
microbiológico por el cual los compuestos fosfatados son movilizados es la disminución
del pH del medio por la liberación de ácidos orgánicos (ALEXANDER, 1980). Se han
descrito otros posibles mecanismos, tales como la eliminación de protones afuera de la
célula y su intercambio con cationes unidos al fósforo o la producción de ácidos
 14

inorgánicos como el ácido sulfhídrico, el ácido nítrico o el ácido carbónico

(RODRÍGUEZ y FRAGA, 1999).

Si bien muchos géneros bacterianos presentan esta capacidad para solubilizar fósforo
inorgánico, es de particular interés detectar esta habilidad en grupos que tengan otras
propiedades de promoción de crecimiento vegetal, como por ejemplo, capacidad para
fijar nitrógeno atmosférico. Se han aislado microrganismos como Azospirillum lipoferum
o Azotobacter chroococcum que además de ser fijadores libres de nitrógeno, son
capaces de promover el crecimiento vegetal mediante la solubilización de fosfatos
inorgánicos (MURTY y LADHA, 1988; KUNDU y GAUR, 1980). Además, distintas
especies de bacterias del suelo de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium, fijan
nitrógeno en asociación simbiótica con distintas fabáceas, y poseen además la
capacidad de solubilización de fósforo inorgánico (HALDER y CHAKRABARTTY, 1993;
SURANGE y KUMAR, 1993).

Otros microorganismos fosfato solubilizadores ayudan a la planta en diferentes formas

para tener un buen desarrollo, utilizando mecanismos indirectos como la eliminación o
disminución del ataque de fitopatógenos, ya sea por competencia de nutrientes,
producción de antibióticos, hidrolisis de moléculas perjudiciales o también por
producción de sideróforos. Por otra parte, los mecanismos directos incluyen la fijación
de nitrógeno y la solubilización de fósforo que facilita a las plantas en su obtención de
nitrógeno y fósforo; además, algunas de estas bacterias producen factores de
crecimiento vegetal como auxinas, giberelinas y citoquininas. (RODRÍGUEZ y FRAGA,
1999).

2.3.3 Ácidos orgánicos como medio para la solubilización de P. En general, se

acepta que el mecanismo más común de solubilización del fosfato mineral es la acción
de ácidos orgánicos sintetizados por las bacterias solubilizadoras de fósforo (BSP)
además de la producción de un grupo de enzimas denominadas fosfatasas
(GOLDSTEIN, 1995; WAN y WONG, 2004). La concentración de los ácidos orgánicos
en la solución del suelo normalmente es baja, variando de 1 a 50 µM
(BAZIRAMAKENGA et al., 1995; STROBEL, 2001), pero las BSP podrían aumentar
estos contenidos a nivel de la rizósfera favoreciendo la solubilización del fósforo
 15

adsorbido. Los ácidos glucónico y 2-cetoglucónico son los compuestos reportados

frecuentemente como solubilizadores de fosfato que producen las BSP. Además otros
ácidos orgánicos con capacidad solubilizadora de fosfatos son los ácidos oxálico,
cítrico, butírico, malónico, láctico, succínico, málico, acético, fumárico, adípico, e
indolacético. La capacidad de los ácidos orgánicos para aumentar la disponibilidad de
P, no sólo se debe a la acidificación en la rizósfera de la planta, sino también a su
capacidad de formar complejos estables con el Ca2+, Mg2+, Fe3+ y
3+
Al .(STEVENSON,1967; MOGHIMI y TATE, 1978; ILLMER et al., 1995). Por otra
parte, tempranamente Struthers y Sieling (1959) observaron que la efectividad de los
ácidos orgánicos para prevenir la precipitación de fosfatos por el hierro y el aluminio se
incrementa progresivamente con el número de grupos hidroxilo, debido a la formación
de complejos más estables con el Fe y Al.

2.4 Aislamiento y selección en el desarrollo de un biofertilizante para su

inoculación en cultivos agrícolas.

Diversos investigadores en estos últimos 30 años han aislado exitosamente cepas de

BSP desde cereales con el objetivo de establecer sus cualidades como
microorganismos con beneficios para los cultivos agrícolas (GAVINI et al., 1989;
KLEEBERGER et al., 1983; SINGH et al., 1983; RUPPEL et al., 2001). Para esto
numerosos medios selectivos han sido utilizados para la aislación de estos
microorganismos desde el suelo y la rizósfera. En el caso específico de bacterias con
potencial de biofertilizante se han utilizado medios con fuentes insolubles de P para
aislar bacterias solubilizadoras de P o medios deficientes en N para aislar bacterias
fijadoras de N. (BUYER, J. 1995). En la selección de estas bacterias debe
considerarse que la asociación no simbióticas planta-bacteria varia considerablemente
dependiendo de la bacteria misma, la especie o cultivar de planta, el tipo de suelo y las
condiciones ambientales.

En el desarrollo de un biofertilizante, el primer objetivo que considera la inoculación con

bacterias beneficiosas es entregar la mejor bacteria disponible (BASHAN y HOLGUIN,
1997; BASHAN et al. 1993; GLICK, 1995; KLOEPPER et al. 1989) y que logre un
efecto sobre el crecimiento de las plantas. Posteriormente, se comienza un estudio de
 16

la formulación específica del inoculante, el cual determina el éxito potencial del

inoculante en un cultivo (FAGES, 1992).

Debe mencionarse, que los efectos de la inoculación con un biofertilizante en el campo

son positivos, cuando en los suelos existen niveles intermedios de fertilización de N, P
y K, lo cual indica que la inoculación con bacterias promotoras de crecimiento vegetal
no remplazan la fertilización artificial; pero, su uso mejora la utilización de los
fertilizantes, alcanzando los mismos niveles de productividad con un menor gasto de
fertilizantes (OKON y KAPULNIK 1986).

En general, después que las bacterias sean introducidas al suelo, la población

bacteriana disminuye progresivamente (BASHAN y LEVANONY, 1988; VAN ELSAS et
al. 1986). Este fenómeno junto con la producción de biomasa bacteriana y el estado
fisiológico de la bacteria en el inoculante puede prevenir la acumulación de una
población de PGPR suficientemente grande en la rizósfera como para obtener la
respuesta de la planta que se desea. El obstáculo clave es que el suelo es un ambiente
heterogéneo e impredecible, incluso a pequeña escala (VAN ELSAS y
VANOVERBEEK, 1993).
 17

3 MATERIALES Y METODOS

3.1 Prueba de patogenicidad de cepas bacterianas.

Las cepas bacterianas 8b, 1A, B3, 11A, 1 y una cepa Serratia spp. T3 que muestran
actividad solubilizadoras de fósforo fueron sometidas a una prueba de patogenicidad,
para determinar si generan daños en tejidos vegetales. Las seis cepas mencionadas
fueron aisladas desde la rizósfera de plantas de trigo cv. Otto colectadas en diciembre
de 2010 en la localidad de Máfil (OSMAN, 2010).

Las distintas cepas aisladas fueron inoculadas en papas cortadas longitudinalmente a

las cuales se les extrajo una sección de 5 mm con un sacabocados dejando un orificio
circular en el centro del tubérculo. La inoculación consistió en tomar una colonia con
un aza de inoculación previamente esterilizada y esparcida sobre el orificio realizado.
Las colonias bacterianas habían sido crecidas previamente a partir de cultivos puros en
medio agar soya tripticasa (TSA). Las mitades de tubérculos fueron colocados en
Placas de Petri e incubados a temperatura ambiente por 3 días. Al final de ese periodo
se evaluó la presencia de tejidos necrosados alrededor del área inoculada. Cada cepa
fue inoculada en dos mitades de tubérculo y un control inoculado con agua estéril
repetido dos veces fue utilizado.

3.2 Evaluación de capacidad de solubilización de fósforo por bacterias cepa

Pseudomonas fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3 en sustrato arena de
cuarzo.

Las cepas P. fluorecens C139 (NIKLITSCHEK, 2008) y la cepa Serratia spp. T3

(OSMAN, 2011) fueron obtenidas desde el Laboratorio de Bacteriología y Bioinsumos
de la Universidad Austral de Chile, para determinar su capacidad de solubilización de
roca fosfórica en un sustrato arena de cuarzo. Para ello, concentraciones de 10 ppm,
20ppm y 40 ppm de fósforo (P) fueron agregados como roca fosfórica Bifox (17-19% de
P2O5 [fosfato], Compañía Minera de Fosfatos Naturales, Bahía Inglesa, V Región,
Chile) en recipientes con 20 g de cuarzo. Se consideraron dos repeticiones, cada
 18

recipiente fue inoculado separadamente con 7 ml de una solución bacterial del aislado
C139 (1,45x108 ml-1), y otro tratamiento inoculado con aislado T3 (7x108ml-1), y un
control basado en una solución de células bacterianas muertas del aislado C139
sometida a esterilización con autoclave (1 atm, 15 min a 120ºC ).

Previo a la inoculación, los aislados evaluados fueron incubados en medio caldo soya
tripticasa (CST) por 24 h a 30°C. Después del período de incubación se realizó un
recuento de unidades formadores de colonias (UFC) en medio Play Count (Sigma-
Aldrich) para determinar la concentración de bacterias.

Los recipientes fueron incubados en una sala de crecimiento a temperatura ambiente y

un fotoperiodo de 16 horas de luz / 8 horas noche. Después del periodo de incubación
se realizaron análisis de fósforo soluble en el Laboratorio de Suelos de la Universidad
Austral de Chile basado en la metodología para determina P-Olsen en los suelos.

3.3 Proceso de encapsulación de cepas P. fluorecens C139 y cepa Serratia

spp. T3.

Para la inoculación de las bacterias solubilizadoras de P se considero utilizar

biocápsulas por lo cual se establecieron distintos procesos para su desarrollo.

