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Fortaleza, Ceará
2011
1
ÁTILLA HOLANDA DE ALBUQUERQUE
Fortaleza, Ceará
2011
2
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
CDD: 636.089
3
ÁTILLA HOLANDA DE ALBUQUERQUE
Banca Examinadora
_______________________________________ _____________________________________
Prof. Dr. William Cardoso Maciel Dr. Régis Siqueira de Castro Teixeira
(Orientador) (Examinador Co- orientador)
_______________________________________ _____________________________________
Profa. Dra. Rosa Patricia Ramos Salles Profa. Dra. Salette Lobão Torres Santiago
(Examinador) (Examinador)
BIOLAB Universidade Estadual do Ceará- UECE
4
A minha Mãe
Maria Holanda Gomes que
sempre me incentivou e me
apoia a investir no que há de
bom e importante na vida!
Dedico
5
AGRADECIMENTOS
À Rosa Patrícia Ramos Salles que me ajudou com seus ensinamentos, pela
compreensão, companheirismo, carinho, apoio nos momentos mais difíceis da minha
vida.
Ao Isaac Neto Goes da Silva que me ajudou em vários momentos durante
meu mestrado com seus ensinamentos e companheirismo.
6
Ao meu amigo Régis Siqueira de Castro Teixeira pela capacidade de ajudar
a me deixar louco com tantas perguntas na escrita do meu projeto, estas que agradeço,
pois contribuíram bastante para enriquecê-lo.
7
Aos meus amigos de todas as horas que me deram grande apoio e me
ajudaram bastante no final do meu trabalho, Carlos Henrique Pinheiro, Graziano
Moraes e Alex Sousa Bezerra.
8
Nada lhe posso dar que já não exista em
você mesmo. Não posso abrir-lhe outro
mundo e imagens, além daquele que há
em sua própria alma. Nada lhe posso dar a
não ser a oportunidade, o impulso, a
chave. Eu o ajudarei a tornar visível o seu
próprio mundo, e isso é tudo.
Hermann Hesse
9
RESUMO
10
influenciado na baixa frequência de SENalr nas amostras obtidas de swabs cloacais.
Como também apresentar excreções intermitentes de SENarl, devido aos achados do
patógeno nas fezes até 14 Dpi, fazendo necessário programas mais eficazes de controle
de Salmonella em pombos, não adotando apenas o método de cultura de swab cloacal
como determinante de um diagnóstico, assim como utilizar maiores amostragens de
pombos e periodicidade dessas coletas em tais casos, para assim saber o estado real das
aves.
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ABSTRACT
The domestic pigeon (Columba livia) belong to the Order Columbiformes, family
Columbidae. The feeding of pigeons is quite varied (seeds, food scraps) which favors
the multiplication of these birds, resulting in disorders related to the environment and
human health, as they may transmit viral diseases, fungal and bacterial infections.
Among the highlights is a bacterial salmonellosis, zoonosis of major public health
importance. The strain Salmonella Enteritidis (SE) is responsible for the largest number
of outbreaks in humans. Birds have an important role in the spread of salmonella and
can act as asymptomatic carriers, continuously excreting the pathogen in the stool. In
columbídeos the behavior of the SE is still poorly understood, therefore, this study
aimed to inoculate in pigeons by an oral strain of Salmonella Enteritidis resistant to
nalidixic acid (SENarl) isolated from chickens to evaluate the route and timing of
disposal of the same the environment. We used 64 adult pigeons (F4) housed in pairs
per cage, divided into two groups: A (n = 32) and B (n = 32) at doses of 1,9 x 106 CFU /
mL and 1,9 x108 CFU / mL, respectively . Each group was divided into two subgroups
for analysis cloacal swabs and concentration of SE in organs such as liver and spleen
(n=24) and SENarl concentration in feces (n=8), subgroup 1 and subgroup 2
respectively. On days 3, 7, 14, 21, 28 and 35 post-inoculation (dpi), stool samples were
collected and four pigeons were euthanized from each group to collect liver and spleen
CFUs and frequency analysis of positive SENalr after enrichment of organs macerated
and incubated in Selenite Cystine broth containing 40μg/mL of novobiocin (SCNov).
On days 3, 5, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28, 31 and 35 cloacal swabs were collected to assess
the positivity of the pathogen. It was observed that there were no deaths of birds
throughout the experiment. Unable to count SENalr of CFUs in the organs, however,
was able to recover the bodies of pigeons SENalr Group B with 7 dpi after selective
enrichment in SCNov with subsequent plating on brilliant green agar with nalidixic acid
(25 µg / mL) and novobiocin (2 µg / mL). Another consequence occurred due to the
dosage administered was not to detect the pathogen in the liver or spleen from 14 dpi.
Swabs was observed in the excretion of the pathogen up to 14 DPI, with the highest
dose (group B) had increased excretion of the pathogen (p <0.05) compared to group A
only on days 3 and 5 dpi. The use of a strain not adapted to pigeons appears to have
influenced the low frequency of SENalr in samples obtained from cloacal swabs. But
also make excretions SENarl intermittent, due to the findings of the pathogen in feces
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up to 14 DPI, making necessary the most effective programs for control of Salmonella
in birds, not only by adopting the method of cloacal swab culture as a determinant of a
diagnosis, as well as use larger samples of pigeons and frequency of these collections in
such cases, in order to know the real state of the birds.
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
IgA – Imunoglobulina A
mg - Miligrama
µg – Micrograma
pH - potencial hidrogeniônico
RV – Rapapport-Vassiliadis
SC – Selenito-Cistina
SE – Salmonella Enteritidis
SG – Salmonella Gallinarum
SP – Salmonella Pullorum
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Salmonella Enteritidis isolated from liver and spleen samples of inoculated
pigeons………………………………………………………........................................49
TABELA 2 Absolute (n) and relative (%) frequencies of positive swabs for Salmonella
sp. in the post-inoculation period……........................................................................51
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 17
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................. 18
2.1 Pombos........................................................................................................ 18
2.2 Gênero Salmonella...................................................................................... 19
2.2.1 Histórico................................................................................................... 19
2.2.2 Etiologia................................................................................................... 21
2.2.3 Epidemiologia (Transmissão).................................................................. 24
2.2.4 Patogenia.................................................................................................. 28
2.2.5 Patologia.................................................................................................. 29
2.2.6 Sinais Clínicos......................................................................................... 33
2.2.7 Métodos de diagnósticos.......................................................................... 34
2.2.8 Controle................................................................................................... 36
2.2.9 Imunidade e Vacinação........................................................................... 38
3. JUSTIFICATIVA........................................................................................ 40
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA......................................................................... 41
5. OBJETIVO.................................................................................................. 42
7. CONCLUSÕES........................................................................................... 58
8. PERSPECTIVA........................................................................................... 59
9. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA........................................................... 60
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1 INTRODUÇÃO
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mesma cidade, González-Acuña et al. (2007), além de fezes retais, isolaram Salmonella
spp. em diversos órgãos de 100 pombos, encontrando um total de 4% de contaminação
bacteriana. Adesiyun et al. (1998) detectaram 5% de positividade para Salmonella sp.
nas fezes de pombos pertencentes à Trinidad. Passamonti et al. (2000), conseguiram
isolar Salmonella spp. em pombos em 2,3% de 130 cidades italianas averiguadas.
