Encefalopatía

Encefalopatía Espongiforme
Espongiforme Bovina
Bovina –– Scrapie
Scrapie
Prueba
Prueba IDEXX
IDEXX antigeno
antigeno EIA
EIA

Dra.
Dra.Silvia
SilviaZimmerman,
Zimmerman,DVM,
DVM,MSc,
MSc,MBA
MBA
Latin
LatinAmerica
AmericaManager
Manager––Northern
NorthernArea
Area
IDEXX
IDEXXLaboratories,
Laboratories,Inc
Inc
 Agenda IDEXX Production
Animal Services

Segunda generación de la prueba de ELISA IDEXX con

Introducción tecnología Ligando-Seprion.

Protocolo sencillo y requerimiento mínimo de equipo. Es

Procedimiento la prueba preferida por la mayoría de los laboratorios del
mundo.

Sensibilidad de 99,9% y especificidad de 100%. Detección de

Rendimiento BSE, Scrapie clásico y atípico. Uso en bovinos, ovinos y
caprinos.

Resultado confiable, rápido e reconocido por todo el

Ventajas mundo. Capacitación y servicio técnico permanente para
cada país del mundo.

Resumen

2669-00 | 2 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 IDEXX Production
Animal Services
Prions

Nuevo agente infeccioso - Stanley Prusiner gano el premio Noble para
Enfermedades Prionicas en 1992.

Proteína asociada a membrana encontrada en la mayoría de los tejidos y
abundante en el cerebro.

Nuevo modelo de infección, sin material genético.

Puede ser distinguido por sensibilidad a proteolisis y por anticuerpos.

Acumulado en el cerebro durante la enfermedad progresivo neurodegenerativo
en TSE en animales y humanos.

Síntomas: demencia y perdida de movimiento

Patología: cambios espongiforme, placas en el cerebro

Transmisión horizontal y vertical

Vía de transmisión conocida por ingestión e implantación

Típicamente longos periodos de incubación

2669-00 | 3 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 IDEXX Production

Prion nomenclatura Animal Services

PrP Celular PrP c

PrP sensivel a Proteinase K PrPsen

Entidade
EntidadeInfecciosa
Infecciosa Prion
PrionororPrP
sc
PrPsc
PrP
PrPresitente
resitenteaaProteinase
ProteinaseKK PrP res
PrPres

2669-00 | 4 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Introducción IDEXX Production
Animal Services

El kit EIA IDEXX BSE-Scrapie está basado en una novedosa tecnología de captura
del prión, el Ligando Seprion. El test utiliza una tecnología de captura no biológica
selectiva para PrPsc desarrollada por Microsens Biotechnologies

Un polímero químico se une selectivamente al PrPSC (prión patógeno) en presencia

de PrPC (proteína normal) a partir de un simple homogeneizado de tejido

El test no requiere Proteinaza K

Esta tecnología permite combinar una etapa de homogenización simple combinada

con un EIA directo para mayor facilidad de uso y eficacia del diagnóstico

2669-00 | 5 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Tecnología IDEXX Production
Animal Services

1. Ligando Polyiónico para unir PrPsc

Pentosan sulfato, Dextran sulfato, etc.

2. “Degradadores de matriz” para maximizar
la señal
Trypsina, DNasas, colagenasas etc.
3. Surfactantes Polyaniónicos para
optimizar la selectividad para PrPsc
Triton X-100, N Lauryl Sarcosina, etc.
Ensayo de gran robustez que
selectivamente une PrPSC
(prión patógeno) en presencia
de PrPC (proteína normal) a
partir de un simple
homogeneizado de tejido

2669-00 | 6 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 No necesita Proteinasa K IDEXX Production
Animal Services

 IDEXX es una prueba de captura de antígeno especifica para

detectar la reacción de la PrPSc de conformación anormal directo
en la placa (la función de la Proteinasa K es eliminar el prion
bueno para que solamente el malo pueda ser detectado en la
placa)
 Ventaje de no necesitar preparar la muestra con Proteinasa K:
- menos equipos (menos costo)
- menos labor – menos pasos (probabilidad de error)
- menos tiempo de prueba
- mejor trazabilidad de las muestras

2669-00 | 7 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Prueba BSE-Scrapie EIA IDEXX IDEXX Production
Animal Services

Evaluación del EFSA

 Aprobado para cerebro, linfonodo y baso

 Aprobado para detección de Scrapie atípico en todos los tejidos
(brainstem, cerebelo y cerebro)
 BSE aprobado para cabras y ovejas
 Alta sensibilidad analítica
 La única prueba en la evaluación EU de 2005 con 100% de sensibilidad
y 100% especificidad sin ningún reactor inicial en cerebro de ovejas

