EXTRAÇÃO, SEPARAÇÃO, IDENTIFICAÇÃO E FLUORESCÊNCIA DE

PIGMENTOS CELULARES

INTRODUÇÃO
Os pigmentos vegetais são vários. Entre eles podemos citar a clorofila a, clorofila b, algumas
xantofilas, e carotenos, como os mais comuns nas plantas superiores. São insolúveis na água, mas se
dissolvem facilmente em alguns solventes orgânicos. Os pigmentos podem ser identificados pela cor;
as xantofilas são amareladas; os carotenos são alaranjados, as clorofilas a são azuladas e as clorofilas
b são verdes amareladas. Além desses pigmentos ocorrem outros que são muito mais comuns em
algas, como as ficoeritrinas, de cor avermelhadas e as ficocianinas que são arroxeadas.
Se os cloroplastos perdem parte de seu conteúdo em clorofilas, predominam os pigmentos
amarelados (como nos frutos, folhas envelhecidas, etc).
As clorofilas são pouco estáveis “ in vitro”, especialmente sob iluminação intensa. O átomo
central (magnésio) é facilmente deslocado pelo hidrogênio, dando lugar as feofitrinas correspondentes,
pigmentos de cor pardo-oliva; o cobre também pode deslocar o magnésio produzindo uma cor azulada
muito estável.
Para que a luz exerça qualquer efeito sobre a planta é condição essencial que exista uma
substância, um pigmento, capaz de absorvê-la e convertê-la numa outra forma de energia, a energia
química. Caso contrário à energia luminosa passaria despercebida através das células. Como a maior
ou menor eficiência das diversas radiações depende do fato de serem elas mais ou menos absorvidas
pelo pigmento, podemos imaginar que o espectro da ação da luz na fotossíntese deva coincidir
aproximadamente com o espectro de absorção da clorofila. No entanto esta coincidência nem sempre é
bem evidente, devido ao fato de outros pigmentos também participarem do processo fotossintético
(procure pesquisar e observar espectro de absorção e espectro de ação).

EXPERIMENTO Nº 01
EXTRAÇÃO DE PIGMENTOS DOS CLOROPLASTOS

OBJETIVO: Extrair e Identificar pigmentos dos cloroplastos

MATERIAIS
01 funil 01 régua 02 grades para tubos de ensaio
01 Graal 01 lápis 02 lâminas de barbear
02 tubos de ensaio Areia 01 abajur de fundo preto
02 béqueres de 100ml Toalhas de papel Papel de filtro (pedaços esféricos)
02 provetas de 50cm Acetona 02 tiras de papel de filtro de 3,5cm x 30cm
02 vidros capilares 02 vidros de relógio 02 bastões de vidro

PROCEDIMENTO
Tome 2 ou 3 folhas de uma planta de preferência que tenha cores variadas. Pique as folhas com
uma tesoura e junte os pedaços com um pouco de areia num grall ou almofariz. Coloque um pouco de
acetona e homogenize. Filtre o homogenado em papel de filtro colocado em um funil de vidro. Apare o
filtrado num tubo de ensaio (extrato de pigmentos).

EXPERIMENTO Nº 02
SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE PIGMENTOS
POR CROMATOGRAFIA DE PAPEL

Coloque em seguida todo o extrato obtido em uma placa de Petri.

Corte o disco de papel de filtro ao meio, coloque uma das metades na
placa contendo o extrato de pigmentos retirado do vegetal.
 Observe após algum tempo a separação de pigmentos no papel de
filtro (cromatograma = matriz sólida) que serão arrastados pela
acetona em função da afinidade desta com os pigmentos.

EXPERIMENTO Nº 03 FLUORESCÊNCIA DOS PIGMENTOS

OBJETIVO: Observar o fenômeno de fluorescência da clorofila.

PROCEDIMENTO
 Observe a coloração apresentada pelo extrato de folhas
verdes sob a ação da luz direta e refletida.

 Explique o comportamento da clorofila nestas condições.