O comportamento de columbídeos infectados com bactérias do gênero
Salmonella spp. ainda é pouco elucidado, principalmente a respeito da Salmonella
Enteritidis (SE). Dessa forma, faz-se necessário conhecer o comportamento da SE em
pombos inoculados infectados por esse agente, e analisar a via de excreção e o período de
eliminação do patógeno ao meio ambiente.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Pombos
19
Embora os historiadores e os cientistas não estejam de acordo sobre a data
exata da domesticação do pombo pelo homem, estima-se que isso aconteceu durante
cinco ou seis mil anos. Os babilônios, egípcios, líbios são considerados como os
primeiros povos a domesticarem os pombos. Esse processo ocorreu quase que
simultaneamente em cada uma dessas regiões, isso foi possível devido aos laços de
proximidade que existia entre estes povos com tais aves. O pombo da rocha viveu no sul
do Mediterrâneo, este foi quem deu origem ao conhecido pombo doméstico. Vários
tipos de pombos de vida livre são distribuídos em todo o mundo, a capacidade de
adaptação dessa espécie é observada, pois são vistos diariamente em todos os países
(PIÑEIRO et al., 2009).
Após sua domesticação se disseminaram por todo o planeta. Sua utilização
inicial era envio de mensagens quando criados por reis e campanhas militares, e seguida
pela sua beleza cativante. Hoje o pombo doméstico, independentemente de raça, tem
sido utilizado pelo homem para alimentação, comunicação, pesquisa e entretenimento,
como aves ornamentais ou animais de estimação. Ele tem sido um símbolo de pureza,
paz, liberdade e dignidade que aparecem nos textos religiosos, fábulas, histórias infantis
populares (PIÑEIRO et al., 2009).
2.2.1 Histórico
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Schottmüller designou como paratifo as enfermidades abdominais do homem similares
ao tifo.
Em aves, a primeira descrição documentada de salmonelose foi feita no ano
de 1885 em pombos e, somente, entre os anos 1920 e 1930, foram descritos os
primeiros surtos em galinhas e perus (SILVA, 1991). Com o tempo, diversos autores
vêm isolando numerosos agentes do grupo, com maior incidência, às Salmonella
enterica sorovar Typhimurium (ST) e Salmonella enterica sorovar Enteritidis (SE),
espécies particularmente responsáveis pelas toxinfecções alimentares no homem. A
Salmonella foi identificada como uma importante causa de doenças há 100 anos e tem
sido objeto de extensivos estudos (LAX et al., 1995).
No início do século XX, a caracterização das bactérias do gênero
Salmonella ainda era confusa, mas com a utilização de provas sorológicas a partir de
1925, começou a ficar mais clara. Posteriormente, foram descritos vários sorotipos de
Salmonella, aproximadamente 900, classificados através da terminologia de White, que
deu origem ao esquema de Kaufmann-White, o qual foi reconhecido a partir de 1932
(CORRÊA e CORRÊA, 1992). Nos séculos XIX e XX, a febre tifóide, causada por S.
Typhi predominou entre as salmoneloses humanas, tornando-se rara a partir de 1950. As
manifestações clínicas da salmonelose em seres humanos passaram de uma infecção
sistêmica para uma gastroenterite de origem alimentar, provocada por vários sorotipos,
marcada por diarreia, febre e dor abdominal, com rara invasão sistêmica (TIETJEN,
1995).
A partir de 1980, ocorreram surtos humanos causados pelo sorovar
Enteritidis nos EUA, Grã – Bretanha e outros países da Europa, chamando atenção pelas
fontes comuns de infecção. As investigações epidemiológicas identificaram o consumo
de ovos ou alimentos contendo ovos como responsáveis pela maioria dos surtos devido
a sorovares específicos de SE. Estas informações foram divulgadas com grande alarde
pelos veículos de comunicação, causando grandes prejuízos aos produtores de ovos
(SILVA e DUARTE, 2002). A SE foi inicialmente introduzida em granjas avícolas
através de ratos, que são considerados um reservatório natural desta bactéria. A SE foi
isolada de roedores presentes em áreas urbanas já em 1930, no entanto, somente na
década de 80, a SE se disseminou em grandes proporções em planteis avícolas
(BÄUMLER et al., 2000). Uma provável razão para este fato seria a infecção de lotes de
aves reprodutoras, que através da via vertical disseminou-a para a progênie (LISTER,
1988).
21
2.2.2 Etiologia
22
Em relação ao pH, a Salmonella spp. cresce em intervalo de 4,5 a 9,0, com
crescimento ótimo na entre 6,5 a 7,5, sendo este o pH da maioria dos alimentos de
origem animal. Segundo Costa (1996), geralmente em pH abaixo de 4,0 e acima de 9,0
as salmonelas são destruídas lentamente.
Para a distinção dos sorovares, são utilizados antissoros que reagem com
antígenos presentes na célula bacteriana. Existem três diferentes tipos de antígenos que
podem identificar os sorovares de Salmonella spp. : antígeno somático (O), antígeno
flagelar (H) e o antígeno capsular de virulência (Vi). Composto por repetidas
subunidades de oligossacarídeos, existindo um tipo imunológico de antígeno ”Vi”,
encontrado somente nas S. Typhi, S. Dublin, S. Paratyphi C (CAMPOS, 2002) e
S. Hirschfeldii (FRANCO e LANDGRAF, 1996). O antígeno somático O apresenta-se
na porção mais externa da parede bacteriana e corresponde à parte antigênica da camada
de lipopolissacarídeos (LPS), presentes na membrana celular de todas as bactérias Gram
negativas como Salmonella spp. (REEVES et al., 1996; SELANDER et al., 2002).
O antígeno H é localizado na porção média, sendo o filamento flagelar, a
Salmonella ssp. possui dois tipos de antígeno H, os da fase 1 e de fase 2. Os antígenos H
da fase 1, são homólogos a outras bactérias entéricas , enquanto antígenos H de fase 2
são específicos do gênero Salmonella (CAMPOS, 2005).