2669-00 | 8 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Descripción de la prueba IDEXX Production
Animal Services

El
Eltest
testIDEXX
IDEXXBSE-Scrapie
BSE-Scrapiees
es
fácil de utilizar.
fácil de utilizar.
••Homogeneizar
Homogeneizarlalamuestra
muestra
••Diluir
Diluir la alícuota demuestra
la alícuota de muestra
••Realizar
RealizarelelEIA
EIA

¡Es
¡Esasí
asíde
desimple!
simple!
••Sin
Sin proteinazaKK
proteinaza
••Sin
Sincentrífugas
centrífugas
••Menor
Menortiempo
tiempodedemanejo
manejo
••Resultados
Resultadosen en90
90minutos
minutos

Media docena de
etapas han sido
eliminadas de la
preparación de la
muestra.

2669-00 | 9 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 IDEXX vs. otras pruebas IDEXX Production
Animal Services
IDEXX Test basado en PK
Collect and homogenize Collect and homogenize
sample sample Preparación de
muestra
Transfer to dilution plate Transfer to deep-well plate

Run automated PK step

Protocolo rápido SIN necesidades de
automatización
Spin plate in 4C centrifuge

Etapas con alto consumo de tiempo

y propensión al error NO son Remove supernatant, ‘dry’

necesarias en el test de IDEXX.

Add buffer, incubate @ 100C

Add diluent, transfer to capture Add buffer, transfer to capture

plate plate

Run Assay Run Assay

Ensayo
Auto or manual Auto or manual

Read Read

Tiempo aproximado: 4.25 horas 5.2 horas

2.5
2.5hours
hours
2669-00 | 10 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.
90
90minutos
minutos
 ELISA IDEXX BSE-Scrapie – Protocolo IDEXX Production
Animal Services

corto y ultra corto

 1 de Febrero de 2006 – aprobado en USA y Europa

 Prueba más rápida del mercado: 2 horas

- No necesita preparo de muestras con Proteinasa K

- Reducción de tiempo de incubación de muestra
- Reducción de tiempo de incubación del Conjugado

2669-00 | 11 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Correlación de protocolo short y ultra short IDEXX Production
Animal Services

Excelentesensibilidad

Excelente sensibilidad

100%sensibilidad

100% sensibilidadyyespecificidad
especificidad

2669-00 | 12 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Procedimiento corto y ultra corto IDEXX Production
Animal Services

2669-00 | 13 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Procedimiento corto y ultra corto IDEXX Production
Animal Services

2669-00 | 14 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Procedimiento corto y ultra corto IDEXX Production
Animal Services

2669-00 | 15 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Automatización de la prueba IDEXX Production
Animal Services

 Algunas compañías ofrecen equipo sin costo para automación del

preparo de la muestra con Proteinasa K

 IDEXX NO necesita este equipo, porque no hay preparo de muestra con

Proteinasa K

 Es posible automatizar la técnica de ELISA – recomendado para

laboratorios que hacen mas de 100.000 muestras

2669-00 | 16 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Opciones de Automatización del EIA IDEXX Production
Animal Services

9 placas en menos de 5 horas

(de transferencia del
homogeneizado hasta resultado)

Homogeneizar, preparar para

placa de captura, colocar en
robot, y dejar procesar

Aplicación muy simple

IDEXX validará la operación para

cada Tecan instalado

IDEXX proporcionará apoyo

técnico

2669-00 | 17 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

Requerimientos de Laboratorio IDEXX Production
Animal Services
Requerimientos para 920 muestras en 3 horas.

Equipamiento Personal

6 homogeneizadores FastPrep 5 técnicos para cubrir todas las etapas

®



3 lavadores de placas manualmente en 3 horas, desde la

1 lector recolección de muestras:

Típicos accesorios de ELISA
recolección de obex en 2.0 a 2.75 horas

Automatización para preparación de
Homogenización del obex en 1.0 a 1.5

muestras NO necesaria horas

Automatización Tecan EIA si se desea
Realización del EIA 90 min

2669-00 | 18 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Comparación de pruebas para BSE IDEXX Production
Animal Services

 European Ring Trial

 Goal : 99.5% specificity

 IDEXX : 99.9% specificity

Detección muestra diluida 1:800

(competidores que detectan solamente 1:200)

2669-00 | 19 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

Rendimiento: Sensibilidad y Especificidad IDEXX Production
Animal Services
Pruebas de campo Fase 2 UE