PAPEL DOS PIGMENTOS

O verde é cor predominante do reino vegetal. Com poucas exceções as folhas são verdes,
assim como são outros órgãos vegetais, tais como caules herbáceos, caules jovens, frutos não maduros
e as sépalas das flores. O pigmento verde das plantas designa-se freqüentemente pelo termo
genérico de clorofila, embora ocorra de fato nas plantas, certo número de diferentes tipos de clorofila
a, b e c.
A clorofila é o principal pigmento envolvido na fotossíntese, porém existem outros pigmentos
acessórios como os carotenos e as xantofilas (carotenóides) que também participam da desse
processo.
A energia absorvida por estes pigmentos acessórios deve ser transferida para a clorofila a; tal
como as clorofilas b e c, estes pigmentos acessórios não podem substituir a clorofila a na
fotossíntese.
A primeira etapa da conversão da energia luminosa em energia química é a absorção da luz. Um
pigmento é qualquer substância que absorve luz visível. Alguns pigmentos absorvem todos
comprimentos de onda da luz e, portanto apresentam-se negros. Entretanto, a maior parte absorve
apenas certos comprimentos de onda, transmitindo ou refletindo os comprimentos de onda não
absorvidos. A clorofila, o pigmento que confere a cor verde às folhas absorve principalmente a luz nos
comprimentos de onda violeta e azul bem como o vermelho; devido ao fato de ela refletir a luz
verde, a clorofila se apresenta verde.
Quando os pigmentos absorvem a luz, os elétrons são temporariamente impulsionados ao
nível de energia mais alto. Quando os elétrons retornam para o nível mais baixo de energia, podem
ocorrem três resultados:
1. A energia pode ser dissipada com o calor;
2. A energia pode ser reemitida quase que instantaneamente como energia luminosa de
comprimento de onda mais longo, um fenômeno conhecido como fluorescência; ou
 3. A energia pode ser capturada para formação de ligações químicas, como ocorre na
fotossíntese.
Se a clorofila é isolada, colocada em um tubo de ensaio e exposta à luz, ela irá fluorescer. Isso
porque as moléculas dos pigmentos absorvem a energia da luz, elevando, momentaneamente, os
elétrons para níveis mais altos de energia, e depois estes (elétrons) retornam outra vez para o nível de
energia mais baixo. Quando os elétrons se movimentam para o nível mais baixo de energia,
eles liberam a maior parte desta energia como luz.
Atenção, a energia absorvida pelas moléculas de clorofila isoladas não pode ser convertida
em qualquer forma de energia útil para os sistemas vivos. A clorofila pode converter energia
luminosa em energia química apenas quando as moléculas de clorofila estão associadas a certas
proteínas e embebidas nas membranas especializadas dos tilacóides.
Todas as clorofilas exibem fluorescência.
A clorofila, quando em solução em etanol, exibe fluorescência vermelho sangüíneo
escuro, que se vê melhor ao observar a solução em luz refletida. Idêntica solução de clorofila b exibe
fluorescência vermelho-acastanhada.

CROMATOGRAFIA

As técnicas cromatografia são usadas para separar compostos baseando-se em suas relativas
afinidades a serem absorvidos por uma matriz sólida. São úteis na separação de proteínas, aminoácidos
ou nucleotídeos. Pode ser utilizada para separar pigmentos vegetais.
Há diferentes métodos cromatográficos, distinguidos pela natureza da matriz sólida. Na
cromatografia em papel, a matriz é uma tira de papel de filtro. Uma amostra dos compostos a serem
analisados é colocada numa das extremidades da tira de papel que é, então, eluída (separada),
embebendo-se uma solução aquosa ou orgânica (o solvente). À medida que o solvente encharca a tira,
carrega consigo os compostos em quantidades relativas ao serem adsorvidos pela matriz.
Cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido),
sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Nesse caso, a fase móvel desloca-se através da
fase estacionária por ação da capilaridade (nos poros de um papel) ou sob a influência da gravidade. Útil
em separação de compostos polares. Devido à sua facilidade experimental e ao seu baixo custo,
encontra-se bastante difundida. Um bom exemplo:a separação da tinta verde. Com o processo de
cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.

QUESTIONÁRIO

1. Quais pigmentos foram identificados pelo cromatograma e qual a seqüência dos mesmos?

2. Por que as clorofilas são verdes?

3. Descreva o fenômeno da fluorescência das moléculas de clorofilas.

4. Pesquise mais sobre fluorescência de outras substâncias.

 LEIA COM ATENÇÃO A INFORMAÇÃO ABAIXO...

A vida na terra depende no final das contas da energia derivada do sol. A fotossíntese é o único
processo de importância biológica que pode colher esta energia. Além disso, uma grande fração dos
recursos de energia do planeta é resultado de atividades fotossintéticas recentes (biomassa) ou antigas
(combustível fóssil). O termo “fotossíntese” significa “síntese que usa luz” literalmente. Organismos
fotossintéticos usam energia solar para sintetizar combinações orgânicas que não podem ser formadas
sem a contribuição de energia. Energia armazenada nestas moléculas pode ser usada depois como fonte
de energia a processos celulares na planta e pode servir como recurso de energia para todas as formas
de vida. Aqui, será tratado o papel da luz na fotossíntese, a estrutura do aparato fotossintético, e os
processos que começam com a excitação da clorofila através da luz e culminam na síntese de ATP e
NADPH.

Fotossíntese em plantas superiores

O tecido fotossintético mais ativo em plantas superiores é o mesófilo das folhas. Células do
Mesofilo têm muitos cloroplastos que contém os pigmentos verdes especializados na absorção de luz, as
clorofilas. Na fotossíntese, a planta usa a energia solar para oxidar a água, enquanto liberam oxigênio, e
reduzem o gás carbônico em combinações orgânicas, principalmente açúcares. A série complexa de
reações que culminam na redução do CO2 incluem as reações de tilacóide e as reações de fixação de
carbono. As reações de tilacóide da fotossíntese ocorrem em uma membrana interna especializada do
cloroplasto chamada tilacóide (figura 1). Os produtos finais destas reações no são a alta-energia que
compõem o ATP e o NADPH que são usados para a síntese de açúcares nas reações de fixação de
carbono. Estes processos acontecem no estroma dos cloroplastos, a região aquosa que cerca o tilacóides.