Essas subunidades formam regiões altamente variáveis, em que os tipos de
arranjos dos açúcares determinam diferentes epítopos e assim, a especificidade de cada
sorovar (KONEMAN et al., 2001). Devido à presença dos antígenos na camada de
lipopolissacarídeos (LPS), estes facilitam o contato direto da bactéria com o ambiente,
contribuindo na interação do agente com o hospedeiro. Isso faz com que Salmonella
spp. possa resistir em diferentes condições como nas fezes, poeira, ambientes secos,
acidez do estômago, lúmen do intestino, espaço extracelular dos tecidos do hospedeiro e
dentro de macrófagos (RYCROFT, 2000). O autor também descreve que uma mutação
no formato da cadeia LPS modifica o formato de crescimento da colônia em placa,
fazendo com que deixe de crescer em formato liso (S) passando para um crescimento
irregular, e assim denominado de cepa rugosa (R). Os antígenos da membrana celular
mais comuns dentro da subespécie enterica são aqueles encontrados nas salmonelas dos
sorogrupos A, B, C1, C2, D e E (UZZAU et al., 2000; GRIMONT e WEILL, 2007).
Atualmente, a Organização Mundial de Saúde (OMS), através do Centro de
Referência e Pesquisa de Salmonella, recomenda uma nomenclatura que reflete os
recentes avanços na taxonomia do gênero, consistindo de duas espécies, Salmonella
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enterica classificada em seis subespécies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae,
houtenae e indica) e Salmonella bongori (POPOFF et al. 1996). Os nomes foram
mantidos somente para os sorotipos da subespécie enterica, que devem ser escritos com
a primeira letra maiúscula e não devem ser de forma itálica (CAMPOS, 2002). Logo, a
denominação de Salmonella “enteritidis” passando a ser Salmonella enterica
subespécie enterica sorotipo (ou sorovar) Enteritidis, ou de forma simplificadamente de
Salmonella Enteritidis (POPOFF et al., 1996).
Sabe-se que a Salmonella enterica, subespécie enterica, representa o maior
número de sorotipos (RODRIGUES, 2005) e dentre estes, cerca de 80 a 90 são os mais
relatados em casos de infecção dos seres humanos e animais e em alguns casos podem
infectar as aves, causando o ou não o paratifo aviário que de forma horizontal, por meio
de produtos alimentícios de origem avícola, estão associados a casos de toxinfecção
alimentar em humanos (BERCHIERI JÚNIOR, 2000). Sorotipos pertencentes a
subespécie entérica podem provocar as seguintes enfermidades em aves industriais:
pulorose, causada por S. enterica sorovar Pullorum; tifo aviário, causada pela S.
enterica sorovar Gallinarum; e o paratifo aviário, causado por qualquer Salmonella que
não seja um dos agentes da pulorose ou do tifo aviário. Entre as paratifóides, destacam-
se Salmonella enterica sorovares Enteritidis, Typhimurium e Agona, que ocasionam
salmoneloses em diversos animais (LAX et al., 1995). Em pombos a salmonelose
constitui uma infecção por cepas Salmonella patogênica específica (PASMANS et al.,
2003), em particular a Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Typhimurium
variante Copenhague bacteriófagos 2 e 99 (POHL et al., 1983, PASMANS et al., 2004).
A Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis foram dos sorotipos
mais isolados de seres humanos nos Estados Unidos, em 2005 (CDC, 2007). Em termos
financeiros, os prejuízos causados pelas salmoneloses em seres humanos nos Estados
Unidos da América estão estimados em 3,5 bilhões de dólares anuais, cálculo
contabilizando em perdas de produtividade e gastos com medicamentos (UNITED
STATES, 1995). Na Inglaterra e no País de Gales, um surto ocasionado por Salmonella
Enteritidis em 1.482 indivíduos, 73% dos prejuizos formam diretamente associados com
o diagnóstico, tratamento e faltas ao trabalho (ROBERTS e SOCKETT, 1994).
A Salmonella Enteritidis é comumente isolada de materiais avícolas
enquadrando-se como principal responsável pela ocorrência de infecções humanas
(PERESI et al., 1998; MUNRO et al., 1999) e a Salmonella Typhimurium adquiriu
caráter relevante sendo microrganismo emergencial, principalmente em países europeus
24
(FISHER, 1997), sendo ampliado o monitoramento da presença de Salmonella spp. em
carcaças de frangos para a identificação dos sorovares (ALEXANDRE et al., 2000;
BRASIL, 2003). No Brasil, a S. Enteritidis (SE) é o sorotipo mais identificado nos
casos de toxinfecção alimentar em seres humanos desde a década 1990. Nos Estados
Unidos, entre 1985 e 1995, foram descritos 582 surtos provocados por SE, relacionados
com 24.000 doentes, 2.200 internações e 70 óbitos, incluindo crianças e idosos
(DICKEL, 2004).
25
Animais domésticos e insetos como pulgas, baratas e moscas (JOVER, 1968).
Segundo Berchieri Junior e Barrow (1999) a SE pode sobreviver através do ciclo vital
das moscas. Holt et al. (2007) realizaram uma pesquisa em que forneciam mosca
(Musca domestica) contaminadas com SE para galinhas livres de patógenos específicos
(SPF). Monitorando a excreção fecal de SE nas aves durante três semanas, obtiveram
103 a 107 células/g de fezes, após a primeira semana do desafio. Concluíram que moscas
contaminadas com SE podem transmitir a bactéria para as aves. No mesmo estudo,
observou-se também que moscas livres de Salmonella spp. foram colocadas em contato
com aves desafiadas com SE e que após 48h de exposição, aproximadamente 50% das
moscas estavam contaminadas, concluindo que podem se contaminar por meio do
contato com aves infectadas e com isso, disseminar a bactéria para outras aves e meio
ambiente.
O gênero Salmonella não tem sido descrito como agente casual nas
infecções em animais domésticos, porém, Ribeiro et al. (2003) em um relato de caso,
identificaram a SE como possível responsável de infecção do trato urinário de um cão,
confirmando as condições dos cães como reservatórios do gênero Salmonella.
A contaminação de matérias primas e rações para aves contribuem para a
introdução de Salmonella nos planteis (GIRÃO, 1985). O isolamento de Salmonella é
possível em ração pronta como também em seus ingredientes. A matéria que compõem
a ração, tanto as de origem animal como as de origem vegetal (milho e soja), são fontes
potenciais do patógeno para aves de granja (DAVIES, 1992). Vários sorovares foram
isolados de matérias-primas utilizadas para produção de ração para aves. Dentre eles
estão: S. Agona e S. Typhimurium (grupo B), S. Mbandaka e S. Ohio (grupo C1), S.
Panama (grupo D1), S. Cubana e S. Havana (grupo G), além de outros sorovares como,
S. 4,12:i:-, S. Inganda, S. Infantis, S. Mbandaka O14+, S. Grumpensis (HUGH-JONES et
al., 1975; YOSHIMURA et al., 1979; BERCHIERI JÚNIOR et al., 1984; BERCHIERI
JÚNIOR et al., 1989; HOFER et al., 1997; SOUZA et al., 2002).
