INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Separación pigmentos de las

hojas (1906)

Columna: carbonato cálcico,

alúmina y sacarosa
Eluente: ligroína y etanol
Michael Tswett
(1872-1919)

Acuñó el término cromatografía del griego “chroma”

(color) y “graphein” (escribir)
 Introducción

Cromatografía
método utilizado inicialmente para la separación de los componentes de una
mezcla en el cual dichos componentes se distribuyen entre dos fases, una de
las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase
estacionaria puede ser un sólido, un líquido sobre un soporte sólido o un gel.
La fase estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en
forma de capa o dispuesta en forma de película. La fase móvil puede ser un
gas, un líquido o un fluido supercrítico

Proceso cromatográfico: ocurre como resultado de repetidos equilibrios de

distribución de los componentes de la muestra entre las dos fases no
miscibles entre sí.
Constante o coeficiente de distribución
Cs,e cantidad de soluto en la
,
Sm Se = fase estacionaria
, Cs,m la concentración de soluto
en la fase móvil
 Introducción

A > KD > afinidad < velocidad de migración

cromatograma: registro del perfil de concentración o

de masa como una función del movimiento de la fase
móvil: volumen eluído o tiempo transcurrido desde la
introducción de la muestra
 Introducción

Esquema básico de un cromatógrafo

1. Fuente de fase móvil (su naturaleza depende fundamentalmente del fluido que se utilice).
2. Sistema de regulación y medida del caudal o la presión de la fase móvil.
3. Sistema de introducción (inyección) de la muestra.
4. Columna.
5. Recipiente termostatizado para controlar la temperatura de la columna
6. Sistema de detección (transforma propiedad física f. m. en señal eléctrica)
7. Sistema de amplificación y tratamiento de la señal eléctrica generada por el detector
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

según el estado físico de las fases móviles y estacionarias
según el proceso físico o principio cromatográfico (mecanismo de
separación)
según la disposición/configuración de la fase estacionaria
según el procedimiento de desarrollo cromatográfico

Según el estado físico de las fases móviles y estacionarias

Fase móvil Fase estacionaria Técnica cromatográfica

sólido C. líquido-sólido
Líquido
líquido C. líquido-líquido
sólido C. gas-sólido
Gas
líquido C. gas-líquido
Fluido supercrítico sólido C de fluidos supercríticos
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

según el proceso físico o principio cromatográfico (mecanismo de
separación)

Cromatografía de adsorción
Cromatografía de reparto
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de exclusión molecular
Cromatografía de afinidad
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

Mecanismos de separación
a) adsorción
b) reparto
c) intercambio iónico
d) exclusión molecular
e) afinidad
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

según la disposición/configuración de la fase estacionaria

Cromatografía en columna

Cromatografía plana Cromatografía en capa fina

Cromatografía en papel

Cromatogafía en papel Cromatogafía en capa fina Cromatogafía en columna

 Principio Tipo de Fase Disposición de la
cromatográfico Móvil fase estacionaria Tipo de cromatografía

C. de adsorción Gas Columna Cromatografía gas-sólido (GC)

Competencia entre
Fluido Columna Cromatografía de fluidos supercríticos
un adsorbente sólido
supercrítico (SFC)
y la fase móvil
C Líquido Columna Cromatografía líquida (LC, HPLC)
r Plana Cromatografía en capa fina (TLC)
o Cromatografía en papel (PC)
m Columna Cromatografía gas-líquido (GC)
C. de reparto Gas
a Competencia entre
t una fase estacionaria Fluido Columna Cromatografía de fluidos supercríticos
supercrítico (SFC)
o líquida y la fase móvil Columna Cromatografía líquida (LC, HPLC)
g Líquido
Plana Cromatografía en capa fina (TLC)
r
Cromatografía en papel (PC)
a
C. de cambio iónico Líquido Columna Cromatografía de intercambio iónico
f Competencia entre (IEC)
í una fase estacionaria
a cambiadora de iones y
la fase móvil líquida
C. de permeación Líquido Columna Cromatografía de permeación sobre
Competencia entre geles (GPC)
una matriz porosa y
una fase móvil líquida
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

según el procedimiento de desarrollo cromatográfico

Cromatografía de elución
Cromatografía de análisis frontal
Cromatografía por desplazamiento
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Cromatografía de elución.
• se introduce la mezcla a separar en la columna o superficie
• La mezcla es arrastrada con una fase móvil que tenga menor afinidad por
la fase estacionaria que los componentes de la mezcla
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Cromatografía de elución.
información que nos reporta el cromatograma