3.3.1 Pruebas con distintas matrices de gelificación. Se realizaron mezclas con

distintas proporciones de almidón, alginato, carragenina y suero de leche para
encontrar una mezcla apropiada que genere buenas condiciones de gelificación para la
encapsulación o formulación de las cepas bacterianas. Los siguientes productos
fueron utilizados para ser evaluados en las matrices de encapsulación:

Alginato: Producto Gelygum 7228, extractos naturales Gelimar, Planta Puerto Montt-
Calbuco.

Carragenano: Dos productos fueron obtenidos de la empresa Gelimar, (Carragenano

305 y 345) los cuales corresponden a polisacáridos de origen natural, obtenido desde
algas como Gigartinas kottsbergii (Luga roja) presente en el sur de Chile.
 19

Almidón de papa: Producto obtenido de la empresa Prinal Ltda. El almidón funciona

como protector y como nutriente para las bacterias encapsuladas.

Suero de leche: Producto obtenido de la Cooperativa Lechera La Unión (COLUN), y

que corresponde a un subproducto de la elaboración de queso, que se obtiene de la
coagulación de la leche mediante la adición de cuajo y que es rico en lactosa
(disacárido compuesto de una molécula de glucosa y otra de galactosa)

Estas sustancias en una formulación sirven a las bacterias para protección ante
condiciones del ambiente o como sustrato nutritivo para su crecimiento en el suelo.
Estos productos fueron evaluados en dos grupos de mezclas en diferentes
concentraciones, la primera de carragenano mezclado con Cloruro de Calcio (CaCl2),
para determinar bajo que concentración de CaCl2, el carragenano generaba una
adecuada gelificación (Cuadro 3); y una segunda prueba de matrices de almidón
mezclado con alginato, el objetivo fue establecer que concentraciones de estos
productos gelificaba adecuadamente en CaCl2 al 1,5% (Cuadro 4). Todas las mezclas
fueron realizadas manualmente disolviendo los productos en un volumen menor de
agua hasta formar una pasta; cuando el producto estaba disuelto se agregó agua hasta
llegar a 1L y se homogenizó la mezcla. Las mezclas que lograron gelificar de forma
adecuada fueron determinadas visualmente, en virtud de su resistencia, forma y
tamaño.
 20

CUADRO 3. Mezclas de concentraciones de carragenano y Cloruro de calcio

evaluadas para determinar una adecuada gelificación con el
objetivo de ser utilizado en una matriz de encapsulación.
Concentraciones de Concentraciones de Cloruro de calcio (CaCl2)
carragenano 305 y 345 8% CaCl2 6 % CaCl2 3% CaCl2 2% CaCl2 1,5%
CaCl2
1% Carragenano 305 X1 X No No No
Evaluado Evaluado Evaluado
1% Carragenano 345 X X No No No
Evaluado Evaluado Evaluado
2% Carragenano 305 X X X X X
2% Carragenano 345 X No No No X
Evaluado Evaluado Evaluado
3% Carragenano 305 X X X No X
Evaluado
3% Carragenano 345 X No No No X
Evaluado Evaluado Evaluado
1
La letra “X” representa formulaciones que se evaluaron.

CUADRO 4. Mezcla de concentraciones de almidón y alginato evaluadas para

determinar una adecuada gelificación en CaCl2 al 1,5% con el
objetivo de ser utilizado en una matriz de encapsulación.
3% Alginato 2% Alginato 1,5% Alginato 1% Alginato
Almidón 50% No evaluado No evaluado X No evaluado
Almidón 48% X1 X No evaluado No evaluado
Almidón 40% No evaluado X X X
1
La letra “X” representa formulaciones que se evaluaron.
 21

3.3.2 Pruebas de contaminación de almidón y alginato. Un gramo de almidón y de

alginato fue disuelto separadamente en 9 ml de solución fisiológica y se realizó una
dilución seriada hasta -7. De de las diluciones -3 a la -7 se extrajeron alícuotas de 100
µL que fueron sembradas en placas con TSA. Se establecieron tres repeticiones de
cada una de las diluciones para almidón y tres repeticiones para alginato. Las placas
fueron incubadas a 30 °C por 24h y posteriormente se contabilizó las colonias
bacterianas realizando un recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) para
evaluarla el número de bacterias contaminantes presentes en el almidón y el alginato.

3.3.3 Preparación del cultivo bacterial para la preparación de las

bioformulaciones. A partir de un cultivo puro en placa de ambos aislados en
evaluación se extrajo con un asa de siembra una colonia característica, la cual fue
inoculada en 10 mL de Caldo Soya Tripticasa (CST) y posteriormente incubada por 24
horas a 30°C a 150 rpm en un agitador orbital marca Barnstead modelo Max 4000.
Luego, los 10 mL fueron inoculados en 90 mL de CST, siendo incubado bajos las
mismas condiciones descritas anteriormente. Finalmente, los 100 mL fueron
inoculados en 900 mL de CST e incubados como descrito anteriormente.
Previo a la encapsulación se determinó la cantidad de bacterias desarrollada en el
proceso de multiplicación de las dos cepas y estás debían alcanzar una concentración
en los cultivos bacteriales de 109 UFC mL-1, para proceder a bioencapsular.

3.3.4 Bioencapsulación. La encapsulación de las bacterias en estudios fue realizado

con un sistema de encapsulación que consta de un sistema de alimentación para
conducir la matriz de encapsulación, una bomba peristáltica, y un sistema de multi-
salida con 40 boquillas, que es por donde cae en forma de gotas la matriz de
encapsulación a un recipiente con una solución gelificante compuesta de 5 L de CaCl2
a una concentración de 15 g L-1. En el recipiente la solución reacciona con el alginato
presente en la matriz y produce la gelificación de la matriz formando las cápsulas que
contienen las BSP. El proceso de gelificación se realizó durante30 min en la solución
de CaCl2 y posteriormente se procede a extraer las cápsulas, para su secado en un
horno Marca Hanaus modelo D6450 durante 24 horas a una temperatura de 37 °C con
flujo de aire.
 22

La matriz de encapsulación se preparó a partir de los resultados obtenidos en la

sección 3.3.1. Este consistió en mezclar y homogenizar un litro de caldo de cultivo con
bacterias descrito en la sección 3.3.3 con 15 g de alginato de sodio y 400 g de almidón.
Todo este proceso se realizó utilizando materiales esterilizados para evitar
contaminación y cuidando de desinfectar con alcohol al 95% el sistema de
encapsulación entre cada bacteria.

3.4 Evaluación de propiedades de los bioencapsulados.

Una vez obtenido los bioencapsulados con las bacterias solubilizadoras de fósforo,
antes de ser utilizadas en la inoculación de plantas se procedió a evaluar sus
características para su conservación y la viabilidad.

3.4.1 Análisis de actividad del agua. Se molieron10 cápsulas secas de las dos cepas
respectivas y fueron analizadas con un medidor de actividad de agua Paw-kit de marca
Decagon, que es un instrumento que determina la actividad del agua y que fue utilizado
para saber el grado de deshidratación de las capsulas. Se consideró que los niveles
de actividad de agua que son apropiados para una buena conservación fuesen de 0,25
aw, que es una medida del agua disponible, este nivel se recomienda ya que no
permite la formación de hongos y bacterias.

3.4.2 Ensayo para establecer la concentración de bacterias solubilizadoras de P

y el grado de contaminación de las biocápsulas. Las bacterias encapsuladas fueron
evaluadas en su viabilidad para determinar la concentración de células de las bacterias
después del proceso de encapsulación y deshidratación de las biocápsulas. Para ello,
se tomaron 10 cápsulas que fueron hidratadas en solución fisiológica, y posteriormente
se disolvieron en Citrato de Sodio al 6%. Un mililitro fue inoculado en 9 mL de solución
fisiológica y luego se diluyo hasta 10-8. A partir de las diluciones -4 a -8, se tomaron
100µL, los que fueron inoculadas y esparcidas sobre placas Petri con medio Plate
Count Agar, las cuales fueron incubadas a 30°C por 48 h y posteriormente se
contabilizaron las unidades formadoras de colonias (UFC).
 23

En las mismas placas se contabilizo el número de colonias que se notaban diferentes a

las colonias bacteriales predominantes y se consideraron estas como bacterias
contaminantes.

3.5 Ensayo para establecer colonización de las dos cepas solubilizadoras de P

bioencapsuladas en raíces de trigo.

Para determinar si las bacterias colonizaban las raíces de las plantas, las cepas
bioencapsuladas en una matriz de alginato y almidón fueron inoculadas en plantas de
trigo cv. Pandora-INIA, que fueron pre-germinadas y sembradas en maceteros de 12
cm diámetro llenos con arena de cuarzo como sustrato. Se colocaron tres biocápsulas
por semilla y las plantas tuvieron un periodo de crecimiento de 30 días. Luego de este
periodo, se extrajeron las raíces de las plantas inoculadas con ambas cepas, y todas
las raíces de la planta fueron introducidas en tubos de ensayo que contenían 10 mL de
solución fisiológica estéril, y fue incubado a 30°C por 6 h y 150 rpm. Posterior a la
incubación del medio se generaron diluciones seriadas paras las muestras inoculadas
con las diferentes cepas, las diluciones -7 y -8 se sembraron en placas Petri con medio
Pikovskaya. Las placas fueron incubadas por dos días a 30°C en una incubadora y
luego se realizo RUFC. El medio cultivo Pikovskaya es un medio específico para
crecimiento de bacterias solubilizadoras de fósforo basado en una fuente insoluble de
P que es Ca3(PO4).

3.6 Ensayo para determinar el efecto de las dos bacterias solubilizadoras de

fósforo (P), cepa P. fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3 en plantas de trigo
bajo condiciones controladas.