No cloroplasto, energia luminosa é colhida através de duas unidades funcionais diferentes

chamados fotossistemas. A energia luminosa absorvida é usada para permitir a transferência de elétrons
por uma série de compostos que agem como doadores de elétron e receptores de elétron. A maioria de
elétrons no final das contas reduz NADP+ em NADPH. A energia luminosa também é usada para gerar
uma força motiva de próton através da membrana do tilacóide que é usada para sintetizar ATP.

A luz
Luz tem características tanto de uma partícula quanto de uma onda. Um triunfo de físicos no
princípio do século foi à descoberta de que a luz tem propriedades de partículas e de ondas. Uma onda é
caracterizada por um comprimento de onda, denotado lambda (l) que é a distância entre cristas de onda
sucessivas. A freqüência representada pela letra grega nu (n), é o número de cristas de onda nas que
passam por um observador num determinado tempo. Uma equação simples (equação 1) relaciona o
comprimento de onda, a freqüência, e a velocidade de qualquer onda:
 (equação 1) c = ln

Onde c é a velocidade da onda — no presente caso, a velocidade da luz (3.0 x 108 m s-1). A onda de luz
é uma onda eletromagnética transversal (lado-a-lado) na qual campos elétricos e magnéticos oscilam
perpendicularmente à direção de propagação da onda e a 90° com relação um ao outro.
Luz também é uma partícula, que nós chamamos fóton. Cada fóton contém uma quantia de
energia que é chamada quantum (quanta plural). O conteúdo de energia de luz não é contínuo, mas
preferencialmente é entregue nestes discretos pacotes, o quanta. A energia (E) (equação 2) de um fóton
depende da freqüência da luz de acordo com uma relação conhecida como a lei de Planck:
(equação 2) E = hn
Onde h é a constante de Planck (6,626 x 10-34 J s). Luz solar é como uma chuva de fótons de
freqüências diferentes. Nossos olhos são sensíveis a só uma gama pequena de frequência — a região de
luz visível do espectro eletromagnético (figura2).

Quando Moléculas Absorvem ou Emitem luz, Elas Mudam o Estado Eletrônico.

A clorofila se parece verde a nossos olhos porque absorve luz nas partes vermelhas e azuis do
espectro, então somente comprimentos de onda verdes da luz (aproximadamente 550 nm) são refletidos
para nossos olhos ( Figura 2). A absorção de luz é representada através de Equação 3 na qual clorofila
(Chl) em seu estado de baixa-energia, ou basal, absorve um fóton (representado através de hv) e faz
uma transição para um estado de alta-energia, ou excitado, (Chl *):

(Equação 3) Chl+hv--- >Chl *

A distribuição de elétrons na molécula excitada é um pouco diferente da distribuição na molécula