Nos indica la complejidad de la muestra, a partir del número de

picos que aparecen en él.
Nos permite la identificación de los mismos (información
cualitativa) mediante la medida precisa de la posición del pico.
Nos permite la determinación cuantitativa de la concentración del
compuesto, a partir del área o de la altura de pico.
Nos da una indicación del funcionamiento de la columna.
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Cromatografía análisis frontal.
• La disolución que contiene la muestra se añade continuamente a la columna.
• El componente con menor afinidad por la fase estacionaria es eluido en primer
lugar, en forma pura, emergiendo a continuación una mezcla de compuestos.
• Obtención de datos termodinámicos, separación analito menor afinidad,
purificación disolventes.
 Clasificación de las técnicas cromatográficas

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Cromatografía por desplazamiento.
• Se introduce una pequeña cantidad de la mezcla en la columna
• Se introduce un disolvente que contiene un desplazador (D) con mayor afinidad
por la fase móvil que los componentes de la mezcla.
• La mezcla se desplaza a lo largo de la columna a la misma velocidad que el
desplazador obteniendo bandas de compuestos puros.
• Los solutos eluiran con un determinado orden dependiendo de la fuerza de
interacción relativa Soluto/ Desplazador,
 Teoría general de la cromatografía en columna

TEORÍA GENERAL DE LA CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA:

CROMATOGRAFÍA DE ELUCIÓN
Definiciones
Fase estacionaria (lecho cromatográfico o sorbente): material sobre el
que se retienen los solutos y provocan su separación. Puede ser un
sólido, un líquido o un gel.
Fase móvil: líquido, gas (gas portador) o fluido supercrítico que se mueve
a través de la fase estacionaria en una dirección definida y arrastra los
compuestos a lo largo del sistema.
Elución: proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase
estacionaria transportando los componentes a separar.
Eluente o eluyente: disolvente o disolución utilizado en el proceso de
elución y que interacciona con la fase estacionaria para eluir los
componentes de la mezcla.
Eluato: disolución o sustancia obtenida mediante un proceso de elución.
 Teoría general de la cromatografía en columna

Proceso cromatográfico:
ocurre como resultado de repetidos equilibrios de distribución de los
componentes de la muestra entre las dos fases no miscibles entre sí.
Constante o coeficiente de distribución
Cs,e cantidad de soluto en la
,
Sm Se = fase estacionaria
, Cs,m la concentración de soluto
en la fase móvil

ó ∝ .

A mayor KD mayor lentitud de salida del lecho cromatográfico.

KD es una constante termodinámica y depende de
la composición de la fase móvil,
la naturaleza de la fase estacionaria,
la naturaleza del soluto
la temperatura
 Teoría general de la cromatografía en columna

Parámetros cromatográficos.

Cromatograma de un
componente

• Tiempo muerto, tM: tiempo requerido para que una especie no retenida alcance
el detector
• Volumen muerto, VM: volumen de fase móvil que se requiere para eluir una
especie no retenida
• Tiempo de retención, tR: tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra
hasta que el componente alcanza el detector.
• Volumen de retención, VR : volumen de fase móvil que se requiere para eluir un
soluto de la columna cromatográfica.
 Teoría general de la cromatografía en columna

Parámetros cromatográficos.
• Tiempo de retención corregido, t’R : tiempo que realmente se invierte en
la retención de un soluto por la fase estacionaria
′ = −
• Factor de retención, k: tiempo que realmente se invierte en la retención
de un soluto por la fase estacionaria.
′
=

= +

L, longitud de la columna y u, la velocidad lineal media de la fase móvil

 Teoría general de la cromatografía en columna

Parámetros cromatográficos.

= la relación Ve/Vm se denomina relación de fases, β

= + !

el tiempo de retención de un soluto depende de:

Las dimensiones de la columna: L y β.

Las condiciones de trabajo, u.
El coeficiente de distribución, magnitud termodinámica
independiente de las condiciones de trabajo
 Teoría general de la cromatografía en columna

Parámetros cromatográficos.
• Selectividad, Factor de separación: capacidad de una determinada fase
estacionaria para separar dos componentes A y B

,# ′#
"= =
,$ ′$

,# −
" =
,$ −

Cromatograma de dos componentes

si α > 1.14 se considera que la separación es fácil, si α < 1.01 se considera

una separación difícil
α depende de: • Naturaleza de los solutos
• Naturaleza de las fases estacionaria y móvil
• Temperatura
 Teoría general de la cromatografía en columna

Características del pico cromatográfico.