Se establecieron dos experimentos para determinar el efecto de las bacterias

solubilizadoras de fósforo cepa P. fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3 sobre
plantas de trigo. Los materiales utilizados se describen a continuación:

3.6.1 Semillas de trigo. Se utilizarán semillas de la variedad Pandora (INIA). Una

variedad primaveral de ciclo corto obtenida en el Laboratorio de semillas de la
Universidad Austral de Chile.
 24

Las semillas fueron desinfectadas por 1 min con hipoclorito al 5% y enjuagadas tres
veces con agua destilada estéril para evitar la presencia de microorganismos. Las
semillas fueron pre-germinadas sobre papel absorbente humedecido con agua
destilada estéril y se utilizaron 4 semillas por cada maceta en el primer experimento,
mientras que 9 plantas fueron usadas en un segundo experimento.

3.6.2 Sustrato. El sustrato que se utilizó fue arena de cuarzo la cual fue escogida por
su bajo contenido de nutrientes, así las plantas solo se nutrieron a través de
soluciones nutritivas diferenciadas en sus concentración de P para cada tratamiento.
Previo a establecer las plantas, la arena de cuarzo se sometió a varios lavados con
agua para eliminar la materia orgánica presente con el objetivo de disminuir lo máximo
posible los nutrientes, para esto se sumergió el sustrato en 3M de ácido clorhídrico por
24 horas, realizando movimientos periódicos de la arena de cuarzo en contacto con el
ácido, luego se eliminó el ácido y se enjuago reiteradamente con abundante agua para
eliminar los restos de ácido en el sustrato. Finalmente se enjuago con agua destilada.
La arena de cuarzo se analizó finalmente a través de método Olsen por extracción con
solución de bicarbonato de sodio 0,5 mol/L a pH 8,5 y determinación colorimétrica del
azul de molibdeno (INIA Métodos de análisis recomendados para suelos de Chile
revisión 2006.) para determinar el nivel de P presente que alcanzó 0,3 ppm de P.
Para establecer las plantas se prepararon maceteros plásticos con un contenido de
800 g de sustrato. El lavado con ácido del sustrato permitió establecer el crecimiento
del cultivo en un sustrato inerte, sin presencia de materia orgánica, microorganismos ni
disponibilidad de nutriente lo cual permitió controlar la cantidad de fósforo de cada
tratamiento a través del uso de soluciones nutritivas que se describen más adelante.

3.6.3 Forma insoluble de P. Se utilizó Roca Fosfórica Bifox con un contenido de

fósforo de 17%- 19% en una concentración de 10 ppm de P que fue mezclado con la
arena de cuarzo para todos los tratamientos que contenían roca fosfórica.
Al agregar esta fuente de P insoluble se buscó entregar un suministro de P para que
las bacterias lo utilicen como sustrato en la solubilización y así evaluar el efecto en
cada tratamiento bajo condiciones de déficit de fósforo soluble entregado en las
soluciones nutritivas. 10 ppm de roca fosfórica se agregó en todos los tratamientos
 25

exceptuando un tratamiento “cero absoluto” que fue considerado un tratamiento

control.

Las bacterias solubilizadoras de P fueron incorporadas antes de la siembra usando las

biocápsulas descritas anteriormente. Tres biocápsulas por planta en cada maceta
fueron utilizadas (5x109 UFC por planta). Cómo se mencionó anteriormente se
utilizaron 4 semillas por maceta en el primer ensayo elaborado, mientras que 9 semillas
fueron usadas en un segundo ensayo.

3.6.4 Sistema de fertilización por soluciones nutritivas. Una vez establecidos los
maceteros con sustrato de cuarzo con 10 ppm de P como roca fosfórica y sembrados
con trigo e inoculados con las cepas bacterianas solubilizadoras de fosforo
encapsuladas, las plantas fueron crecidas por un periodo de dos meses. Después de
tres semanas de crecimiento se comenzó a regar con soluciones nutritivas con
distintos niveles de fosforo soluble.

Las soluciones nutritivas Hoagland fueron utilizadas para el riego del experimento,
estas fueron elaboradas en el Laboratorio de Fitoquímica de la Escuela de Agronomía
de la Universidad Austral de Chile. Para comprobar el efecto solubilizador de P de las
dos cepas inoculadas en el primer ensayo, se utilizarán dos formulaciones con
concentraciones diferenciales de P soluble, en la forma de H2PO4, en dosis de: 0 ppm;
3 ppm; de fósforo. En un siguiente ensayo se evaluó sólo la cepa Serratia spp. T3 la
cual se regó con soluciones nutritivas con menores concentraciones de P y
correspondieron a 0ppm, 0,25 ppm, 0,5 ppm, 1ppm y 3 ppm.

Se estableció un volumen de riego de 100 ml por semana de soluciones nutritivas y

además aplicaciones de agua destilada si era necesario para evitar la deshidratación
de las plantas.

3.6.5 Condiciones experimentales de crecimiento. El experimento se estableció en

una cámara de crecimiento vegetal en las dependencias de la Escuela de Agronomía
de la Universidad Austral de Chile. El periodo de crecimiento fue de dos meses en los
 26

cuales las plantas de trigo fueron sometidas a una temperatura entre los 15° y 25° C
con foto-período de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.

3.7 Evaluación de los tratamientos.

Con el objetivo de comprobar las diferencias que existen entre los tratamientos debido
a la mayor o menor disponibilidad de fósforo para las plantas con diferentes tipos de
cepas bacteriales y los diferentes niveles de fertilización se evaluarán los siguientes
parámetros para ambos experimentos que utilizaron plantas de trigo:

3.7.1 Determinación peso seco. Las plantas fueron secadas en hornos de secado a
una temperatura de 70° C por 48 horas y luego se pesaron de forma separada la parte
aérea y la parte radical de cada unidad experimental en una balanza analítica.

3.7.2 Altura de plantas. Fue medida la altura en centímetros s de la parte aérea de

las plantas de trigo

3.7.3 Análisis de la concentración de fósforo en los tejidos. Las muestras que

fueron secadas previamente para la determinación de peso de la parte aérea se
procesaron para la determinación de P en los tejidos vegetales.
Para establecer la concentración de fósforo en las plantas se utilizó el método de
colorimetría con nitro-vanado-molibdato (INIA, Métodos de análisis de tejidos
vegetales, Segunda Edición 2007.) en la cual las plantas secadas, molidas y luego son
calcinadas para obtener los minerales que la conforman. Las cenizas obtenidas de
cada muestra son solubilizadas con 10 ml HCl 2 M, luego para desarrollar color en
cada muestra se utiliza 4ml una solución de vanadato de amonio 0,9 g L-1; molibdato
de amonio 19 g L-1 y acido nítrico 105 mL L-1 para cada muestra posteriormente se
analizar cada una en un espectrofotómetro y así determinar las concentraciones de
fósforo que se encontraba en la biomasa aérea de las plantas de trigo para cada
tratamiento, con esta información se determinaron las diferencias de concentración
entre los tratamientos con y sin las cepas solubilizadoras de fósforo para cada nivel de
fertilización basado en P soluble.
 27

3.8 Diseño experimental y análisis estadístico.

En ambos experimentos con plantas de trigo fue utilizado un diseño completamente al

azar con dos factores los cuales corresponden a la inoculación con bacterias
solubilizadoras y los diferentes niveles de fertilización basada en P soluble. En el
primero se utilizo tres concentraciones fosforadas y la inoculación con dos cepas
Serratia spp. T3 y P. fluorecens C139. En el segundo se utilizaron 6 concentraciones
fosforadas y una cepa solubilizadora cepa Serratia spp. T3.

Los resultados obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza multifactorial

(MANDEVA) utilizando el programa estadístico SAS versión 9.2. Para determinar
diferencias significativas a un alfa de 0,05 entre los tratamientos y sus interacciones.
Comparación entre medias de tratamientos fueron determinadas a través de la prueba
de diferencias significativa menores (LSD) con un nivel de significancia de 0,05.
 28

4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS

Se utilizaron dos cepas solubilizadoras de fósforo, que habían sido aisladas a partir de
plantas de mora o murra (R. ulmifolius) cepa P. fluorescens C139 y evaluada en
plantas de trigo el año 2008 y otra cepa aislada el año 2011 desde un cultivos de trigo
cepa Serratia spp. T3, evaluada bajo condiciones in vitro. Se realizó un desarrollo
metodológico de varias etapas que permitieron la formulación y evaluación preliminar
en plantas de trigo de estas BSP. El desarrollo metodológico constó de dos etapas;
primero, se realizaron pruebas de patogenicidad, y se elaboró un procedimiento de
formulación que permitiera encapsular a las dos bacterias. Adicionalmente se
evaluaron las respuestas físicas y biológicas para el bioencapsulado, así se probaron
las condiciones y características de las distintas mezclas de matrices para encontrar la
más adecuada para el proceso de encapsulación. Principalmente se consideró en este
proceso encontrar un tamaño adecuado, resistencia después del proceso de secado y
que tuviera una forma esférica, además que no presentaran contaminación significativa
con otros microorganismos.

Una vez escogidas y formuladas las bacterias se procedió a la segunda parte de la

tesis que consistió en evaluar y comparar la solubilización de fosforo por parte de las
dos cepas escogidas, se establecieron condiciones de inoculación y distintos niveles
de fertilización fosforada aplicada en forma de soluciones nutritivas, estos distintos
niveles de fertilización fosforada se aplicaron con el objetivo de evidenciar los distintos
grados de solubilización de P.