Relatos de presença de mais de um sorovar, principalmente em ingredientes
de origem animal como farinha de carne, há tempos, também tem sido relatada na
literatura (MIRANDA et al., 1978; BERCHIERI JÚNIOR et al., 1984). A detecção de
bactérias em matérias-primas e rações prontas demonstra ser este um meio de
transmissão considerado de grande importância para a disseminação (BERCHIERI
JUNIOR. et al., 1984). Silva e Duarte (2002) relataram que praticamente todos os
levantamentos realizados em uma retrospectiva de Salmonella no Brasil, não houve a
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ocorrência dos sorovares adaptados às aves como: Salmonela Pullorum (SP),
Salmoenlla Gallinarum (SG) nem Salmonella Enteritidis (SE), mas mesmo assim, as
matérias primas de origem animal têm sido retiradas das formulações de rações como
forma de controle de Salmonella ou as mesmas têm sofrido processo de peletização
(BERCHIERI JUNIOR. et al., 1984). Segundo Gama (2001), com a peletização da
ração a uma temperatura superior a 60º C pode ocorrer a eliminação da Salmonella spp.
da ração, desde que não ocorra recontaminação pelo manuseio, por ratos ou insetos. A
porta de entrada da bactéria é geralmente a via oral e ou respiratória (TANNOCK e
SMITH, 1971) e a via vertical (BARROW e LOVELL, 1991).
Os alimentos de origem animal são as principais fontes causadoras de
infecção humana, dentre eles os de origem avícola (OLIVEIRA e SILVA, 2000), em
destaque estão os ovos e seus derivados (RODRIGUE et al.,1990; HUMPHREY,1994),
principalmente o consumo de maionese caseira (DUARTE e SILVA, 2002). A SE pode
infectar um lote de aves e invadir lotes vizinhos sem apresentar nenhum sintoma da
doença. Causar infecção inaparente não limitar-se ao intestino, estendendo-se aos
órgãos internos, incluindo o sistema reprodutivo, com consequente contaminação da
progênie ou de ovos comerciais para consumo humano (PEREIRA et al., 1999).
O primeiro relato de envolvimento de SE com infecção originada do
consumo de alimentos preparados com ovos, ocorreu em 1986 em um surto nos Estados
Unidos, relacionado a uma massa comercial congelada e recheada com uma mistura de
queijo, condimentos esterilizados e ovos crus (SILVA E DUARTE, 2002).
27
horizontal a contaminação de ovos por salmonelas paratíficas pode acontecer por meio
da penetração do patógeno pela casca, quando o ambiente em que as aves estão
inseridas esteja contaminado (CARRIQUE-MAS e DAVIES, 2008). As fezes das
galinhas de postura ao eliminarem Salmonella spp.. Também são consideradas um
importante meio de propagação da bactéria, uma vez que os ovos livres do patógeno ao
entrarem em contato com fezes de galinhas infectadas podem ser contaminados
(BARROW, 1999; GAST, 2003). A contaminação de alimentos por fezes é fonte de
infecção de Salmonella sp. para seres humanos (FORSHELL e WIERUP, 2006).
O agente localizado na vagina se adere à casca, ultrapassando-a e
contaminando o conteúdo interno do ovo (MIYAMOTO et al., 1997). A contaminação
horizontal dentro das incubadoras também é freqüente, ocorrendo a contaminação
externa da casca e consequentemente a penetração da bactéria através dos poros
(BAILEY et al., 1994; CASON et al., 1994).
A contaminação vertical (transovariana) pode ocorrer diretamente na gema
ou albúmen através dos órgãos reprodutivos antes da formação da casca
(SHIVAPRASAD et al., 1990). Tanto a SE como a Salmonella Typhimurium (ST)
possuem um potencial igual para colonizar o tecido do trato reprodutivo e os ovos em
formação no oviduto antes da postura (KELLER et al., 1997). Sorovares de Salmonella
altamente invasivos também podem infectar o trato genital da galinha conduzindo à
contaminação dos ovos que no caso de SP pode persistir por meses (BARROW, 1999).
Trabalhos realizados por Cox et al. (1990) mostraram que 75 % das
amostras de fragmentos dos ovos, pool de material e materiais de papel em incubadoras
comerciais continham Salmonella, indicando muitas oportunidades para a contaminação
de ovos recém incubados.
Em pombos, a Salmonella Typhimurium (juntamente com Streptococcus
gallolyticus) é a doença bacteriana mais importante, sendo os animais silvestres
considerados uma fonte de infecção. Os columbídeos infectados podem tornar
portadores do patógeno e excretar a bactéria de forma intermitente por longos períodos
nas fezes. Embora a infecção em humanos com cepas de Salmonella relacionadas ao
pombo seja rara, estas cepas são capazes de causar doenças graves em camundongos
(PASMANS et al., 2004).
A colonização do patógeno das aves é dose dependente e varia com idade em
que a ave é desafiada. Sabe-se que aves de um dia de idade podem ser colonizadas com
menos do que cinco células de Salmonella e que a colonização em aves mais velhas se
28
dá de forma irregular requerendo doses maiores. Apenas um ovo contaminado com uma
única Salmonella pode substancialmente, contaminar outros ovos e aves em uma
incubadora (BAILEY et al., 1994).
2.2.4 Patogenia
29
Os pombos com salmonelose excretam as bactérias nas fezes, ocorrendo
assim à disseminação horizontal da doença. Estes se infectam pela ingestão do agente
em alimentos, água de beber, comedouros contaminados. Inicialmente a Salmonella
coloniza o trato intestinal do pombo e a partir deste sitio primário de replicação
comumente invade a corrente sanguínea, causando bacteremia. Durante a disseminação
hematógena, a bactéria alcança diferentes tecidos do organismo, tais como pulmões,
fígado, baço, testículos, ovários, cérebro, músculos, olhos, pele e articulações, onde elas
também se multiplicam. A localização da Salmonella nas gônadas, assim como a
contaminação da casca do ovo, pode eventualmente causar a disseminação vertical da
doença (HERDT e PASMANS, 2010).
Os columbídeos podem se recuperar clinicamente da infecção por
Salmonella, tanto de maneira espontânea como após antibioticoterapia. Entretanto,
alguns desses não conseguem eliminar todas as bactérias, tornando-se portadores
assintomáticos. A Salmonella pode sobreviver dentro de diferentes tipos celulares,
como macrófagos, ou dentro de lesões necróticas. Os portadores tem um papel
importante na patogênese da salmonelose de pombos, uma vez que disseminam a
bactéria de forma intermitente, infectando outros pombos. Dessa forma, a salmonelose
se faz cronicamente presente em planteis de pombos (HERDT e PASMANS, 2010).
A replicação da Salmonella geralmente induz lesões e sinais clínicos,
contudo as lesões também podem surgir na ausência das bactérias. Típico a esse respeito
é o aumento acentuado da articulação do cotovelo que pode se desenvolver meses a
anos após a bactéria ser eliminada do plantel. A patogênese desse tipo de lesão é
desconhecida. O fluido obtido dessas articulações contém com frequência uma grande
quantidade de anticorpos contra Salmonella (HERDT e PASMANS, 2010) .