Muestra Reactores Identificac. %

(n) Iniciales correcta
Especific.
10,365 4 10,364 99.99
Sensibilid. 200 200 200 100
Muestras de
baja calidad 200 0 200 100

Puntos clave

Reactores Iniciales:

4 muestras reactores iniciales, 3 muestras reactores iniciales retestados como negativos
(mismo día, mismo técnico)

En total, IDEXX ha obtenido 3 reactores iniciales verdaderos en 17,755 muestras
(1.7/10,000)
Positivo no confirmado:

Una muestra individual testada como positiva (0.39 y 0.42 OD con cut-off 0.146)

Muestra testada como negativa con IHC
2669-00 | 20 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.
Rendimiento: Especificidad (distribución) IDEXX Production
Animal Services
Pruebas de campo Fase 1 y 2 UE

Negative Population from EU field trials Puntos clave

5000
99.99% especificidad

4500 mean = 0.325 + 0.082
4000 n=10715
Población negativa con distribución
3500 8.2 sd's from cutoff agrupada y buena separación del cut-off
Frequency

3000
2500
Cut-off
Las muestras incluyen 150 muestras
2000
1500 normales de la Fase 1; y 10.365 muestras
1000 normales y 200 muestras negativas de difícil
500 detección de la Fase 2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Total de muestras procesadas = 17.755
OD relative to cutoff Muestras de Alemania, Francia, Reino
Unido, Estados Unidos

2669-00 | 21 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

Rendimiento: Sensibilidad analítica IDEXX Production
Animal Services
Evaluación de laboratorio Fase 1 UE

IDEXX BSE-EIA curva de dilución Puntos clave

25

Se realizó una dilución seriada de una
muestra positiva a BSE en
r eading relativ e to cut off

20 homogeneizado cerebral normal

15

Las diluciones fueron testadas en
10 duplicado en tres placas diferentes
5

Se calculó el valor de la OD media
Cut off
0 relativa al cut-off para cada dilución
neet 1:5 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 Neg
dilution level
Última dilución positiva = 1:800 (4/5
duplicados positivos)

Excelente reproductibilidad

2669-00 | 22 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 IDEXX Production
Rendimiento: Sensibilidad analítica Animal Services

IDEXX vs. otro test ELISA aprobado en UE

BSE Dilution Series Puntos clave

Sample IDEXX Test A

IDEXX detecta una dilución más alta
Dilution OD450-ODRef OD450-ODRef que otro test aprobado en la UE.
1 3.876 4.000

El rendimiento del test deIDEXX en
4 3.750 3.896 series de dilución es igual o mejor
12 3.038 2.875 que el test comparado.
36 1.861 1.704
72 1.125 0.821
144 0.677 0.541
288 0.426 0.350
576 0.264 0.182
1152 0.162 0.090
2304 0.114 0.064
negative control 0.046 0.020
cut-off 0.166 0.230

2669-00 | 23 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Rendimiento: Sensibilidad y especificidad IDEXX Production
Animal Services

en la validación Canadiense

100% especificidad

Población negativa presenta baja
distribución y buena distancia de
la nota de corte

100% sensibilidad (53/53) datos
no presentados

La única prueba que completo la
validación Canadiense sin un
único reactor inicial

2669-00 | 24 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Rendimiento: Sensibilidad y especificidad IDEXX Production
Animal Services

en cerebro de ovinos

IDEXX
IDEXXeseslo
loúnico
únicoque
quepresenta
presenta100%
100%sensibilidad
sensibilidadyy100%
100%
especificidad sin reactores iniciales
especificidad sin reactores iniciales

Reference:
Reference:Scientific
ScientificReports
Reportsofofthe
theEFSA
EFSAon
onthe
theEvaluation
EvaluationofofRapid
Rapidpost mortemTSE
postmortem TSE
tests intended for use in small ruminants (May and Sept 2005)
tests intended for use in small ruminants (May and Sept 2005)

2669-00 | 25 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Rendimiento:Sensibilidad y especificidad en IDEXX Production
Animal Services

caprinos

100% especificidad (612

muestras, muchas autolizadas)

100% sensibilidad(11/12
muestras con OD>3.5)

2669-00 | 26 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Rendimiento: Sensibilidad y especificidad IDEXX Production
Animal Services

en ovinos

100% sensibilidad y 100%

especificidad

Población negativa presenta una
curva estrecha y distante de la
nota de corte (SD12.5)

Población positiva presenta una
curva estrecha y distante de la
nota de corte (el mas bajo
positivo es 14.6 veces mas que la
nota de corte)