El proceso investigativo evaluó en su primera parte la solubilización de P en el sustrato

sin la presencia de plantas para determinar cual era el rango de roca fosfórica a utilizar
y finalmente se realizaron los dos últimos experimentos inoculando plantas de trigo,
uno de ellos con un periodo de un mes de crecimiento para determinar si las bacterias
colonizaban con éxito las plantas de trigo y el segundo set de dos experimentos con un
periodo de dos meses en el cual se midió biomasa aérea, radical y los niveles de
absorción de P en las plantas de trigo para cada uno de los distintos tratamientos.
 29

4.1 Determinación de matriz de bioencapsulación.

Fue necesario encontrar una mezcla adecuada para generar la bioencapsulación de

las dos cepas, por esto se escogió entre varias combinaciones de prueba.
El carragenano se descartó después de varias pruebas, ya que no presentaba buenas
características de gelificación y se requerían concentraciones mayores de carragenano
en la matriz y un mayor porcentaje de CaCl2 en la solución de gelificación para que
ésta se produzca adecuadamente y se desarrollaran las cápsulas esféricas. A pesar
de que la mezcla de 3% de carragenano 345 y un concentración de CaCl2 del 8% tuvo
una buen gelificación, la estructura o forma de las cápsulas fue irregular y alargadas,
no alcanzando una forma esférica, que es lo ideal para una cápsula.

Además se probó utilizando suero de leche al 5 %, pero este producto se descartó ya

que solo con alginato y almidón se obtenía una buena forma y gelificación de las
cápsulas; por esto, finalmente se realizaron las matrices sólo con almidón y alginato.
Se estableció que la proporción de 40% de almidón y 1,5%, considerando una solución
de 1,5 % de CaCl2 para lograr la gelificación, fue la más adecuada.

4.2 Prueba de contaminación de almidón y alginato.

En las pruebas con las muestras de almidón y alginato, las diluciones que se
sembraron en placas con medio de cultivo AST se obtuvo crecimiento de bacterias
contaminantes. Para las diluciones de la solución de alginato se obtuvieron como
promedio d 33 UFC en la dilución 10-4, mientras las diluciones de la solución de
almidón obtuvieron un promedio de 167 UFC en la dilución 10-4, con esto se demuestra
que hay contaminación y debido a que lo necesario es que las biocápsulas solo
contengan los microorganismos solubilizadores de P ambos compuestos antes de
mezclarlos con el cultivo bacterial fueron esterilizados para elaborar la matriz de
gelificación.
Para carragenano y suero de leche no se realizaron estas pruebas ya que luego del
ensayo de matrices de encapsulación se determinó que no se utilizarías para formular
las matrices de bioencapsulación como se discutió anteriormente.
 30

4.3 Prueba de patogenicidad con cepas BSP aisladas la temporada 2011.

Como resultado en la prueba de patogenicidad se pudo observar que de las seis cepas
solubilizadoras de P aisladas y probadas en esta prueba (8b; 1B; B3; T3; 11A; 1), tres
produjeron pudrición y necrosis en los tejidos de tubérculos de papas, las cepas 8b;
1A; y B3 (Figura 1). Por lo cual fueron descartadas para su uso en posteriores ensayos
con plantas de trigo. De estas tres posibles cepas se escogió la cepa Serratia spp. T3
para el proceso de bioencapsulación e inoculación en plantas de trigo, ya que no fue
patogénica y en trabajos anteriores realizados in vitro por (OSMAN 2011), esta bacteria
presentó un marcado efecto solubilizador de fósforo.

Figura 1 Ensayo de patogenicidad de cepas bacterianas con actividad

solubilizadora de fósforo en cortes de papa.
 31

4.4 Resultados del ensayo de solubilización de roca fosfórica en sustrato de

arena de cuarzo.

CUADRO 5 Concentraciones de fósforo (P) soluble promedio obtenidas después

de una semana de incubación con bacterias solubilizadoras de P en
sustrato de arena de cuarzo.
Concentraciones de fósforo solubilizado
Tratamiento
10ppm 20ppm 40ppm
Sin cepa 1,13 (± 0,11) 1,57 (± 0,04) 1,58 (± 0,19)
Cepa Serratia spp. T3. 10,35 (± 0,56) 10,77 (± 0,04) 11,41 (± 0,43)
Cepa P. fluorecens. C139. 1,06 (±0,89) 1,64 (± 0,19) 1,78 (± 0,05)
El sustrato de arena de cuarzo presento un contenido inicial de 0,3 ppm de P el cual fue descontado a los
valores de solubilización.

Se determinó la solubilización de P después de una semana en distintas

concentraciones de P aplicado como roca fosfórica y se eligió una concentración de
roca fosfórica para aplicar en experimentos posteriores con plantas de trigo. En el
Cuadro 5 se observa que la cepa Serratia spp. T3 produjo una mayor solubilización de
fósforo, 8 ppm más que la cepa P. fluorecens C139. Para las diferentes
concentraciones de roca fosfórica (10, 20 y 40ppm) la solubilización no fue distinta para
cada cepa bacteriana. Por esta razón y considerando que se requiere para la
evaluación de las BSP en plantas de trigo un sistema deficiente en P, se escogió para
ensayos posteriores con plantas la concentración de 10ppm de P como roca fosfórica.

Estos antecedentes concuerdan con los resultados obtenidos por (OSMAN, 2011),
quien demostró que la cepa Serratia spp. T3 produjo la mayor solubilización de P
desde una fuente fosforada insoluble en comparación a otras cepas solubilizadoras
aisladas. Sin embargo, los resultados obtenidos por la cepa P. fluorescens C139
fueron menos alentadores que los observados en estudios realizados por
(NIKLITSCHEK, 2008) en el cual se compararon distintas cepas solubilizadoras de P, y
en donde la mayoría de las cepas que obtuvieron un mayor índice de solubilización de
P incubadas en agar Pikovkaya a los 7 días, pertenecían al género Pseudomonas y
específicamente a la cepa C139.
 32

4.5 Determinación de la concentración bacterial de las cápsulas y el grado de

contaminación con otras bacterias.

CUADRO 6. Recuento Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de bacterias

solubilizadoras de fósforo y contaminantes observados en
biocápsulas de alginato y almidón incubadas en medio agar
Pikovskaya.
Cepa Promedio UFC Promedio de UFC
Dilución
bioencapsulada solubilizadoras de fósforo contaminantes
-4
Serratia spp. T3 10 218 33
-5
10 71 3
10-6 17 0

P. fluorecens C139 10-4 183 14

-5
10 46 0
10-6 5 1,5

En base a los datos observados en el Cuadro 6 se pudo estimar cuantas UFC de BSP
habían por gramo de cápsula y se pudo establecer el promedio de UFC por cápsula
que se utilizaron en experimentos posteriores.

Dado que el peso promedio de cada cápsula fue de 0,0248 g se determinó la

concentración de UFC por cápsula, así la cepa Serratia spp. T3 tuvo 6,62 x 109 UFC g-1
de cápsula, alcanzando así 1,64 x 108 UFC por cápsula, mientras que para la cepa P.
fluorecens C139 alcanzó una población de 7,52 x 109 UFC g-1 por cápsula y 1,87 x
108 UFC por cápsula. De este modo, se determinó la concentración de bacterias
aplicadas en cada planta. Dado que se utilizaron tres cápsulas por semilla la
concentración final por planta fue para la cepa Serratia spp. T3 de 4,92x109 UFC por
planta y para la cepa P. fluorecens C139 fue 5,58x109 UFC por planta.

Se realizo el proceso de encapsulación dos veces y la segunda vez se pudo disminuir

significativamente la contaminación de las capsulas, pero no se pudo lograr la
eliminación por completo de microorganismos contaminantes.
 33

4.6 Resultado del ensayo para establecer la colonización en raíces de trigo

inoculadas con las dos cepas solubilizadoras de fósforo (P) bioencapsuladas.

CUADRO 7 Recuento unidades formadoras de colonias en medio agar

Pikovskaya y concentración bacterial por mililitro observada en
raíces de trigo cv. Pandora inoculadas con dos cepas
solubilizadoras bioencapsuladas.

Cepa bacterial Dilución Promedio UFC UFC/ml

Cepa Serratia spp. T3 10-7 260,0 (±36,7)1 26 x 1010
10-8 89,5 (± 0,7) 89 x 1010
Cepa P. fluorecens C139 10-7 160,0 (±14,1) 16 x 1010
10-8 47,0 (± 1,4) 47 x 1010
1
Valores entre paréntesis corresponden a desviaciones estándar para cada tratamiento.

Después de la inoculación de plantas de trigo con aislados bacteriales

bioencapsulados y luego del desarrollo del cultivo por un mes se constató la presencia
de bacterias en las raíces de las distintas plantas inoculadas. Se pudo establecer las
concentraciones bacterianas presente en la raíces de trigo para ambas cepas como se
observa en el Cuadro 7. Este ensayo demostró que las bacterias colonizan
exitosamente las raíces de trigo.

La cepa bacterial solubilizadora de P que alcanzó una mejor colonización de la raíz fue
la cepa Serratia spp T3. El mayor crecimiento de esta cepa podría deberse a que esta
bacteria fue aislada de la rizósfera de plantas de trigo (OSMAN, 2011), por lo cual
podría mostrar mayor afinidad al ambiente rizosférico propio de este cultivo. Distintos
estudios han indicado que la presencia de plantas hospederas o genotipos influyen en
la comunidad microbiana debido a la respuesta diferencial de estos organismos a las
diferentes señales radicales y patrones de exudación, especialmente cuando las
plantas se encuentran bajo estreses ambientales (LYNCH Y WHIPPS, 1990;
RICHARDSON, 1994), como ha sido descrito con estrés causado por deficiencia de
fósforo (HINSINGER, 2001)
 34

4.7 Resultados del ensayo para determina el efecto de las dos bacterias
solubilizadoras de fósforo (P), cepa P. fluorecens C139 y cepa Serratia spp.T3 en
cultivo de trigo bajo condiciones experimentales.