2.2.5 Patologia
30
observado o patógeno nos pulmões provocando uma pneumonia lobular geralmente
grave (SATO, 1997).
Em observações macroscópicas pode ser visível sinais de desidratação,
flacidez da pele, saco da gema coagulado ou não absorvido, presença de congestão do
fígado, rins e baço com presença de pequenos pontos branco-acinzentados de áreas de
necrose, perihepatite, pericardite com aderências, peritonite acompanhada
ocasionalmente por focos necróticos e exsudato caseoso nos cecos (SILVA, 1991).
A infecção pode resultar em gastroenterites, peritonites, hemorragias na
camada serosa, no pericárdio e peritônio com inflamação deste, estando os órgãos
contidos na cavidade abdominal, fígado, baço, intestinos recobertos por uma capa fina
de fibrina, inflamação congestiva da mucosa intestinal, focos de necrose e degeneração
do fígado. Em casos de uma severa doença sistêmica, na maioria dos casos, leva o
hospedeiro à morte (BERCHIERI JUNIOR e BARROW, 1995; VAN IMMERSEEL et
al., 2005).
A pulorose está seguramente relacionada com a idade, nível de
contaminação, linhagem das aves e o manejo. A forma aguda e superaguda ocorrem em
pintos com poucos dias de idade, surgindo após a eclosão, pode evoluir rapidamente e
causar alta mortalidade na segunda semana de vida. Após duas semanas, a mortalidade
pode cessar e as aves podem se recuperar (ROCA, 1991). A mortalidade pode em
alguns casos ser de 25 a 30 %, sendo variável devido ao sistema imune das aves e das
condições de manejo utilizado. Aves mais velhas apresentam pulorose na forma crônica,
sendo observada queda de postura de galinhas e em desenvolvimento lento e irregular
das aves jovens.
Na forma superaguda da pulorose não é observada lesões macroscópicas,
porém na forma aguda há aumento do volume e congestão do fígado, baço e rins. Os
pintos apresentam saco da gema mal absorvido, com conteúdo de consistência cremosa
ou caseosa, nódulos branco-amarelados podem aparecer no trato digestório, músculo
cardíaco, pulmão e pâncreas. O pericárdio se torna espesso com exsudato amarelado ou
fibrinoso. Os cecos poderão conter material caseoso e os órgãos internos congestos com
a presença de líquido viscoso no peritôneo, espessamento da parede intestinal e
exsudato na câmera anterior do olho (BERCHIERI JUNIOR, 2000).
Em aves adultas pode ser observado alterações dos folículos ovarianos
como regressão, aparecimento de folículos císticos, hemorrágicos, atrofiados, de
contorno irregular com material caseoso, hemorrágico ou necrosado em seu interior,
31
peritonite fibrinosa, peri-hepatite e pericardite, também são observadas. Nos machos
podem ocorrer pontos ou nódulos esbranquiçados nos testículos. (BERCHIERI
JUNIOR, 2000).
Em termos microscópicos pode-se citar na forma superaguda uma congestão
vascular em vários órgãos como fígado, baço e rins. Na forma aguda e subaguda há
pontos necróticos no fígado, congestão renal e nos cecos de aves jovens há extensiva
necrose da mucosa e submucosa com o lúmen contendo debris celulares necrosados,
misturado com fibrina e heterófilos (BERCHIERI JUNIOR, 2000). Há serosites no
pericárdio, pleuroperitôneo. Em casos agudos, observam-se lesões heterofílicas e
fibrina, já em estágios mais tardios encontram-se apenas linfócitos, plamócitos e células
histiocíticas. No aparelho reprodutivo, são observados ooforites que resultam em
degeneração folicular.
O tifo aviário causado pela SG é uma enfermidade aguda com curto período
de incubação, sendo a mortalidade altamente variável. Roca (1991) cita que há relatos
de percentual de mortalidade em cerca de 100 %. No mesmo lote, pode haver aves com
o quadro clínico da doença e aves com aspecto normal de saúde. Esta enfermidade
apresenta características septicêmicas e toxêmicas. Há congestão dos órgãos internos e
destruição das hemácias pelo sistema retículo-endotelial com conseguinte anemia.
Confirmada por Deshmukh et al. (2005a), ao realizar uma infecção experimental de SG
associada com à micotoxina Fumonisina B1 em codornas japonesas. Em outra pesquisa,
estes mesmos autores verificaram alta mortalidade nos grupos em que havia a infecção
por Salmonella associada à micotoxinas e, além de altas taxas de anemia no grupo
infectado somente com SG (DESHMUKH et al., 2005b).
Segundo Berchieri Junior (2000) também poderá ocorrer esplenomegalia e
hepatomegalia nos quadros agudos. O fígado torna-se friável com coloração atípica
(esverdeado) com pontos necróticos (esbranquiçados) e hemorrágicos. Podem ser
observados pontos necróticos no coração e no baço e este último apresentar ainda
pontos de hemorragia. Na pulorose pode-se observar um processo inflamatório com
formação de nódulos em diversos órgão, assim como o ovário pode estar atrofiado ou
com os folículos hemorrágicos. Em aves acometidas por salmonelas paratifóides, a
infecção do trato digestório é mais eficaz e persistente nos cecos, reto e inglúvio, nesta
ordem (HARGIS et al., 1995).
32
O paratifo causado pelas demais salmonelas que não sejam a SP e SG, dentre
elas podemos citar a Salmonella Enteritidis, que pode ocasionalmente infectar os vários,
oviduto e conteúdo dosovos (POPPE,1999). Autores como DESMIDT et al. (1997)
afirmam que aves com quatro semanas de idade, podem apresentar infiltrações de
heterófilos, mostrando a tendência de S. Enteritidis se localizar nos ovários podendo
contaminar os ovos e conseqüentemente a progênie e causar também peritonites,
pericardite, onfalite e tiflite com nódulos granulomatos, lesões nos cecos, caracterizando
tiflite com nódulos granulomatosos.
THIAGARAJAN et al. (1994) em trabalhos com poedeiras mostraram que S.
Enteritidis pode colonizar as membranas dos folículos pré-ovulatórios através de
interação com as células da camada granulosa.
A capacidade da Salmonella de replicar em diversos órgãos se reflete na
variedade de lesões encontradas nas aves acometidas. Dependendo do órgão acometido
e da extensão da lesão, diversos sinais clínicos gerais e específicos podem ocorrer de
maneira simultânea ou isolada (HERDT e PASMANS, 2010).
Na salmonelose aguda, lesões intestinais com enterite fibrinosa e ulceração
focal estão presentes constantemente, quando ocorre septicemia, observa-se um
aumento do tamanho dos órgãos internos, causado pela atividade inflamatória de
granulocíticos heterófilos e macrófagos. Clinicamente, essa forma aguda da doença em
geral começa com um único pombo do plantel que se recusa a se alimentar e,
eventualmente, apresenta uma diarreia verde viscosa ou sanguinolenta. Apenas
pequenas quantidades de excreções são produzidas, e estas consistem quase que
exclusivamente em urato de cor esverdeada. Poliúria pode estar presente. Após alguns
dias, o columbídeo acometido morre ou começa a se recuperar. Nesse meio tempo,
outros pombos geralmente começam a desenvolver sinais clínicos similares (HERDT e
PASMANS, 2010).