Anchura: relacionada con el

tiempo de residencia y la
eficacia.
Área: proporcional a la
concentración de soluto:
análisis cuantitativo.
Altura: corresponde a la zona
de máxima concentración.
Donde se mide el tiempo de
retención.

Anchura de pico en la base, Wb, igual a 4 σ.

Anchura de pico a media altura, Wh, medida a la mitad de la altura de
pico.
Anchura de pico en los puntos de inflexión, Wi, corresponde a 2σ.
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.

La eficacia de la columna nos da una medida cuantitativa de la

extensión del ensanchado de banda

Modelos teóricos: teoría de platos

teoría cinética.
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.
Teoría de platos

La columna puede visualizarse como dividida en un número de

discretas secciones, denominadas platos teóricos.
Se considera que en cada plato teórico se establece un equilibrio del
componente entre la fase móvil y la fase estacionaria, y el
desplazamiento del componente a través de la columna se trata
como una transferencia de la fase móvil desde un plato al siguiente.
La eficacia de la columna aumenta al hacerlo el número de estas
transferencias, es decir, al aumentar el número de platos teóricos, N.
El coeficiente de distribución del soluto es constante en todos los
platos e independiente de la concentración de soluto.
La difusión del soluto en la dirección axial es despreciable.
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.
Teoría de platos
'
El número de platos teóricos se define como %=
&

Donde tR es el tiempo de retención del compuesto y σ la desviación estándar del pico

gaussiano
' '
%= ( = +, +,
)* )-

El número de platos teóricos será directamente proporcional a la longitud de la

columna

%=
.
Donde L es la longitud de la columna y H es la altura equivalente a un plato teórico
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.
Picos asimétricos.

Pico con cola Pico con frente

factor de asimetría a un décimo de la 6 6

41,7 × 41,7 ×
altura máxima de pico )3.5 +*
%= =
+ 1,25 + 1,25
* *
í =
*
Donde W0.1 es la anchura de pico a un décimo de la
altura
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.

La teoría de platos explica satisfactoriamente la forma de los picos

cromatográficos, pero falla al intentar justificar el ensanchamiento de los
mismos.

La difusión axial contribuye significativamente al ensanchado de

banda
La constante de distribución es independiente de la concentración
de soluto en un intervalo de concentraciones estrecho
La suposición de que el flujo se produce de manera discontinua es
falsa
La teoría falla al relacionar el proceso de ensanchado de banda con
parámetros experimentales que puede modificar el analista: tamaño
de partícula, velocidad de la fase móvil, etc.
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.
Teoría cinética
La teoría cinética considera que el ensanchado de las bandas o picos
cromatográficos se produce como consecuencia de que los distintos
procesos de transferencia de masas durante el desplazamiento de un
compuesto a lo largo de la columna se producen a distintas velocidades
finitas

Dispersión en la fase móvil.

Difusión longitudinal del soluto a lo largo de la columna
Resistencia a la transferencia de masas
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.
Dispersión en la fase móvil.

La contribución de la dispersión en fase móvil

a la altura equivalente a un plato teórico es
.$ = : ;

Donde λ es una constante de proporcionalidad (depende de las dimensiones, geometría y uniformidad del
empaquetamiento de la columna) dp es el tamaño medio de partícula de la fase estacionaria.
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.
Difusión longitudinal del soluto a lo largo de la columna

La contribución de la difusión longitudinal a la 2=

altura equivalente a un plato teórico es .# ≅

γ es un factor de obstrucción, DM el coeficiente de difusión del compuesto en la fase

móvil, u la velocidad lineal de la fase móvil (u = L/tm)
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.
Resistencia a la transferencia de masas
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.
Resistencia a la transferencia de masas

Las contribuciones de la transferencia de masa en 6

> ?
la fase estacionaria, He, y la transferencia de masa . =
en la fase móvil, Hm, a la altura equivalente a un 1+ 6
plato teórico son
6 6
?( ;, A
. =

df es el espesor de la fase estacionaria, dc el diámetro de la columna, dp el tamaño

de partícula del relleno; De y Dm coeficientes de difusión del soluto en la fase
estacionaria y en la fase móvil; k factor de retención del soluto; y q es una
constante relacionada con el material de relleno de la columna
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.
Curvas HETP. Ecuación de Van Deemter

. = .$ + .# + . + .