básica. A figura 2 descreve a absorção e emissão de luz através de moléculas de clorofila. Absorção de
luz azul excita a clorofila a um estado de energia mais alto que absorção de luz vermelha, porque a
energia dos fótons é mais alta quando o comprimento de onda deles for mais curto. No estado de
excitação mais alto, a clorofila é extremamente instável, muito rapidamente perde alguma de sua energia
para o ambiente como calor, e entra no estado mais baixo de excitação onde pode ser estável por vários
nanosegundos (10-9 s). Por causa desta instabilidade inerente do estado excitado, qualquer processo
que captura sua energia deve ser extremamente rápido.
No mais baixo estado de excitação, a clorofila excitada tem vários possíveis caminhos para dispor
de sua energia disponível (figura 4). Pode re-emitir um fóton e assim pode voltar a seu estado básico,
processo conhecido como fluorescência. Quando faz assim, o comprimento de onda de fluorescência
quase sempre é ligeiramente mais longo que o comprimento de onda de absorção do mesmo elétron,
porque uma porção da energia de excitação é convertida em calor antes de o fóton fluorescente fosse
emitido. Conservação de energia requer então que a energia de fóton-fluorescência seja mais baixa que
de fóton-excitação conseqüentemente à troca para comprimento de onda mais longo. Clorofilas florescem
na região vermelha do espectro.
Alternativamente, a clorofila excitada pode voltar a seu estado basal convertendo sua energia de
excitação diretamente em calor, sem emissão de um fóton. Um terceiro processo que desativa a clorofila
excitada é transferência de energia, na qual uma clorofila excitada transfere sua energia a outra
molécula. Um quarto processo é fotoquímico no qual a energia do estado excitado causa a ocorrência de
reações químicas. A taxa dos primeiros passos do processo de armazenamento de energia fotossintética
está entre as reações mais rápidas de substâncias químicas conhecidas. Esta velocidade extrema é
necessária para a fotoquímica competir com as outras possíveis reações do estado excitado.
O rendimento de quantum dá Informações sobre o destino do estado excitado
O processo com a taxa mais alta será o mais provável para desativar a clorofila excitada;
processos mais lentos ganham somente ocasionalmente a corrida para dispor da energia do estado
excitado. Este conceito é expresso quantitativamente por via do rendimento de quantum (Clayton 1971,
1980). O rendimento de quantum (Ø) de um processo no qual moléculas deixam a energia de excitação
delas (ou “declinam“) é a fração de moléculas excitadas que se declinam por aquele caminho.
Matematicamente, o rendimento de quantum de um processo, como fotoquímico, está definido como
segue (equação 4):
(equação 4) Ø = rendimento de produtos de fotoquímicos / número total de quanta absorvido
O rendimento de quantum dos outros processos é analogicamente definido. O valor de Ø para um
processo particular varia de 0 (se aquele processo nunca é envolvido na decadência do estado excitado)
para 1,0 (se aquele processo sempre desativa o estado excitado). A soma do rendimento do quantum de
todos possíveis processos é 1.0.
Em cloroplastos funcionais mantidos sob luz fraca, o rendimento de quantum de fotoquímica é
aproximadamente 0.95, o rendimento de quantum de fluorescência é 0.05 ou abaixo, e o rendimento de
quantum de outros processos é desprezível. A vasta maioria das moléculas de clorofila excitadas conduz
então o processo fotoquímico.
O rendimento de quantum de formação dos produtos de fotossíntese, como 02, pode ser medido
com bastante precisão. Neste caso o rendimento de quantum está substancialmente abaixo do valor para
fotoquímica, porque vários eventos de fotoquímica têm que acontecer antes de qualquer formação de
moléculas de 02. Para produção de 02 o rendimento de quantum máximo medido é aproximadamente
0,1, significando que 10 quanta são absorvidos para cada molécula de 02 liberada. O recíproco do
rendimento de quantum é chamado “exigência de quantum”. A exigência de quantum mínima para
evolução 02 é então aproximadamente 10. Medidas quantitativas da absorção de luz e o destino da
energia contidas na luz são essenciais para a compreensão da fotossíntese.

Pigmentos fotossintéticos absorvem a luz que dá energia à fotossíntese

A energia de luz solar é primeiramente absorvida pelos pigmentos da planta. Todos os pigmentos
ativos em fotossíntese são encontrados no cloroplasto. Estruturas e espectros de absorção de vários
pigmentos fotossintéticos são mostrados nas Figuras 5 respectivamente. As clorofilas e bacterioclorofilas
(pigmentos achados em certas bactérias) são os pigmentos típicos de organismos fotossintéticos, mas
todos os organismos contêm uma mistura de mais de um tipo de pigmentos, cada qual com uma função
específica. Todas as clorofilas têm uma estrutura de anel complexa a qual é relacionado quimicamente o
grupo de Fe encontrado em hemoglobinas e citocromos (Figura 6). Além disso, um longo rabo de
hidrocarboneto quase sempre é preso à estrutura de anel. O rabo ancora a clorofila à porção hidrofóbica
de seu ambiente. A estrutura de anel contém alguns elétrons fracamente ligados e é a parte da molécula
envolvida em transições de elétron e reações de redução.

Organização de Sistemas de Antena Receptora de Luz

Os sistemas de antena de diferentes classes de organismos fotossintéticos são notavelmente
variados, em contraste com os centros de reação que parecem ser semelhantes em diversos organismos.
A variedade de complexos de antena reflete a adaptação evolutiva aos ambientes diversos nos quais
organismos diferentes vivem, como também a necessidade em alguns organismos para equilibrar o
fornecimento de energia ao dois fotossistemas (Grossman et al. 1995).
A função dos sistemas de antena é entregar energia eficazmente aos centros de reação aos quais
eles são associados (van Grondelle et al. 1994; Pullerits e Sundström 1996). O tamanho do sistema de
antena varia consideravelmente em organismos diferentes: Menos de 20 a 30 bacterioclorofilas por
centro de reação em algumas bactérias fotossintéticas, geralmente 200 a 300 clorofilas por centro de
reação em plantas superiores, e alguns milhares de pigmentos por centro de reação em alguns tipos de
algas e bactérias. As estruturas moleculares que servem como antenas também são bastante diversas,
embora todos eles são associados de algum modo com a membrana fotossintética.
O mecanismo pelo qual a energia de excitação da clorofila que absorve a luz é carregada ao
centro de reação é imaginado como sendo de transferência de ressonância (também conhecido como
transferência de Förster, cientista que primeiro descreveu o fenômeno). Neste processo, fótons não são
simplesmente emitidos através de uma molécula e reabsorvidos por outra; a maioria da energia de
excitação é transferida de uma molécula a outra por um processo de não radioativo. Uma analogia útil
para transferência de ressonância é a transferência de energia entre dois garfos de afinação. Se um garfo
afinando é golpeado e corretamente colocado perto de outro, o segundo garfo de afinação recebe um
pouco de energia do primeiro e começa a vibrar. A eficiência de transferência de energia entre os dois
garfos de afinação depende da distância entre eles e a orientação relativa deles, como também as
freqüências vibracionais, da mesma maneira que em transferência de energia por ressonância no
complexo de antena.
O resultado final deste processo é que aproximadamente 95 a 99% dos fótons absorvidos pelos
pigmentos de antena têm sua energia transferida ao centro de reação onde pode ser usado por
fotoquímica. É importante distinguir entre a transferência de energia entre pigmentos na antena da
transferência de elétrons que ocorre no centro de reação. Enquanto que a transferência de energia é um
fenômeno puramente físico, a transferência de elétrons envolve mudanças químicas nas moléculas.