As lesões agudas dos órgãos podem evoluir para necrose focal e formação
de abcessos e granulomas. Os pombos acometidos com tais lesões apresentam estado
geral ruim, até eventualmente sucumbirem. Quando órgãos específicos estão envolvidos
no percurso da doença, sinais dependentes das lesões podem ocorrer. Artrite nas
articulações das pernas e asas pode resultar em claudicação e inabilidade de voar,
respectivamente. O extenso aumento de volume do cotovelo é quase um sinal
patognomônico, embora a articulação escapulo-umeral e o canalis triosseus também
possam estar envolvidos. A infertilidade e/ou morte embrionária são associadas com a
33
multiplicação da bacteria nas gônadas, e a cegueira pode ser atribuída à panoftalmite por
Salmonella. As lesões dermatológicas incluem pequenos abcessos nas pálpebras ou na
região subcutânea do pescoço, assim como ocasional dermatite exsudativa na face
interna da asa. Esporadicamente, ocorre opistótono quando a infecção está localizada no
cérebro. Os sinais respiratórios não são associados com salmonelose, todavia necrose e
formação de abcessos nos pulmões e sacos aéreos são lesões frequentemente
características (HERDT e PASMANS, 2010).
Os surtos repentinos e patogênicos de salmonelose são observados
exclusivamente em filhotes. Estes que podem ser infectados durante um surto de
salmonelose aguda no plantel ou quando pombos portadores assintomáticos são
utilizados para reprodução, uma vez que os reprodutores podem infectar sua progênie
pela transmissão vertical ou neonatal, resultando na mortalidade em massa dos filhotes
normalmente a partir do quinto dia de vida. Em casos menos agudos os filhotes podem
apresentar crescimento retardado, paralisia e penas que não se desenvolvem. (HERDT e
PASMANS, 2010).
34
Os pintos nascidos de ovos infectados com o tifo aviário podem nascer
moribundos e mesmo mortos após a eclosão dos ovos, outros podem apresentar
sonolência, fraqueza, inapetência, mau crescimento e desenvolvimento, e cloaca com
matéria fecal aderida de coloração esbranquiçada, já em aves adultas, há uma queda
repentina de consumo alimentar, aves tristes e apáticas, cristas pálidas e encolhidas,
com diarreia amarelo – esverdeada (SILVA,1994; NASCIMENTO, 1994 ).
As aves contaminadas por Salmonella paratíficas podem apresentar sinais
clínicos semelhantes àqueles aos observados na pulorose, e no tifo aviário,
especialmente em aves jovens. Há amontoamento próximo à fonte de calor, perda de
apetite e aumento do consumo de água, diarreia aquosa profusa e emplastramento da
cloaca (BERCHIERI JUNIOR e BARROW, 1999). Nos surtos agudos as mortes
iniciam-se no incubatório nos primeiros dias de idade. Entre o sexto e décimo dia a
mortalidade pode atingir 80% e por vezes, na ausência de sinais clínicos, é alto o
número de ovos bicados e não bicados contendo embriões mortos. Em aves adultas é
observada inapetência, queda de postura e diarreia, sendo predispostas a infecção, as
aves submetidas a um estresse como a muda forçada (BERCHIERI JUNIOR, 2000).
Contudo, a doença em aves com mais de quatro semanas, raramente causa mortalidade,
resultando em altos índices percentuais de aves portadoras/excretoras assintomáticas
(SILVA,1994).
Em seres humanos cometidos por salmonelose, os sintomas variam desde
leves sinais como dores abdominais, cólicas, febre, náuseas, vômito e dor de cabeça
assim como apresentar quadro de septicemia, com óbitos em geral restritos a recém-
nascidos, idosos e pessoas imunocomprometidas. (SILVA, 1991).
35
A escolha do procedimento laboratorial adequado é um pré-requisito
essencial para o isolamento de qualquer micro-organismo, pois existem diversos fatores
que podem afetar os resultados de isolamento de Salmonella. Albuquerque et al. (2000)
testaram diferentes meios de cultivo para o isolamento de Salmonella em matérias-
primas, concluíram que para o isolamento de salmonelas, a partir de amostras
naturalmente contaminadas, o caldo de enriquecimento Tetrationato Hajna se mostrou
superior aos caldos Selenito Cistina e Rappaport Vassiliadis , sendo que sua incubação
a 42ºC é vantajosa em relação a 37ºC, e os meios sólidos de plaqueamento em ágar
Verde Brilhante e Xilose Lisina Desoxicolato apresentaram eficiência semelhante. Entre
os exames mais utilizados podemos citar: os testes sorológicos (ELISA, hemaglutinação
rápida em placas) e os meios de cultivo bacteriano (Caldo Tetrationato, Ágar Verde
Brilhante, Ágar de MacConkey, Ágar Salmonella-Shigela, entre outros).
Para o diagnóstico de aves portadoras da pulorose, usa-se o teste de
hemoaglutinação no próprio aviário, usando antígeno de laboratório idôneo controlado
com soros positivos e negativos (Oliveira,1984). O soro e o antígeno devem estar na
mesma temperatura, o resultado é lido depois de misturar uma gota de antígeno e uma
gota de sangue colhido da ave por um período de 1 minuto as reações positivas são as
que apresentarem aglutinação em toda à área da superfície. O teste de soroaglutinação
rápida em placas pode encontrar resultado falso-positivo devido o teste apresentar uma
baixa especificidade e falso-negativo em consequência, também, da baixa sensibilidade
(GAST e BEARD, 1990).
ROCA (1991) cita que pintainhos com SP em fase aguda o patógeno pode
ser isolado a partir de qualquer órgão parenquimatoso. Autores com Berchieri Junior
(2000) enfatizam que os órgãos de eleição para isolamento de Salmonella nos meios de
cultivo são: baço, fígado, coração, ovário, conteúdo intestinal, saco da gema, medula
óssea, pulmão e locais lesionados (articulação-artrite, sacos aéreos-aerossaculite).
Para a identificação do agente do tifo aviário diferenciando-o do agente
causador da pulorose se faz necessário o isolamento e identificação da Salmonella. No
caso do paratifo aviário a produção de H2S é mais intensa e as salmonelas são móveis.
As pesquisas de Salmonella em materiais que podem estar veiculando a bactéria, como
as farinhas de origem animal e ração, iniciam-se com uma etapa anterior ao cultivo em
caldo enriquecido, denominada de pré-enriquecimento. Os caldos de pré –
enriquecimento são água peptonada tamponada, solução de Ringer ¼, caldo lactosado,
entre outros (BERCHIERI JUNIOR, 2000).