CUADRO 8 Efecto de la inoculación de bacterianas solubilizadoras de fósforo (P)

cepa Pseudomonas fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3 sobre la
biomasa aérea, biomasa radical, altura de plantas y concentración de
fósforo (P) en los tejidos de plantas de trigo bajo distintos
tratamientos fosforados.
Biomasa Biomasa Altura de Concentración
Tratamientos aérea radical plantas de P en tejidos
(g) (g) (cm) (mg/g)
Sin inoculación
0 Absoluto 0,27 (±0,11)2 0,16 (±0,10) 18,03 (±1,66) 0,29 (±0,06)
1
0 ppm Sol. N + R.F 0,40(±0,10) 0,19 (±0,04) 18,53 (±2,65) 0,18 (±0,03)
3ppm Sol. N + R.F 1,21(±0,21) 0,59(±0,09) 34,20 (±6,39) 1,00 (±0,11)
P. fluorecens.
0 Absoluto 0,36(±0,08) 0,13 (±0,02) 22,23 (±3,83) 0,26 (±0,08)
0 ppm Sol. N + R.F 0,29(±0,09) 0,17(±0,03) 20,23 (±3,88) 0,46 (±0,09)
3 ppm Sol. N + R.F 1,06(±0,16) 0,51 (±0,04) 31,33 (±4,23) 1,13 (±0,14)
Serratia spp.
0 Absoluto 0,42(±0,08) 0,20 (±0,05) 20,57 (±2,23) 0,31(±0,05)
0 ppm Sol. N +R.F 0,30(±0,08) 0,31 (±0,05) 22,18 (±5,53) 0,47(±0,09)
3ppm Sol. N + R.F 1,20(±0,07) 0,72 (±0,15) 35,13 (±4,14) 1,16(±0,29)
1
Sol. N + R.F: Tratamientos que utilizaron riego con solución nutritiva (Sol. N) con concentraciones
variables de fósforo soluble más 10 ppm de roca fosfórica (R.F), que fueron mezclada en un sustrato de
arena de cuarzo.
2
Desviación estándar para cada tratamiento

NIKLITSHEK (2008) evaluó el efecto en la biomasa producido por la cepa P. fluorecens

C139, determinando una mayor producción de biomasa comparado con otras BSP
utilizadas en esa temporada. En dichos estudio, la única cepa que obtuvo un
rendimiento cercano al testigo fertilizado con súper fosfato triple fue el tratamiento con
cepa P. fluorecens C139 más roca fosfórica. En nuestros experimento se utilizó la
 35

misma cepas solubilizadora de fosforo C139 aislada y probada en plantas de trigo por
Niklitshek (2008), además de la cepa Serratia spp. T3 aislada por Osman (2011). Los
datos de biomasa aérea no presentaron diferencias significativas para los tratamientos
entre cepas solubilizadoras y el tratamiento sin cepa (p <0,05; Cuadro 8). En el
tratamiento 0 absoluto y el que no fue tratado con P soluble en la solución (0 ppm) se
evidenció una mayor biomasa radical en las plantas inoculadas con la cepa Serratia
spp. T3, pudiendo existir algún efecto hormonal que promueva el crecimiento de la
parte radical. No obstante lo anterior, estas diferencias no fueron significativas entre
los tratamientos en dichos niveles de disponibilidad de P. Finalmente en los resultados
obtenidos para altura de planta tampoco presentaron diferencias significativas.

La aplicación de P soluble fue significativo en las cuatro variables evaluadas (altura,

biomasa aérea y radical, y concentración de P en la planta). Este resultado era
esperable considerando que una concentración de 3ppm cubre los requerimientos de
las plantas de trigo, mientras que los otros dos tratamientos estaban sometidos a un
alto estrés por la falta de P.

Se ha demostrado que Pseudomonas fluorecens cepa C139 genera un mayor

crecimiento de las raíces en plantas inoculadas (NIKLITSCHEK, 2008) esto debido a la
producción de ácido indol acético (AIA) que esta bacteria libera al medio rizosférico. La
habilidad de Pseudomonas spp. para producir auxinas como el AIA puede afectar
notoriamente el crecimiento de la planta, dado que algunas de las más importantes
funciones en la planta tal como la división y desarrollo de células de la planta
(KHAKIPOUR 2008).
 36

Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos para cada nivel de fósforo contenido
en el sustrato (p<0,05;Test LSD).

FIGURA 2: Valores promedio de concentración fósforo (P) en plantas de trigo de

los distintos tratamientos de niveles fosforados (0Absoluto, 0ppm,
3ppm) y de inoculación con bacterias solubilizadoras de fósforo
cepa P. fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3.

Analizando los resultados de concentración de P en los tejidos aéreos de las plantas,

se puede observar que los tratamientos inoculados con cepas solubilizadoras de P
presentaron una mayor cantidad de P en las plantas de trigo ,en el análisis estadístico
se demostró que había un aumento significativo de la concentración de P en los
tratamientos inoculados con las cepas solubilizadoras de fósforo cepa P. fluorecens
C139 y cepa Serratia spp. T3 (Figura 2).

Se determinó un efecto significativo en el aumento de los niveles de fosforo en plantas

inoculadas pero no así una diferencia significativa en el aumento de biomasa tanto
aérea como radical, esto podría deberse a que en este experimento solo se estudió un
periodo de dos meses de crecimiento. Si eventualmente se pudiera extender el periodo
de crecimiento podrían generarse diferencias significativas en la biomasa de los
distintos tratamientos inoculados.
 37

En ensayos de solubilización in vitro establecido por (OSMAN, 2011) con otras cuatro
cepas para probar la solubilización en distintos medios de P insoluble que contenían
Ca3 (PO4)2; Al (PO4)2; Fe (PO4)2. Con respecto al medio que contiene Ca3 (PO4)2, la
cepa Serratia spp. T3 logró un crecimiento óptimo al séptimo día a diferencia del resto
de cepas (OSMAN, 2011). Además esta cepa T3 mostró la mayor solubilización de
fosfato (175,6 mg/L) al séptimo día de incubación entre las cuatro cepas
seleccionadas. En este ensayo utilizando plantas de trigo se pudo comprobar el efecto
que producía la cepa Serratia spp. T3 influenciando una mayor concentración de P en
los tejidos debido a la solubilización realizada.
 38

4.8 Resultados del ensayo para determinar el efecto de la bacteria solubilizadora

de fósforo (P) cepa Serratia spp. T3 en cultivo de trigo en condiciones
experimentales.

En un segundo experimento se evaluó el efecto de la cepa Serratia spp. T3 bajo las

mismas condiciones que el experimento anterior.

CUADRO 9 Efecto de la inoculación de bacterias solubilizadoras de fósforo (P)

cepa Serratia spp. T3 sobre la biomasa aérea, biomasa radical, altura
de planta y concentración de fósforo (P) en el tejido de plantas de
trigo crecidas bajo condiciones de déficit de fósforo soluble
disponible para las plantas.
Tratamientos Biomasa Biomasa Altura de Concentración
aérea Radical plantas de P en tejidos
(g) (g) (cm) (mg/g)

Sin inoculación
0 Absoluto 0,27 (±0,05)2 0,17 (±0,04) 15,48 (±1,71) 0,18(±0,02)
1
0 ppm Sol. N +R.F 0,37 (±0,04) 0,24 (±0,05) 16,40 (±1,57) 0,19(±0,02)
0,25 ppm Sol. N + R.F 0,52 (±0,04) 0,31 (±0,04) 21,10 (±2,25) 0,19 (±0,01)
0,5 ppm Sol. N + R.F 0,49 (±0,03) 0,31 (±0,08) 16,20 (±1,44) 0,19 (±0,01)
1 ppm Sol. N + R.F 0,47 (±0,10) 0,41 (±0,06) 19,34 (±1,06) 0,24 (±0,04)
3 ppm Sol. N + R.F 0,70 (±0,03) 0,54 (±0,18) 25,44 (±3,33) 0,25 (±0,02)
Serratia spp. cepa T3
0 Absoluto 0,27 (±0,07) 0,19 (±0,05) 15,74 (±0,92) 0,19 (±0,03)
0 ppm Sol. N +R.F 0,50 (±0,06) 0,26 (±0,07) 18,90 (±1,32) 0,23 (±0,01)
0,25 ppm Sol. N + R.F 0,57 (±0,03) 0,39 (±0,06) 21,78 (±1,14) 0,25 (±0,03)
0,5 ppm Sol. N + R.F 0,49 (±0,03) 0,49 (±0,03) 16,70 (±1,04) 0,23 (±0,02)
1 ppm Sol. N + R.F 0,52 (±0,05) 0,41 (±0,03) 19,84 (±2,16) 0,26 (±0,03)
3 ppm Sol. N + R.F 0,71 (±0,05) 0,57 (±0,07) 26,22 (±2,01) 0,32(±0,03)
1
Sol. N + R.F: Tratamientos que utilizaron riego con solución nutritiva (Sol. N) con concentraciones
variables de fósforo soluble más 10 ppm de roca fosfórica (R.F), que fueron mezclada en un sustrato de
arena de cuarzo.
2
Desviación estándar para cada tratamiento
 39

En este ensayo tampoco se observaron diferencias significativas en biomasa aérea,

biomasa radicular y altura de las plantas pero si se denota de mejor forma una
tendencia a un incremento en el peso de los tratamientos inoculados con la cepa
Serratia spp. T3 en comparación al primer ensayo con plantas de trigo.

La disminución en las concentraciones de fósforo soluble aportadas por riego en este

ensayo habría generado que la solubilización de fósforo se expresara de mejor forma
en la biomasa aérea produciendo un aumento en el peso de las plantas inoculadas
pero este aumento no alcanzó a ser significativo.

Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0,05; Test LSD).

Figura 3.Valores promedio de concentración de fósforo (P) en plantas de trigo de

los distintos tratamientos de niveles fosforados y de inoculación con bacterias
solubilizadores de fósforo cepa Serratia spp. cepaT3.
 40

En este segundo experimento en plantas de trigo con dos meses de crecimiento, la

concentración de P en los tejidos de plantas de trigo presentó una interacción
significativa entre la concentración de fósforo soluble entregado a través de la
soluciones de riego y la inoculación con la cepa Serratia spp. T3 (p<0.05), estos
resultados se observan en la Figura 3.

La mayor concentración de P en los tratamientos inoculados con la cepa T3 de Serratia

spp. en las concentraciones de 0,25 y 0,50 ppm de P soluble, permiten sugerir que
ante una deficiencia de nutrientes en el sustrato las plantas de trigo presentaron una
mayor absorción de P, que fue aportado por la solubilización de P realizada por la
bacteria cepa Serratia spp. T3.

Cabe destacar que el periodo de dos meses fue suficiente en este segundo
experimento para generar diferencias de absorciones de P, pero se requirió aumentar
al doble el número de plantas por macetero y además disminuir las concentraciones de
P solubles aportadas a través de riego. Con este aumento en la cantidad de semillas
se produjo una mayor demanda de P por parte de las plantas y con la disminución de
las concentraciones de P soluble se favoreció la generación de un sistema deficiente
en P para el experimento. Esta mayor demanda en un sistema deficiente aumentó la
absorción principalmente de los fosfatos solubilizados por las bacterias a partir de la
roca fosfórica ya que existía poco fósforo soluble aportado por el riego. Así se pudo
observar el efecto solubilizador de P de la cepa Serratia spp. T3.

Al establecer las diferencias entre el contenido de P presente en plantas de trigo

inoculadas de aquellas que no lo fueron para cada concentración de P soluble aplicado
en el riego, se logró establecer cuanto P aportó la bacteria a la planta a través de la
solubilización, observándose el mayor aporte en los tratamientos de P soluble
deficitario aportado por riego de 0ppm; 0,25 ppm y 0,5ppm correspondientes a un
23,6%; 34,3% y 23% respectivamente. Debido a que el aumento en la absorción de
fósforo por la planta fue más marcado en los tratamientos con roca fosfórica e
inoculadas con Serratia spp. el aumento en la concentraciones de P foliar puede ser
asociado a la solubilización que realizaron las bacterias.
 41

Los porcentajes de P absorbidos en el segundo experimento fueron menores que los

observados en el primer ensayo, esto puede ser explicado debido a que este segundo
experimento tuvo mayor número de plantas y además distintas concentraciones
deficitarias de P soluble.

Como se comprobó el efecto solubilizador de la cepa Serratia spp. T3 debido al

aumento en la absorción de P en plantas inoculadas es adecuado mencionar que en
resultados obtenidos por OSMAN 2011 determinaron que el principal acido orgánico
que estaría interviniendo en la solubilización de P por parte de la cepa Serratia spp. T3
es el ácido succínico, lo cual fue establecido a través de cromatografía de HPLC
evaluando distintos ácidos orgánicos en medio PVK con Ca3(PO)4.
 42

5 CONCLUSIONES

- El estudio demostró que ambas cepas evaluadas solubilizaron fósforo que pudo ser
absorbido por las plantas de trigo y que la solubilización de la roca fosfórica producida
por la cepa Serratia spp. T3 fue mayor en presencia o ausencia de las plantas de trigo.

- El diseño de un experimento utilizando un sustrato inerte como la arena de cuarzo

fue adecuado para evaluar en un periodo corto de tiempo a las cepas solubilizadoras
de P. Esta metodología permitió generar diferencias en la absorción de fósforo en los
tejidos, especialmente cuando se usaron concentraciones subóptimas de fósforo
soluble aplicado al riego, como se observó en el segundo experimento en el cual la
cepa Serratia spp. produjo un aumento en la absorción de P en las plantas de trigo.

- No se observaron diferencias significativas entre los tratamientos inoculados con las

bacterias solubilizadoras de fósforo para biomasa radical, biomasa foliar, y altura. Solo
la concentración de fósforo en los tejidos en las plantas de trigo presentó diferencias
significativas.
 43

6 BIBLIOGRAFIA

ALEXANDER, M. 1980. Transformaciones microbianas del fósforo. (p.: 355-371). En:

Introducción a la microbiología del suelo. AGT editor, México, 491 p.

ARCHAD, M.AND W.T. FRANKENBERGER, J. 1998. Plant growth regulating

substances in the rhizosphere: Microbial production and functions. Advan.
Agron., 62: 145-151.

BASHAN, Y., LEVANONY, H. AND ZIV-VECHT, O., 1987, The fate of field inoculated
Azospirillum brasilense in wheat rhizosphere during the growing season.
Canadian Journal of Microbiology, 35 : 691-697.

BASHAN, Y., HOLGUIN, G. LIFSHITZ, R. (1993) Isolation and characterization of plant

growth-promoting rhizobacteria. In: Glick B.R., Thompson J.E. (eds) Methods in
plant molecular biology and biotechnology. CRC, Boca Raton, Florida, pp 331–
345

BASHAN, Y., HOLGUIN, G. (1997a) Azospirillum-plant relationships: environmental

and physiological advances (1990-1996). Can J Microbiol 43: 103-121

BATTEN, G. 1992. A review of phosphorus efficiency in wheat. Plant and Soil. 146:163-
168.

BAZIRAMAKENGA, R., R. R. SIMARD, and G. D. LEROUX. 1995. Determination of

organic acids in soil extracts by ion chromatography. Soil Biol. Biochem. 27: 349-
356.

BUYER, J. A. 2005 Soil and rhizosphere microorganism isolation and enumeration

medium that inhibits Bacillus mycoides. Soil Microbial Systems Laboratory,
Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Beltsville,
Maryland. EE.UU.
 44

CAMPILLO, R.1991 Utilización de roca fosfórica Carolina del norte en fertilización de

praderas. Investigación y progreso agropecuario. Carillanca, 10: 8-12.

FAGES, J. (1992) An industrial view of Azospirillum inoculants: formulation and

application technology. Symbiosis 13: 15-26

GAVINI, F., MERGAERT, A. BEJI, C. MIELCAREK, D. IZARD, K. KERSTERS, A Y

DELEY, J. 1989. Transfer of Enterobacter agglomerans ( Beijerinck, 1888) Swing
and Fife 1972 to Pantoea aglomerans gen nov. as P. agglomerans comb. Nov.
and description of P. dispersa sp. Nov. Int, J. bacteriol. 39: 337-345.

GAUR, A. C. 1990. Phosophate solubilizing microorganisms as biofertilizer pp. 179

(New Delhi: Omega Scientific Publications)

GLICK, B. R., PATTEN, C. L., HOLGUIN, G. y PENROSE, D. M 1999. Biochemical and

genetic mechanisms used by plant growth promoting bacteria. Imperial College
press. London. 270p.

GOLDSTEIN, A. H. 1986. Bacterial solubilization of mineral phosphates: historical

perspective and future prospects. Am. J. Altern. Agric. 1: 51-57.

GOLDSTEIN, A.H., BRAVERMAN, K. and OSORIO, N. (1999) Evidence for mutualism

between a plant growing in a phosphate–limited desert environment and a mineral
phosphate solubilizing (MPS) rhizobacterium. FEMS Microbiol Ecol 30, 295–300.

HINSINGER, P. 2001. Bioavailability of soil inorganic P in the rhizosphere as affected

by root-induced chemical changes: a review. Plant and Soil 237: 173–195.

HITNER, L 1904. Uber neuere Erfahrungen und Probleme auf dem Gebiet der Boden
bakteriologie und unter basonderer Berucksichtingun der Grundungung und
Brache.(Recientes experiencias y problemas en el campo de bacteriología de
suelos con especial atención en abono verde y barbecho) Arbeiten der
 45

Deutschen Landwirtschaftlichen Gesellschaft (Trabajo de la sociedad alemana

dde agricultura).98:59-78.

HONORATO, R., GALINDO, G. Y PINOCHET, D. 1984. Aplicación de algunos

indicadores de propiedades ándicas en suelos chilenos derivados de material
volcánico. Ciencia e Investigacion Agraria 11: 179-190.

ILLMER P, SCHINNER F. 1992. Solubilization of inorganic phosphates by

microorganisms isolated from forest soils. Soil Biol. Biochem. 24:389-395.

KHAKIPOUR N, KHAVAZI K, MOJALLALI H, PAZIRA E, ASADIRAHMANI H. 2008

Production of auxin hormone by fluorescent Pseudomonads. Am. Eurasian
Agric.Sci. 4:687-692.

KUMAR V, BEHLl RK, NARULA N. 2001. Establishment of phosphate solubilizing

strains of Azotobacter chroococcum in the rhizosphere and their effect on wheat
cultivars under green house conditions. Microbiol. Res. 156: 87-93.

LYNCH, J.M., WHIPPS, J.M 1990. Substrate flow in the rhizosphere. Plant and Soil,
129 (1990), PP.1-10.

MAYZ, J. 2004 .Fijación biológica de nitrógeno. Universidad de Oriente, Núcleo de

Monagas, Laboratorio de Rizobiología, Campus Juanico, Maturín, Estado
Monagas

MUERT, M.G. & LADHA, J.K. 1988. Influence of Azospirillum inoculation on the
mineral uptake and growth of rice under hydroponic conditions. Plant Soil 108,
281-285.