A Antena Afunila a Energia para o Centro de Reação

A energia absorvida em pigmentos de antena (figura 7) é afunilada para o centro de reação por
uma sucessão de pigmentos com absorção máxima de que é trocada progressivamente para
comprimentos de onda vermelhos mais longos. Esta troca em meios de máxima absorção significa que a
energia do estado excitado é um pouco menor mais próximo ao centro de reação que nas porções mais
periféricas do sistema de antena. Por exemplo, quando excitação é transferida de uma molécula de
clorofila b que absorve no máximo a 650 nm para uma molécula de clorofila a que absorve no máximo a
670 nm, a diferença em energia entre estas duas clorofilas excitadas é perdida ao ambiente como calor.
Para a excitação ser transferido de volta à clorofila b, a energia perdida teria que ser reposta. A
probabilidade de transferência inversa é então simplesmente menor porque a energia térmica não é
suficiente para compor o déficit entre pigmentos de baixa-energia e de alta-energia. Este efeito dá para o
processo de coleta de energia um grau de direcionalidade ou irreversibilidade e faz a entrega de
excitação ao centro de reação mais eficientemente. Em essência, o sistema sacrifica um pouco de
energia de cada quantum de forma que quase tudo do quanta pode ser apanhado pelo centro de reação.

Regulação e Reparo do Aparato Fotossintético

Sistemas fotossintéticos enfrentam uma modificação especial. Eles são adaptados para absorver
grandes quantidades de energia luminosa e processar esta em energia química ao nível molecular, a
energia em um fóton é uma perturbação enorme que os sistemas fotossintéticos processam
elegantemente e eficazmente sob condições normais. Sob algumas condições, porém, eles podem não
poder lidar com toda a energia que recebem. A energia em excesso pode conduzir à produção de
espécies tóxicas e danos ao sistema se não for dissipada seguramente (Horton et al. 1996). Organismos
fotossintéticos contêm então um complexo jogo de mecanismos reguladores e de conserto.
Alguns destes mecanismos regulam fluxo de energia no sistema de antena, para evitar excesso
de excitação dos centros de reação e assegura que os dois fotossistemas sejam dirigidos igualmente.
Embora muito efetivos estes processos não são completamente à prova de falhas, e às vezes são
produzidas espécies tóxicas. São necessários mecanismos adicionais para dissipar estes componentes -
em particular, espécies de oxigênio tóxicas. Até mesmo com tudo este mecanismo protetor e limpador, o
aparato fotossintético às vezes ainda é danificado, e mecanismos adicionais estão presentes para reparar
o sistema.

Carotenóides Servem como Pigmentos Adicionais e Agentes Fotoprotetores

Os Carotenóides são achados em todos os organismos fotossintéticos, com exceção de mutantes
incapazes de viver fora do laboratório (o Frank e Cogdell 1996). Os diferentes tipos de carotenóides
encontrados em organismos fotossintéticos são todos moléculas lineares com múltiplas conjugações de
dupla ligação. Bandas de absorção na região de 400 a 500 nm dá aos carotenóides a cor laranja
característica deles. Por exemplo, a cor de cenouras é devido ao carotenóide b – caroteno.
Carotenóides são normalmente intimamente associados tanto com a antena quanto com as
proteínas pigmento do centro de reação e são componentes integrantes da membrana. A energia de luz
absorvida por carotenóides é rapidamente transferida para as clorofilas, assim carotenóides são
chamados pigmentos acessórios.
 Carotenóides também fazem um papel essencial de fotoproteção. A membrana fotossintética
pode ser danificada facilmente pelas grandes quantias de energia absorvidas pelos pigmentos se esta
energia não puder ser armazenada através de fotoquímica; conseqüentemente a necessidade de um
mecanismo de proteção. O mecanismo de fotoproteção pode ser imaginado como uma válvula de
segurança, afastando a energia em excesso antes que pudesse danificar o organismo. Quando a energia
armazenada em clorofilas em estado excitado é rapidamente dissipada por transferência de excitação ou
fotoquímica, é dito que o estado excitado é extinto. Se o estado excitado da clorofila não é rapidamente
extinto por transferência de excitação ou fotoquímica, pode reagir com oxigênio molecular para formar
um estado excitado de oxigênio conhecido como oxigênio simples (102 *).
As espécies extremamente reativas de oxigênio simples vão reagir e danificar muitos
componentes celulares, especialmente lipídios. Carotenóides mostram sua ação fotoprotetora extinguindo
o estado excitado da clorofila rapidamente. O estado excitado do carotenóide não tem energia suficiente
para formar oxigênio simples, assim se degrada para seu estado inicial perdendo sua energia como calor.
Organismos de mutantes em que faltam carotenóides não podem viver na presença de luz. Para
bactérias de não evoluídas, podem ser mantidos mutantes que faltam carotenóides, sob condições de
laboratório, se o oxigênio for excluído do meio de crescimento.
Recentemente foram encontrados carotenóides que desempenham um papel não fotoquímico de
extinção, que é um segundo mecanismo protetor e regulador.