36
Os columbídeos que morrem por salmonelose, o agente etiológico pode ser
isolado a partir de órgãos colhidos durante a necropsia. Em animais vivos, o diagnóstico
pode ser confirmado pelo exame bacteriológico das fezes, porém esse método não é
muito seguro para pombos afetados cronicamente, uma vez que eles podem excretar a
bacteria intermitentemente. Desse modo, recomenda-se coletar durante um período de
cinco dias amostras de pool fecal para analise bacteriológica. A Salmonella pode ser
detectada igualmente na inoculação direta na placa de cultura e/ou após enriquecimento
(HERDT e PASMANS, 2010).
Para um diagnóstico rápido de salmonelose, pode ser utilizado o teste de
aglutinação em placa (HERDT e PASMANS, 2010). Neste teste, uma gota de
Salmonella inativada em formaldeído é misturada com uma gota do plasma do pombo
suspeito e colocada sobre placa. A placa é então homogeneizada lentamente por dois
minutos, e uma reação positiva demostrará a presença de anticorpos resultantes da
infecção ou possível vacinação contra salmonelose. Podem ocorrer reações falso-
negativas. E são principalmente os pombos acometidos pela salmonelose aguda com
sinais clínicos graves os que reagem positivamente no teste de aglutinação em placa. Os
cronicamente infectados, assim como os portadores assintomáticos, normalmente
permanecem negativos. O teste de aglutinação em placa também pode ser realizado com
fluidos obtidos das articulações de pombos com artrite.
2.2.8 Controle
37
decréscimo na porcentagem de isolamento em amostras de órgãos após certo período,
contudo a excreção via fezes continuou por longo tempo. Aves infectadas por outros
sorovares como S. Infantis, S. Heidelberg e S. Menstson, também foram capazes de
excretar a bactéria por período de até 41 dias após inoculação. Smith e Tucker (1980)
inocularam ST, SE, S. Senftenberg, S. Oranienburg, S. Montevideo e S. Anatum em
aves adultas e demonstraram que estas excretavam os microrganismos por um período
não muito superior a 15 dias. Autores como Ishola et al. (2009) utilizando uma cepa de
Salmonella Enteritidis em galinhas poedeiras observaram que a maior frequência de
positividade para salmonela nas fezes em cinco semanas de avaliação experimental foi
de 100% e a menor de 40%. Andrade et al . (2007) inoculando Salmonella Enteritidis
em pintos de duas linhagens de corte com um, sete, quatorze e 21 dias pós-eclosão,
observaram que o patógeno invadiu e colonizou o trato gastrintestinal das duas
linhagens, mas a infecção declinou com a idade, sendo mais persistente na linhagem
Ross. O patógeno foi excretado de uma única ave ISA Label até 22 dias de vida e em
quatro aves da linhagem Ross até 35 dias.
O controle da salmonelose é possível, porém difícil. Os programas de
erradicação de plantéis infectados incluem quatro pontos que precisam ser
rigorosamente seguidos: medidas sanitárias, tratamento antimicrobiano, vacinação e
exame bacteriológico das fezes. As medidas sanitárias devem ser realizadas como
primeira medida, e isso inclui a eutanásia de pombos clinicamente doentes, uma vez que
esses animais podem desenvolver lesões crônicas e se tornar portadores assintomáticos.
Pombos valiosos, os quais o proprietário se recusa a sacrificar, devem ser tratados em
quarentena e podem ser reintroduzidos no plantel somente quando for provado estarem
livres de Salmonella pela realização de exames bacteriológicos de amostras fecais.
Medidas sanitárias adicionais incluem a completa limpeza e desinfecção das instalações.
A reprodução deve ser interrompida e a superpopulação evitada. Após as medidas
sanitárias, os pombos restantes devem ser tratados com antibióticos por, no minino 10
dias. In vitro as bactérias são sensíveis a um grande número de antimicrobianos, porém
in vivo os melhores resultados são obtidos com enrofloxacina (200mg/L) ou trimetoprim
(200mg/L) (UYTTEBROEK et al., 1991).
A vacina quando aplicada como medida preventiva, essa não protege os
pombos da colonização por Salmonella, mas reduz a eliminação fecal do agente e limita
os sinais clínicos, incluindo a mortalidade.
38
2.2.9 Imunidade e Vacinação
39
com Salmonella. Ocasionalmente, um pombo morre dentro de 24 horas da vacinação.
Em alguns planteis, grandes nódulos subcutâneos com acúmulo histiocitário do
tipo”corpo estranho” podem se desenvolver no local da injeção de 7 a 10 dias após a
vacinação. Esses granulomas causam dor, anorexia, piora do estado geral e,
eventualmente, a morte. Em casos graves precisam ser removidos cirurgicamente. O
resultado do programa de controle precisa ser monitorado com base na realização
periódica de exames bacteriológicos de amostras de pool fecal, por exemplo, um mês
após o tratamento e, subsequentemente, a cada seis meses e quando houver amostras
positivas, todo o protocolo de tratamento deve ser repetido (HERDT e PASMANS,
2010).
40
3 JUSTIFICATIVA
41
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
42
5 OBJETIVOS
43
6 Capitulo 1
44
Dissemination of Salmonella Enteritidis in Experimentally Infected Pigeon
Teixeira, Elisângela de Souza Lopes, Camila Muniz Cavalcanti, Ricardo José Pimenta
*Corresponding Author. Mailing address: Av. Rogaciano Leite, 200 Aptº 1303 Bl.
Tulipe, Bairro Salinas, Fortaleza, CE, Brasil.; CEP 60810-000.; Phone/Fax: (085) 3241
1307 or 31019848 or 9989 4742.; E-mail: william.maciel@uol.com.br
45
Resumo
46
ABSTRACT
Two groups of domestic pigeons (Columba livia) were experimentally infected orally at
doses of 1.9 x106 and 1.9 x108 cfu/mL (group A and B, respectively) with strain of
Salmonella Enteritidis (SE) isolated from chickens. None of the doses used was capable
of causing mortality in the inoculated birds, however, there has been successful
recovery of the pathogen in the liver and spleen on the 7th day of post-inoculation (dpi).
The elimination of the pathogen often ascertained through cloacal swabs revealed that
the shedding occurred in both groups until the 14th day of observation (p <0.05). Among
all the stool samples collected in group B (n=4), three different birds eliminated the
pathogen in their feces, but two on the 3rd dpi and one in the 7th dpi. The same number
of stool samples was evaluated in group A and only one bird eliminated the pathogen,
on the 7th and 14th dpi, and the concentration of micro-organism in the feces was lower
than any sample from Group B. Despite the low SE frequency in organs and stool, as
well as the small number of pigeons with quantifiable bacteria in feces during the study
period, it is clear that these birds, when infected, can shed Salmonella Enteritidis strain
not adapted to their species.