NIKLITSCHEK, M. 2008. Evaluación del rendimiento del trigo (Triricum aestivum),

inoculado con bacterias solubilizadoras de fosforo y una cepa fijadora de
nitrógeno, aisladas de la rizósfera de especies arbustivas. Valdivia, Chile.
 46

OKON, Y., KAPULNIK, Y. 1986. Development and function of Azospirillum inoculated

roots. Plant and Soil 90:3-16.

PAL, K. DEY, D. BHATT, M. y CHAUHAN, S. 2000. Plant growth promoting fluorescent

Pseudomonads enhanced peanut growth, yield and nutrient uptake. Auburn
University Web Site, Available: http://www.ag.auburn.edu/pdfmanuscripts/pal.pdf

PEIX, A., RIBAS, A. MATEOS, P., RODRÍGUES, C., MARTÍNEZ, E., y VELAZQUEZ,
E. 2001. Growth promotion of chickpea and barley by a phosphate solubilizing
strain of Mesorhizobium mediterraneum under growth chamber conditions. Soil
Biol. Biochem. 33: 103-110.

PINOCHET, D. 2000. Guia Nº 2: Curso Nutrición Vegetal. Aspectos derivados de la

demanda de nutrientes. Publicación interna. Instituto de Ingeniería Agraria y
Suelos. Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Austral de Chile. Valdivia,
Chile.

RODRIGUES, H. and R. FRAGA. 1999. Phosphate solubilizing bacteria and their role in
plant growth promotion. Biotechnol. Adv. 17:319-339.

RICHARRSON, A., PANKHURST, C.E., DOULSE, B., GUPTA, V., Grace, P. 1994. Soil
microorganisms and phosphorus availability. (Eds.), Soil Biota Management in
Sustainable Farming System, CSIRO, Australia (1994), pp. 50-60

RODRÍGUEZ, J. 1993. La fertilización de los cultivos. Un método racional.

Departamento de Ciencias Vegetales, Facultad de Agronomía. Pontificia
Universidad Católica de Chile. 406 p.

RODRÍGUEZ, J. 1990. La fertilización de los cultivos un método racional. Facultad de

Agronomía, Pontificia Universidad Católica de Chile. Colección en Agricultura.
406 p.
 47

RODRÍGUEZ, H. FRAGA, R. 1999. Phosphate solubilizing bacteria and their role in

plant growth promotion. Biotechnology Advances. Vol 17, pag 319–339.

RODRÍGUEZ, J., PINOCHET, D., MATUS, F. 2001. Fertilización de los cultivos.

Santiago, Chile. Editorial LOM, 117 p.

ROJAS C. 2006. Comparison of Chilean natural phosphatic minerals R.C. Suelo Nutr.
Veg. V.6 n.2 Temuco.

STEVENSON, F. J. 1967. Organic acids in soil. pp. 119-146. In: A. D. MCLAREN and
G. H. PETERSON. (eds). Soil biochemistry. Marcel Dekker. New York, NY, USA

STRUTHERS, P. H. and D. H. SIELING. 1959. Effects of organic anions on phosphate

precipitation by iron and aluminum as influenced by pH. Soil Sci. 69: 205-213.

SADZAWKA, A., CARRASCO M., GREZ. R., MORA. M., FLORES. H., NEAMAN. A.
Métodos de Análisis Recomendados para los Suelos de Chile. Revisión 2006.

SADZAWKA, A., CARRASCO M., GREZ. R., MORA. M., FLORES. H., NEAMAN. A.
Métodos de Análisis de Tejidos Vegetales. Segunda Edición 2007.

SURANGE, S., KUMAR, N. 1993. Phosphate solubilization under varying pH by

Rhizobium from tree legumes. Indian J. Exp. Biol. 31:855-857.

TISDALE, S., WARNER, N., HAVLIN, J y BEATON, J.1993. Soil fertility and fertilizers
5°ed. New York, USA. MacMillan. 634 p.

VAN ELSAS, J.D., KIJKSTRA, AR, GOVAERT, J.M. and VAN VEEN, J.A. (1986).
Survival of Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis introduced into two
soils of different texture in field microplots. FEMS Microbiol. Ecol. 38: 151-160.

VERSSEY, J.K. 2003 Plant growth promoting rhizobacteria as fertilizers. Plant Soil, 255
(2003), pp. 571-586.
 48

VAN ELSAS, J.D. and VAN OVERBEEK, L.S. (1993). Bacterial responses to soil
stimuli. In Starvation in bacteria, S. Kjelleberg (ed.), pp. 55-79, Plenum Press,
New York.

WAN, J. H. C. and M. H. WONG. 2004. Effects of earthworm activity and P-solubilizing

bacteria on P availability in soil. J. Plant Nutr. Soil Sci. 167: 209-213.
 49

ANEXOS

ANEXO 1. Medios de cultivo utilizados

Agar Pikovskaya
10 g glucosa; 5g Ca3PO4; 0,5g (NH4)2SO4; 0,2g NaCl; 0,1g MgSO 4*7H2O; 0,2g KCl;
0,5g FeSO4*7H2O; 0,02g Azul de bromocresol (Indicador de pH); 15 g Agar, 1000ml
H2O destilada.
Esterilizar a ¾ atm durante 15 minutos.

Caldo soya tripticasa (ST)

30 g soya tripticasa; 1000 ml H2O destilada. Esterilizar a 121°C durante 15 min

Agar soya tripticasa (AST)

30 g soya tripticasa; 15 g agar bacteriológico; 1000 ml H2O destilada. Esterilizar a
121°C durante 15 min

ANEXO 2. Caracterización de alginato, polisacárido utilizado en la producción de

bioencapsulados.

Alginato
Es un polisacárido derivado de algas marrones de origen marino (Phaeophyceae), se
encuentra formando parte de la pared celular de las algas, de forma análoga a la
celulosa y pectina en la pared celular de las plantas terrestres (MANCINI y MCHUGH,
2000). El ácido algínico es un co-polímero insoluble y de bajo peso molecular de los
ácidos gulurónico (G) y manurónico (M), forman geles rápidamente en presencia de
calcio, experimentando cambios conformacionales dando lugar al modelo de gelación
conocido como “caja de huevo” debido a esto presentan buenas características para
ser empleados en encapsulación de sustancias (ROJAS y MARTIN, 2006).

Entre los polisacáridos, el alginato constituye uno de los biopolímeros más usados
debido a unas propiedades coloidales únicas y a su habilidad para formar geles fuertes
 50

o polímeros insolubles al reaccionar con cationes metálicos polivalentes como el calcio

(RHIM, 2004). Durante muchos años, ha sido utilizado en la industria alimenticia como
agente espesante, gelificante y estabilizante coloidal. También ha encontrado
aplicaciones en el entrampamiento y liberación de drogas debido a sus propiedades,
tales como: (a) un ambiente acuoso relativamente inerte dentro de la matriz, (b) un
proceso de encapsulación que ocurre a temperatura ambiente y no requiere solventes
orgánicos tóxicos, (c) un alto grado de porosidad que permite una alta velocidad de
difusión para macromoléculas, (d) la posibilidad de controlar dicha difusión con simples
procedimientos de “coating”, (e) disolución y biodegradación del sistema bajo
condiciones fisiológicas normales (GOMBOTZ y WEE, 1998).

ANEXO 3. Descripción Roca Fosfórica BIFOX

BIFOX es el nombre comercial de la fosforita natural extraída del yacimiento de

fosfatos de Bahía Inglesa y es producida por la Compañía Minera de Fosfatos
Naturales BIFOX LTDA.
BIFOX es un fertilizante fosfatado natural de aplicación directa, de alta eficiencia, sin
tratamientos químicos y que se caracteriza por entregar al suelo; FOSFORO,
MAGNESIO, POTASIO, BORO, AZUFRE Y CALCIO, desde el mismo momento de su
aplicación en forma gradual y sostenida en el tiempo.

Características Químicas.
Fósforo total 17 - 19 % (como P2O5)
Reactividad* 90 % (como P2O5)
Fósforo soluble en agua 0,037 % (como P2O5)
Calcio 30,0 % (como CaO)
Magnesio 1,2 % (como MgO)
Potasio 0,6 % (como K2O)
Azufre 3,00 % (como SO4)
Boro 0,05 % (como B)
Carbonato de Calcio 7 - 10
*La reactividad corresponde al porcentaje de fósforo soluble en ácido cítrico al 2%, con
dos extracciones, respecto al fósforo total.
 51

Los porcentajes son en base seco.

Granulometría: Se vende tanto en polvo con granulometría 95% bajo malla 100 (Tyler)
que corresponde a 150 micrones, como granulado en sacos de 50 Kg. y maxibag de
800 Kg.
Fluidez: BIFOX, permite usar implementos normales de fertilización.
Durabilidad: Duración indefinida. No se disuelve en agua, por lo cual no pierde sus
características de fertilizante.
Mezclas: BIFOX puede mezclarse parcialmente con cualquier fertilizante para formar
compuestos N P K, especialmente con aquellos de reacción ácida, por ejemplo Urea.

ANEXO 4. Prueba de viabilidad y contaminación de las biocápsulas. Recuento

Unidades Formadoras de Colonias, para establecer el grado de
presencia de otras bacterias.

RUFC- Contami- RUFC Contami- Promedi Promedio

Dilución. R1 nación. R2 nación. o. RUFC contaminación.
-4 214 24 222 18 218 33
Serratia spp.
-5 71 4 71 2 71 3
cepa T3
-6 15 0 19 0 17 0
-4 170 13 196 15 183 14
P. fluorecens -5 43 0 59 0 46 0
cepa C139 -6 5 1 2 2 5 1,5
 52

ANEXO 5. Concentraciones de P soluble después de una semana de incubación

en sustrato de arena de cuarzo inoculado con dos bacterias
solubilizadoras de fósforo.