Algumas xantofilas também participam na dissipação de energia

Um processo regulador principal envolvido na liberação de energia de excitação ao centro de
reação só foi descrito recentemente. O processo, conhecido como extinção não fotoquímica, parece ser
uma parte essencial da regulação dos sistemas de antena na maioria das algas e plantas.
Extinção não fotoquímica é a extinção da fluorescência da clorofila por processos diferentes da
fotoquímica. Isto foi descoberto primeiro em estudos de fluorescência de clorofila que revelou aquela
intensa iluminação produzindo um estado no qual uma fração grande das excitações no sistema de
antena era extinta através da conversão em calor (o Krause e Weiss 1991). Este processo, que parece
desperdiçador no princípio, é aceito agora como envolvido na proteção do organismo contra excesso de
excitação e subseqüente dano. O processo pode ser imaginado como uma “maçaneta” de volume que
ajusta o fluxo de excitações ao centro de reação PS-II para um nível manejável, dependendo da
intensidade luminosa e outras condições.
O mecanismo molecular de extinção não fotoquímica ainda não é entendido em detalhes.
Vários fatores parecem ser envolvidos, inclusive o pH do lúmen do tilacóide e o estado de agregação dos
complexos de antena na membrana (Horton et al. 1996). Além disso, certos carotenóides conhecidos
como xantofilas são envolvidos neste mecanismo regulador. A figura 8 mostra a estrutura de duas destas
xantofilas, violaxantina e zeaxantina, e um intermediário, anteraxantina. Estes carotenóides podem ser
interconvertidos através de enzimas epoxidase e de-epoxidase que estão presentes no cloroplasto. O
mesmo regime de alta luminosidade que induz a extinção não fotoquímica tende a ativar a enzima de-
epoxidase que converte a xantofila em zeaxantina; condições de baixa luminosidade ativam a epoxidase,
resultando na acumulação de violaxantina. Assim a zeaxantina é associada com o estado extinto e
violaxantina é encontrada quando o sistema estiver no estado não extinto. No entanto, não é claro se o
próprio carotenóide é o agente extintor, embora muitos pesquisadores assim o considerem. Esta questão
é uma área muito ativa de pesquisa (Demmig-Adams e Adams 1992; Pfündel e Bilger 1994; Horton et al.
1996).
Estrutura Química de violaxantina, anteraxantina, e zeaxantina. O estado extinto do fotossistema
II é associado com zeaxantina, o estado não extinto com violaxantina. Enzimas interconvertem estes dois
carotenóides, tendo a anteraxantina comum intermediário, em resposta ás mudanças de condições.
Formação de Zeaxantina usa ascorbato como um co-fator, e formação de violaxantina requer NADPH.