2669-00 | 27 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Rendimiento Scrapie: Sensibilidad para IDEXX Production
Animal Services

Scrapie Clásico, atípico y BSE en ovejas

Alta sensibilidad analítica

Detección de Scrapie en cerebelo
de ovejas

2669-00 | 28 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Rendimiento: Sensibilidad y Especificidad IDEXX Production
Animal Services
Evaluación de laboratorio Fase Uno UE

100% Sensibilidad y Especificidad comparado con la

Inmunohistoquímica

Sensibilidad y Especificidad IDEXX BSE-EIA

True positive True negative Totals
Test Positive 50 0 50
Test negative 0 150 150
Totals 50 150 200

Sensitivity 100 94.0 %

Specificity 100 98.0 %

2669-00 | 29 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

Rendimiento: sensibilidad y especificidad (distrib.) IDEXX Production
Animal Services
Pruebas de campo Fase 2 UE

EU Field Trials- Poor Quality Negatives Puntos clave

and Confirmed Positives
Muestras negativas autolizadas
200
Negative Positive
100% especificidad
180

200 muestras de baja calidad testadas
160
140 durante los trials en el VLA-Newcastle
Frequency

120
287 muestras adicionales de animales

100
muertos procesadas en pruebas de
80
60 especificidad en Francia (no mostradas)
40
20
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 10 15 20 25 30 More
Muestras positivas confirmadas
OD relative to cutoff

100% sensibilidad

2669-00 | 30 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 IDEXX Production
Rendimiento: Estabilidad con muestras Animal Services

autolizadas
Tejido, 37°C
Stability of Brain Tissue Prior to BSE-EIA Testing- Puntos clave
37°C Storage of Normal Bovine Brain tissue

Tejido cerebral mantenido a
37°C durante 11 días
1
Normal 1
OD value relative to cutoff

0.8 Normal 2
La prueba reproduce los

Normal 3 requerimientos de la UE para
0.6 Normal 4 testar muestras negativas
autolizadas sin incremento en la
0.4
señal
0.2

Indica que el test rendirá
0 correctamente con muestras
0 1 4 7 9 11 procedentes de animales
Storage at 37°C- (Days) encontrados muertos en
campo, o muestras no
refrigeradas

Las muestras se muestran

totalmente negativas al test

2669-00 | 31 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 IDEXX Production
Rendimiento: Estabilidad con muestras Animal Services

autolizadas
Homogeneizado, 18°C–22°C
Stability of Brain Tissue Prior to BSE-EIA Testing- Puntos clave
18-22°C storage of 25% brain homogenate

Homogeneizado a temperatura
ambiente durante una semana
16 BSE-1
14 BSE-2
OD value relative to cutoff

BSE-3
Los positivos se mantienen

12
Normal 1 positivos y los negativos se
10 mantienen negativos
Normal 2
8 Normal 3
6
4
2
0
0 1 2 3 5 7

Storage at 18-22°C- (Days)

2669-00 | 32 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 IDEXX Production
Rendimientos: Ciclos Animal Services

Congelación/Descongelación
Homogeneizado
Stability of Brain Homogenate Prior to BSE-EIA Testing- Puntos clave
Freeze/thaw cycles of 25% brain homogenate

El homogeneizado es muy
12 BSE-1
estable a los ciclos de
BSE-2
congelación/descongelación
OD value relative to cutoff

10
BSE-3
8 Normal 1
Fácil acceso a las muestras con
Normal 2 fines de retestaje
6 Normal 3

0
0 1 3 5 8 10

Number of Freeze/thaw cycles

2669-00 | 33 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Ring Trial 2008 en Francia IDEXX Production
Animal Services

AFSSA Lion

LABORATOIRE D’ETUDES ET DE RECHERCHES

EN PATHOLOGIE BOVINE ET HYGIENE DES VIANDES
UNITÉ ATNC
AG. BIACABE
LE 17/12/2008
 88 labs (36 IDEXX, 29 Biorad, 16 Priostrip, 4 Prionics LIA, 3 prionics WB)
 40 samples de campo: 32 BSe neg + 3 BSE alto Pos + dilución series (neat, 1:4,
1:16, 1:32, y 1:64)
 Muestras negativas previamente cualificadas en Priostrip

Resultados
 Todos detectaran los alto positivos
 IDEXX presento el mejor rendimiento en muestras diluidas
 Problemas con LIA y Priostrip porque presentaran alta reacciones inespecíficas o
falso positivo.