6 6 6
2= > ′ ? ?( ;, A
.=: ; + + 6
+
1+ ′

Ecuación de Van Deemter

#
.=$+ +
 Teoría general de la cromatografía en columna

Eficacia de la columna.

Relación entre la altura equivalente a un plato teórico y la velocidad lineal de la fase móvil
 Teoría general de la cromatografía en columna

Resolución.
• medida cuantitativa de la capacidad de una columna cromatográfica
para separar dos analitos

− ,$ ' ( −
=
,#
> ,# ,$ A
)*,$ + )*,# ,# ,$ =
, (CC ()-,$ + )-,# A
2

Si R = 1.5, los picos sólo se superponen un

0,3 %,
Si R = 1.0, los picos se superponen un 2%.
Esta resolución es adecuada para la
mayoría de los análisis
 Teoría general de la cromatografía en columna

Resolución.
R = ƒ (selectividad, eficacia, factor de capacidad)

"− +
= % =
$ #
, " + '

Variación de R con el factor de selectividad (α) Variación de R con el factor de retención (k)
para valores de N y k fijos para valores de N y α fijos
 Teoría general de la cromatografía en columna

Resolución.

Número de platos teóricos requeridos para

una cierta separación con diferentes valores
del factor de separación (k = 3 y R = 1.0)

Factor de N requeridos
separación, α
1.005 1 150 000
1.01 290 000
1.015 130 000
1.02 74 000
1.05 12 500
1.10 3 400
1.20 1 020
1.50 260
 Optimización de las separaciones cromatográficas

Optimización de las separaciones cromatográficas.

• Aumento del número de platos (N, disminución de H) esto se consigue

- Cambiando las dimensiones de la columna (Longitud o diámetro
interno)
- Reduciendo el tamaño de partícula del relleno.
- Reduciendo la velocidad de la fase móvil (o el caudal)
• Aumentar la retención (k)
- Modificando la composición de la fase móvil (LC)
- Modificando la temperatura (GC)
• Aumentar la selectividad (α)
- Modificando la composición de la fase móvil (LC) uso de
gradientes.
- Modificando la temperatura (GC) uso de gradientes.
- Modificando la fase estacionaria, cuando lo anterior no de
resultado.
 Aplicación al análisis cualitativo y cuantitativo

Aplicaciones de la cromatografía.

Separar compuestos: purificación, preparativa

Análisis cualitativo
Análisis cuantitativo

Análisis cualitativo

• Más limitado que el de otras técnicas (TFIR, RMN o MS).

• Cromatografía en superficie: posición del pico en relación con el
frente del disolvente.
• Cromatografía en columna: tiempo de retención o, mejor, el factor
de selectividad relativo a un patrón interno.
 Aplicación al análisis cualitativo y cuantitativo

Análisis cualitativo
Cromatografía en
columna
Cromatografía plana
PAH

Muestras de Pan tostado

Analyst, 2001, 126, 1326–1331

 Aplicación al análisis cualitativo y cuantitativo

Análisis cuantitativo

Altura de pico, h
Área de pico, A

Menos influenciada por

cambios en las condiciones
de separación
 Aplicación al análisis cualitativo y cuantitativo

Análisis cuantitativo

Integración de picos no resueltos

 Aplicación al análisis cualitativo y cuantitativo

Análisis cuantitativo

Integración de picos en cola de un pico mayoritario

 Aplicación al análisis cualitativo y cuantitativo

Análisis cuantitativo
 Aplicación al análisis cualitativo y cuantitativo

Análisis cuantitativo
Métodos de calibración

patrón externo,
patrón interno,
adición estándar (en mucha menor medida)
normalización de áreas
• Eluir todos los componentes de la muestra,
• Medir las áreas de todos los picos eluidos y
• Obtener las correspondientes áreas de pico corregidas (mediante los
correspondientes factores de respuesta del detector)
$ E
% E = × GG
∑$
• Útil para mezclas que contienen una serie de compuestos conocidos.
una mezcla de reacción, para conocer el progreso de la reacción,
una mezcla de isómeros, para conocer su relación de concentración
un compuesto comercial para conocer su grado de pureza.
• Se asume que todas las sustancias de la muestra aparecen en el cromatograma