O empilhamento de tilacóides permite a divisão de energia entre os fotossistemas

O fato de que a fotossíntese em plantas superiores é dirigida através de dois sistemas
fotoquímicos com diferentes propriedades de absorção de luz coloca um problema especial. Se a taxa de
divisão de energia para os Fotossistemas I e Il não é sincronizado precisamente e as condições são tais
que a taxa de fotossíntese está limitada pela luz disponível (baixa intensidade luminosa), a taxa de fluxo
de elétron será limitada pelo fotossistema que está recebendo menos energia. A situação mais eficiente
seria aquela na qual a recepção de energia é a mesma em ambos os fotossistemas. Porém, nenhum
arranjo único de pigmentos satisfaria esta exigência, porque em diferentes períodos do dia, a intensidade
luminosa e a distribuição espectral tende a favorecer mais um ou o outro fotossistema. A solução para
este problema seria um mecanismo de troca de energia de um fotossistema com o outro em resposta às
diferentes condições, e tal qual um mecanismo regulador opere em condições experimentais diferentes. A
observação de que o rendimento global de quantum da fotossíntese é quase independente do
comprimento de onda (veja Figura 7.9) dá fortes indicações que tal mecanismo existe. Progresso
considerável tem sido conseguido no entendimento do mecanismo molecular que é responsável por esta
redistribuição de energia (Bennett 1991; Allen 1992). A membrana do tilacóide contém a proteína
quinase que pode fosforilar um resíduo de treonina específico na superfície de uma ligação membrana-
antena-pigmento protéico. Este complexo de pigmento-proteína é o LHCII descrito anteriormente (veja
Figura 7.20). Quando LHCII não é fosforilado, ele entrega mais energia ao fotossistema II, e quando é
fosforilado entrega mais energia ao fotossistema I. A quinase é ativada quando a plastoquinona, um dos
carregadores de elétrons entre os fotossistemas, acumula-se no estado reduzido, o que acontece quando
o fotossistema II está sendo ativado mais freqüentemente que fotossistema I. O LHCII fosforilado migra
então para fora das regiões empilhadas da membrana em direção às regiões não empilhadas,
provavelmente por causa de interações repulsivas entre cargas negativas de membranas adjacentes. A
migração lateral de LHCII troca o equilíbrio de energia para o fotossistema I que fica situado na lamela
do estroma e longe do fotossistema II que fica situado nas membranas empilhadas da grana. Esta
situação é chamada estado 2. Se a plastoquinona se torna mais oxidado por causa do excesso de
excitação do fotossistema I, a quinase é desativada e o nível de fosforilação de LHCII é diminuído pela
ação de uma ligação de fosfatase da membrana. O LHCII move-se então de volta para a grana, e o
sistema está no estado 1. O balanço resultante é um controle muito preciso da distribuição de energia
entre os fotossistemas, permitindo o uso mais eficiente da energia disponível.

O Centro de Reação do Fotossistema II é Facilmente Danificado

Outro efeito que parece ser um fator principal na estabilidade do aparato de fotossintético é a
fotoinibição que ocorre quando a excitação em excesso que chega ao centro de reação PS-II conduz a
sua inativação e dano (Barber e Andersson 1992; Long et al. 1994).
Fotoinibição é um complexo conjunto de processos moleculares. Está definido como a inibição de
fotossíntese através do excesso de luz. Muitos dos efeitos do excesso de luz parecem estar localizados no
fotossistema II, e locais inibidores tanto no lado doador quanto no receptor foram identificados. Como
discutido em detalhes no Capítulo 9, esta inibição é reversível nos primeiros estágios. Porém, estágios
posteriores de inibição resultam em danos para o sistema tal que o centro de reação PS-II precise ser
desmontado e consertado. O local principal deste dano é a proteína D1 que faz parte do centro de reação
PS-II. Esta proteína é facilmente danificada através de excesso de luz e então deve ser removida da
membrana e substituída por uma cópia recentemente sintetizada. As outras partes do centro de reação
PS-II são projetadas para serem recicladas, assim a proteína D1 é o único componente que precisa ser
sintetizado.