2669-00 | 34 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Ring Trial 2008 en Francia IDEXX Production
Animal Services

Resultados IDEXX muestras negativas

 Población negativa bien limpia

 Resultados muy estables entre los laboratorios

 Excelente discriminación entre población negativa y positiva

2669-00 | 35 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Ring Trial 2008 en Francia IDEXX Production
Animal Services

Resultados IDEXX vs Prionstrip para

muestras fuerte positivo

2669-00 | 36 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Ring Trial 2008 en Francia IDEXX Production
Animal Services

Panel de muestras diluidas

 IDEXX presento la mejor sensibilidad en las muestras

diluidas

2669-00 | 37 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

 Paises que utilizan IDEXX - BSE IDEXX Production
Animal Services

 Alemania  USA

 Francia ganó la licitación en 2005

 Italia
 España Es la prueba preferida por la
 Irlanda mayoría de los laboratorios
 Bélgica
 Austria
 Dinamarca
 Republica Checa
 Chile

2669-00 | 38 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

Resumen IDEXX Production
Animal Services

Producto

Excelentes rendimientos—100% sensibilidad y 99.99% especificidad

El mejor rendimiento en el estudio de validación 2005 de la UE

Aprobado en USA, Canada y UE
Ventajas

Es la prueba mas fácil de usar, rápida y robusta; menor tiempo de manejo y sin necesidad
de equipamiento extra

Menor posibilidad de error—SIN etapa de digestión de muestra con PK

Alto rendimiento de manejo manual o con automatización

Calidad contrastada IDEXX

Utiliza la tecnología ELISA de IDEXX preferida y contrastada por una mayoría de
laboratorios a nivel mundial

Distribuidor en cada pais de Latino America, Servicio tecnico local con soporte
internacional
2669-00 | 39 © 2004 IDEXX Laboratories,yInc.
capacitacion.
WWW.IDEXX.COM
WWW.IDEXX.COM
Referencias IDEXX Production
Animal Services

1. Demaimay R, et al. Inhibition of formation of protease-resistant prion protein by trypanblue, sirius red
and other Congo red analogs. Arch Virol. Suppl. 2000;16:277-83.
2. Snow A, et al. Immunolocalization of heparan sulfate proteoglycans to the prion protein amyloid
plaques of Gerstmann-Straussler syndrome, Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie. Lab Invest.
1990;63(5):601-11.
3. Caughey B, Raymond GJ. Sulfated polyanion inhibition of scrapie-associated PrP accumulation in
cultured cells. J. Virol. 1993;67(2):643-50.
4. Caughey B, Race RE. Potent inhibition of scrapie-associated PrP accumulation by Congo red.
J.Neurochem. 1992;59(2):768-71.
5. Ingroso L, et al. Congo red prolongs the incubation period in scrapie-infected hamsters. J.Virol.
1995;69(1):506-508.
6. Ladogana A, et al. Sulfate polyanions prolong the incubation period in scrapie-infected hamsters.
J.Gen Virol. 1992;73:661-5
7. Farquhar CF, Dickinson AG. Prolongation of scrapie incubation period by an injection of dextran
sulphate 500 within the month before or after infection. J.Gen Virol. 1986;67:463-73.
8. Ehlers B, Diringer H. Dextran sulphate 500 delays and prevents mouse scrapie by impairment of
agent replication in spleen. J. Gen Virol. 1984;65:1325-30.

* HerdChek is a trademark or a registered trademark of IDEXX Laboratories in the United States and/or other countries.

2669-00 | 41 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.

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Accesoilimitado
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 Muchas
Muchasgracias
gracias
silvia-zimmerman@idexx.com
silvia-zimmerman@idexx.com
 Interacciones entre Priones y Polyaniones IDEXX Production
Animal Services

Datos biológicos relevantes

Polyaniones
Polyaniones

Tinción histopatológica de agregados de prión
con Rojo Congo y Rojo Serius

La Heparina Sulfato se asocia con placas de

Rojo
RojoCongo
amiloide de proteína prion in vivo (1), y varios Congo
estudios han mostrado que la heparina se une
al prión en el mismo lugar que el Rojo Congo y
el Pentosan polysulfato (2)

Inhibición de PrPsc por Rojo Congo en
neuroblastomas infectados con PrPsc, con
Heparina
Heparina
efectividad relativa a la densidad de sulfatación
(3)

El tratamiento de ratones con polyaniones ha

mostrado retrasar el progreso del scrapie (4)

El Pentosan polysulfato ha sido utilizado para
estabilizar un paciente de vCJD (5)
Pentosan
PentosanPolysulfato
Polysulfato

2669-00 | 45 © 2004 IDEXX Laboratories, Inc.