Concentraciones de fósforo a partir de

Tratamiento Repetición roca fosfórica en el sustrato
10ppm 20ppm 40ppm
1 1,56 1,90 1,80
Sin cepa 2 1,29 1,83 1,96
Promedio 1,43 1,87 1,88
1 10,25 11,1 11,4
Serratia spp. cepa T3
2 11,05 11,03 12,02
Promedio 10,65 11,07 11,71
1 1,32 1,8 2,72
P. fluorecens cepa C139. 2 1,4 2,08 1,45
Promedio 1,36 1,94 2,09

ANEXO 6. Recuento de unidades formadoras de colonias y cálculo de

concentración bacterial por mililitro aisladas de raíces de trigo
inoculadas en medio Pikovskaya.

Cepa bacterial Dilución RUFC-R1 RUFC-R2 Promedio Bacterias/ml

-7 286 234 260 26 x 1010
Serratia spp. cepa T3
-8 90 89 90 89 x 1010
Pseudomonas -7 150 170 160 16 x 1010
fluorecens cepa C139 -8 48 46 47 47 x 1010
 53

ANEXO 7 Mediciones obtenidas del experimento realizado con plantas de trigo

inoculadas con bacterias solubilizadoras de fosforo cepa
Pseudomonas Fluorecens C139, cepa Serratia spp. T3 y sin
inoculación (S/B).

Tratamiento Rep. Biomasa aérea (g) Biomasa Radical (g) mg P/g

0Absol T3 r1 0,36 0,15 0,258

r2 0,51 0,24 0,362
r3 0,39 0,21 0,324
0ppm T3 r1 0,33 0,26 0,501
r2 0,36 0,30 0,363
r3 0,22 0,36 0,540
3ppm T3 r1 1,14 0,42 1,480
r2 1,28 0,47 1,069
r3 1,18 0,51 0,917
0Absol C139 r1 0,36 0,14 0,344
r2 0,44 0,15 0,241
r3 0,28 0,11 0,193
0ppm C139 r1 0,19 0,14 0,521
r2 0,36 0,19 0,357
r3 0,32 0,19 0,500
3ppm C139 r1 1,17 0,56 1,259
r2 0,88 0,47 1,166
r3 1,13 0,51 0,980
0Absol S/B r1 0,29 0,27 0,332
r2 0,15 0,11 0,219
r3 0,36 0,09 0,322
0ppm S/B r1 0,41 0,24 0,212
r2 0,29 0,19 0,169
r3 0,50 0,15 0,156
3ppm S/B r1 1,45 0,68 0,906
r2 1,08 0,59 0,975
r3 1,10 0,50 1,120
 54

ANEXO 8 Mediciones obtenidas de experimento realizado con plantas de trigo

inoculadas con bacterias solubilizadoras de fósforo cepa Serratia
spp.T3 y sin inoculación (S/B).
Tratamientos Rep. Biomasa Aérea(g) Biomasa radical (g) mg P/g
0 Abs S/B r1 0,28 0,13 0,181
r2 0,32 0,17 0,159
r3 0,21 0,19 0,200
r4 0,25 0,14 0,197
r5 0,31 0,23 0,159
0ppm S/B r1 0,37 0,31 0,190
r2 0,32 0,23 0,214
r3 0,43 0,22 0,158
r4 0,39 0,18 0,178
r5 0,35 0,28 0,195
0,25ppm S/B r1 0,48 0,3 0,183
r2 0,55 0,34 0,182
r3 0,54 0,26 0,190
r4 0,47 0,36 0,213
r5 0,57 0,29 0,181
0,5ppm S/B r1 0,54 0,35 0,183
r2 0,45 0,33 0,195
r3 0,49 0,26 0,181
r4 0,47 0,21 0,191
r5 0,5 0,4 0,182
1ppm S/B r1 0,57 0,5 0,226
r2 0,57 0,41 0,219
r3 0,42 0,35 0,227
r4 0,35 0,4 0,317
r5 0,44 0,38 0,218
3ppm S/B r1 0,73 0,23 0,238
r2 0,67 0,63 0,261
r3 0,71 0,56 0,244
 55

r4 0,73 0,67 0,220

r5 0,68 0,63 0,240
0 Abs T3 r1 0,19 0,19 0,205
r2 0,23 0,22 0,170
r3 0,34 0,15 0,205
r4 0,21 0,25 0,220
r5 0,36 0,13 0,148
0ppm T3 r1 0,51 0,23 0,229
r2 0,6 0,16 0,245
r3 0,45 0,33 0,235
r4 0,52 0,31 0,223
r5 0,44 0,25 0,224
0,25ppm T3 r1 0,55 0,47 0,259
r2 0,59 0,37 0,241
r3 0,53 0,31 0,302
r4 0,61 0,36 0,228
r5 0,58 0,422 0,244
0,5ppm T3 r1 0,46 0,51 0,256
r2 0,53 0,52 0,216
r3 0,48 0,45 0,211
r4 0,51 0,51 0,225
r5 0,46 0,47 0,240
1ppm T3 r1 0,52 0,41 0,263
r2 0,6 0,4 0,237
r3 0,5 0,4 0,266
r4 0,47 0,46 0,305
r5 0,49 0,38 0,229
3ppm T3 r1 0,77 0,55 0,310
r2 0,67 0,64 0,343
r3 0,72 0,53 0,328
r4 0,75 0,49 0,262
r5 0,66 0,65 0,342
 56

ANEXO 9. Análisis estadístico realizado en los distintos experimentos

conducidos en esta tesis.

Experimento 1 con plantas.

Análisis de varianza para biomasa aérea de plantas, inoculadas con cepa P.

fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3.

Fuente de Grados Suma de Cuadrados F calculado P- Valor

variación de cuadrados
medios
libertad
Modelo 8 4.110 0.514 37.75 <.0001
Tratamiento 2 0.026 0.013 0.94 0.4092
Concentración P 2 4.009 2.004 147.28 <.0001
Trt*Conc 4 0.076 0.019 1.39 0.2769
Error 18 0.245 0.014
Total 26 4.355
Coeficiente de variación 19.05

Análisis de varianza para biomasa radical de plantas, inoculadas con cepa P.

fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F P- Valor

variación libertad cuadrados
medios calculado
Modelo 8 0.731 0.091 28.36 <.0001
Tratamiento 18 0.014 0.007 2.19 0.1404
Concent. P 26 0.668 0.334 103.73 <.0001
Trt*Conc 2 0.048 0.012 3.76 0.0216
Error 2 0.058 0.003
Total 4 0.789
Coeficiente de variación: 18.75

Análisis de varianza para altura de plantas, inoculadas con cepa P. fluorecens

C139 y cepa Serratia spp. T3.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F calculado P- Valor

variación libertad cuadrados
medios
Modelo 8 4340.118 542.515 32.70 <.0001
Tratamiento 2 75.884 37.942 2.29 0.1069
Concent. P 2 4107.452 2053.726 123.80 <.0001
Trt*Conc 4 156.783 39.196 2.36 0.0582
Error 99 1642.270 16.589
Total 107 5982.389167
Coeficiente de variación: 16.40
 57

Análisis de varianza para concentración de P absorbido en plantas, inoculadas

con cepa P. fluorecens C139 y cepa Serratia spp. T3.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F calculado P- Valor

variación libertad cuadrados
medios
Modelo 8 3.779 0.472 28.87 <.0001
Tratamiento 2 0.124 0.062 3.79 0.0423
Concent. P 2 3.571 1.785 109.10 <.0001
Trt*Conc 4 0.085 0.021 1.30 0.3083
Error 18 0.295 0.016
Total 26 4.075
Coeficiente de variación: 21.88

Experimento 2 con plantas

Análisis de varianza para biomasa aérea de plantas, inoculadas con cepa Serratia
spp. T3.
 

Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F calculado P- Valor

variación libertad cuadrados
medios
Model 11 1.08 0,1 34.4 <.0001
Tratamiento 1 0.022 0.022 7.6 0.0082
Concent. P 5 1.023 0.204 71.78 <.0001
Trt*NivP 5 0.034 0,007 2.38 0.0527
Error 48 0.14 0.003
Total 59 1.22
Coeficiente de variación 10.87
 
 
Análisis de varianza para biomasa radicular de plantas, inoculadas con cepa
Serratia spp. T3.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F calculado P- Valor

variación libertad cuadrados
medios
Model 11 0.36 0,32 4.18 0.0002
Tratamiento 1 0.008 0.008 1.05 0.311
Concet. P 5 0.317 0.063 8.32 <.0001
Trt*NivP 5 0.034 0,005 0.67 0.646
Error 48 0.026 0.005
Total 59 0.72
Coeficiente de variación 20.60
 
 58

Análisis de varianza para altura de plantas, inoculadas con cepa Serratia spp. T3.

Fuente de Grados Suma de Cuadrados F calculado P- Valor

variación de cuadrados
medios
libertad
Model 11 736.39 66.94 20.90 <.0001
Trt 1 11.35 11.35 3.55 0.0658
Concent. P 5 716.67 143.33 44.76 <.0001
Trt*NivP 5 8.37 1.674 0.52 0.7579
Error 48 153.71 3.20
Total 59 890.10
Coeficiente de variación 9.21

Análisis de varianza para concentración de P en plantas, inoculadas con cepa

Serratia spp. T3.
 
 
Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F calculado P- Valor
variación libertad cuadrados
medios
Model 11 0,09 0,008 14.15 <.0001
Tratamiento 1 0.027 0.027 46.10 <.0001
Concent. P 5 0.057 0.011 19.19 <.0001
Trt*NivP 5 0.008 0,002 2.72 0.0305
Error 48 0.028 0.0006
Total 59 0.122
Coeficiente de variación 10.85