Fotossistema I é Protegido Contra Espécies Ativas de Oxigênio

O fotossistema I é vulnerável de ser danificado por espécies de oxigênio ativas. O receptor de
ferrodoxina do fotossistema I é uma espécie fortemente redutora, que pode reduzir o oxigênio molecular
facilmente para formar superóxido (02 -). Esta redução compete com a condução normal de elétrons
para a redução de dióxido de carbono e outros processos. Superoxido é um de uma série de espécies de
oxigênio ativas que são potencialmente muito danosas às membranas biológicas. Superoxido formado
deste modo pode ser eliminado pela ação de uma série de enzimas, incluindo dismutase de superoxido e
ascorbato peroxidase (Asada 1994, 1996; Polle 1996).
Genes do Cloroplasto Exibem Padrões Não-Mendelianos de Herança
Cloroplastos e mitocôndrias se reproduzem através de divisão em lugar de através da síntese de
novo. Este modo de reprodução não é surpreendente, desde que estas organelas contêm informação
genética que não está presente no núcleo. Durante divisão da célula, os cloroplastos são divididos entre
as duas células da filha. Na maioria das plantas sexuadas, porém, só a planta materna contribui com
cloroplastos ao zigoto. Nestas plantas o padrão de Mendeliano normal de herança não se aplica a genes
codificadores do cloroplasto, porque a descendência recebe cloroplastos de só um dos pais. O resultado é
herança não-Mendeliana, ou materna. Numerosas características são herdadas desta maneira; um
exemplo é a característica de resistência a herbicidas discutidas á seguir.
Alguns Herbicidas Matam as Plantas Bloqueando o Fluxo Fotossintético de Elétron
Muitos dos herbicidas (aproximadamente a metade das combinações comercialmente
importantes) agem interrompendo o fluxo de elétrons da fotossíntese(Ashton e Faz 1981). A figura 10.A
mostra a estrutura química de dois destes compostos. Foram encontrados os locais precisos de ação de
muitos destes agentes onde eles enganam a redução secundária do fotossistema I (por exemplo, em
paraquat) ou o complexo receptor de quinona na cadeia de transporte de elétron entre o dois
fotossistemas (por exemplo, no diuron) (parte B da figura).
Paraquat age interceptando elétrons entre as ligações receptoras de ferrodoxina e o NADP e
então reduz oxigênio a superoxido (02-). Superoxido é um radical livre que reage com uma grande gama
de moléculas do cloroplasto, conduzindo à rápida perda de atividade do cloroplasto. Moléculas de lipídio
da membrana da célula são especialmente sensíveis ao 02-.
Os herbicidas que agem no complexo receptor de quinona competem com a plastoquinona pelo
local de ligação QB. Se o herbicida está presente, este desloca a forma oxidada de plastoquinona e ocupa
o local específico de ligação do receptor de quinona. O herbicida não pode receber elétrons, assim o
elétron não consegue deixar QA, o primeiro receptor de quinona. Assim, a ligação de herbicida
efetivamente bloqueia o fluxo de elétron e inibe a fotossíntese. Muitos herbicidas que também agem
desta maneira inibem o fluxo de elétron em bactérias fotossintéticas que têm complexos receptores de
elétrons do tipo quinona (Trebst 1986).
Recentemente, biótipos herbicida-resistentes de ervas daninhas comuns apareceram em áreas
onde um único tipo de herbicida foi continuamente usado durante vários anos. Estes biótipos podem ter
ordens de magnitude mais resistentes a certas classes de herbicidas que plantas não resistentes o são.
Em vários casos o fator de resistência foi localizado em uma única substituição de aminoácido na proteína
D1. Esta mudança, presumivelmente na região de ligação da quinona (e herbicida) do peptídeo, a
diminuição da afinidade de ligação do herbicida, torna este muito menos efetivo.
A possibilidade de uma sintonia-fina da sensibilidade de plantas de cultura aos herbicidas,
fazendo mudanças sutis nas proteínas do centro de reação PS-II criou muito interesse na indústria
química agrícola. Por biotecnologia, é agora possível tornar uma planta de cultura resistente a um
herbicida particular, que pode ser aplicado para controlar plantas indesejáveis que não são resistentes. O
sucesso desta modificação dependerá da possibilidade de serem controlados os efeitos colaterais
indesejáveis das mutações herbicida-resistentes e em quão rapidamente as ervas daninhas adquirem
resistência por seleção natural ou transferência de gene. Assim, é uma corrida entre a ciência e as
mudanças evolutivas (Dover e Croft 1986).
 Um desenvolvimento complementar é inserir fatores de resistência a certas pestes, como insetos,
na planta por engenharia genética. As plantas produzem por si só as espécies tóxicas a estes, eliminando
a necessidade de inseticidas.
O uso de herbicida para matar plantas não desejadas é difundido na agricultura moderna. Foram
desenvolvidas muitas classes diferentes de herbicidas, e eles agem bloqueando aminoácidos,
carotenóides, biossíntese de lipídio ou rompendo divisão da célula. O entendimento do modo de ação dos
herbicidas foi uma ferramenta importante na pesquisa do metabolismo das planta e facilitou a aplicação
deles em práticas agrícolas diferentes (Ashton e Crafts 1981). (A) estrutura química de dois herbicidas
que bloqueiam o fluxo fotossintético de elétrons. DCMU também é conhecido como diuron. Paraquat
adquiriu notoriedade pública por causa de seu uso em culturas de maconha. (B) locais de ação de
herbicidas. Muitos herbicidas, como DCMU, agem bloqueando o fluxo de elétron aos receptores de
quinona do fotossistema II, competindo pelo local de ligação da plastoquinona que normalmente é
ocupado por QB. Outros herbicidas, como paraquat, agem recebendo elétrons dos primeiros receptores
do fotossistema I e reagindo então com oxigênio para formar superoxido, 02-, uma espécie que é muito
danosa a componentes dos cloroplastos, especialmente lipídios.

FASE ESCURA DA FOTOSSINTESE (Fase química)

A Fotossíntese continua seu metabolismo mesmo na ausência de luz. A fase escura ou química como é
chamada, representa a fixação do CO2, através de três tipos de fotossíntese:

PLANTAS C3
Possuem apenas o Ciclo C3 (Ciclo de Calvin) de fixação do CO2, onde a Ribulose bi fosfato carboxilase, a
Rubisco, fixa o CO2 na ribulose bi fosfato , produzindo duas moléculas de gliceraldeido 3 fosfato (3C).

PLANTAS C4
Possuem a enzima ativa de fixação a PEP carboxilase = fosfoenol piruvato carboxilase. Que possuem o
ciclo C4 de fixação, pois o primeiro composto formado é o oxaloacetato com 4 C.

PLANTAS CAM
Plantas que apresentam metabolismo ácido das crassuláceas, abrem o estômato á noite, para fixar o
CO2, e acumulam acido málico. Durante o dia, fecham os estômato e transformam o ácido málico em
amido.

Fonte: www.ciagri.usp.br