47
INTRODUCTION
48
different inoculum concentration of Salmonella Enteritidis: Group A (low dose) and
Group B (high dose). In these groups we analyzed: the SE concentration of elimination
in feces and in organs, frequency of positive swabs, organs and feces samples. The
inoculation and evaluation of the concentration of Salmonella Enteritidis in organs and
feces was performed according to the methodology adopted by Oliveira et al.(24).
Inoculum Preparation
We prepared a broth containing a Salmonella Enteritidis strain resistant to
nalidixic acid (SENalr) incubated overnight at a temperature of 37 ° C. The birds in
group A received 1 mL of inoculum obtained from culture SENalr diluted by a factor of
about 10-7 containing 1.9x108 colony forming units / mL (cfu/ mL) and group B’s
culture was diluted by a factor of 10-5, containing approximately 1.9 x 106 cfu / mL.
Microbiological Evaluations
On the 3rd, 7th, 14th, 21st, 28th and 35th day post-inoculation (dpi), stool samples
were collected from each cage, four birds from each group were euthanized with spleen
and liver collected for analysis of cfus and frequency of positive SENalr. For the first
step, organs were individually homogenized and diluted in decimal series (1:10) in PBS.
The dilutions were plated on brilliant green agar (Oxoid CM265) containing nalidixic
acid (25 mg / mL) and novobiocin (2 mg / mL) (BGNNov). The plates were incubated
overnight at 42 ° C and the CFU / mL were transformed into log10 for analysis
characterizing the first step. In the second stage, a part from the remaining macerated
organ samples were removed and incubated in selenite broth (CM395 Oxoid.) with
novobiocin (40 mg / L) overnight at 42 ° C, and then were plated in BGNNov and
incubated at 42 ° C for 24 hours to enhance the potential Salmonella growth in the
organs, if the CFUs counting was not possible. The methodology used for the stool
samples was the same as the cited for the first stage of organ samples. Also, two
samples of cloacal swabs were collected per week, and the methodology for the second
stage of organ samples was used again. Before starting the experiment all birds were
inspected according to Zancan et al. (32) to confirm that they were free of Salmonella.
Statistical Analysis
The results of the swabs and stool frequencies from both groups were compared
using the χ2 test with significance p <0.05.
49
RESULTS AND DISCUSSION
During the experiment, there was no mortality in birds. Corroborating Ishola
(20), who used a SE strain previously isolated from chickens and inoculated two
different doses (1,3x104 and 1,3x108 cfu) in chickens 33 weeks of age, not reporting any
mortality. Unlike the findings of Gorham (16), because they isolated a strain of SE from
chicken environment and inoculated (1 X 107 cfu) in chicks from one to seven days old,
and reported a mortality of 11/53 (21%) in one-day-old chicks, of which two in 2 days
post-inoculation (dpi), three in 3 dpi, two in 4 dpi, three in 6 dpi and one at 7 dpi, and in
the group of 7-day-old birds sustained a 2 / 28 (7%) mortality, of which one died in 4
dpi and the other at 7 dpi. The use of a strain not adapted to pigeons may be the
responsible for the absent mortality in the inoculated birds, since S. Enteritidis seems to
evolve and acquire strategies to resist and overcome the host innate immune defenses
(4,13).
Table 01 presents the results concerning the number of Salmonella Enteritidis isolated
from liver and spleen samples of inoculated pigeons.
Table 1. Viable number (log10) of Salmonella organisms per gram of sample after any time post
infection.
Viable number (log10) of Salmonella organisms per gram of sample after any time post infection
Pigeon No L S L S L S L S L S L S
1 - - - - - - - - - - - -
2 - - - - - - - - - - - -
3 - - - - - - - - - - - -
4 - - - - - - - - - - - -
5 - - + - - - - - - - - -
6 - - - - - - - - - - - -
7 - - + + - - - - - - - -
8 - - + + - - - - - - - -
L: líver, S: Spleen;
50
Group A: Birds 1-4: inoculated with 1mL of diluted broth overnight 10 -3 (1,9 x 106 cfu / mL); Group B:
birds 5-8: inoculated with 1mL of diluted broth overnight 10 -7 (1,9 x 108 cfu / mL);
We noted that in the concentration of organ’s SENalr evaluation stage, there was
no bacterial growth and therefore the colony-forming units in the spleen and liver of
both groups could not be quantified. However, we did recover the organs’ SENalr
submitted to enrichment in Selenite Cystine with subsequent plating on BGNNov,
which shows that there was bacterial invasion in the liver and spleen, although greatly
reduced. Gast et al. (14) reported that both the frequency of microbial invasion and the
recovery of the number of pathogen cells in the liver can vary significantly depending
on the exposure dose administered. For the period of time required for the pathogen to
colonize the spleen and liver of pigeons, our results show that the recovery occurred
only in the 7th dpi, which differs from those of He et al. (19), whom testing in hens
found that Salmonella invasion from intestinal tract to internal organs such as liver and
spleen, occurred within a few hours after the initial oral exposure. Other studies may
explain this divergence that occurred when compared to the results obtained in pigeons.
Oliveira et al.(24) in his study showed that hens inoculated orally with a lower dose of
Salmonella (8.5 x 105 cfu / mL) presented the pathogen in the liver and spleen only in
the seventh day dpi, while birds inoculated with the highest concentration (8.5 x 108)
already did on the third dpi. This shows that both the concentrations used in pigeons
were not sufficient to promote invasion in the liver and spleen by the pathogen on the
third dpi.
Another consequence that occurred due to the dosage administered was the non-
detection of the pathogen in the liver or spleen beyond the fourteenth dpi. Both appear
to be relatively low dosages if the objective is to detect the pathogen throughout the
experiment, even when using a strain not adapted to pigeons. The literature shows that
strains not adapted to certain bird species may behave differently even using a dose
close to that used in this work. Ribeiro et al. (27) injected two doses (1.2 x105 and 1.2
x108) of a Salmonella Kottbus strain isolated from ducks in one-day-old chicks, and
analyzed the presence of the pathogen in the liver and spleen in the 15th and 42nd dpi,
but they also noted that the lower dose group had lower results compared to the group
with the highest inoculum. Another explanation to the findings in the organs’ SENarl
51
with reduced time seems to be the pathogenicity of the strain, so as this strain may not
be so virulent for pigeons. According to Barrow et al., (5) virulent strains, after their
multiplication, spread to the organs producing a systemic infection.
Table 2. Absolute (n) and relative (%) frequencies of positive swabs for
1,9x106 1,9x108
n (%) n (%)
Table 2 presents the absolute (n) and relative (%) frequencies of positive swabs
for Salmonella sp. in the post-inoculation period. By analyzing the frequency of cloacal
swabs of the two groups of pigeons, we found that pathogen excretion occurred up to
the 14th dpi, the results showed that in group B (1.9 x108 cfu/ mL) the frequency of
bacteria excretion was significantly higher (p <0.05) when compared to group A (1.9 x
106 cfu / mL) only on 3rd and 7th dpi. The use of a strain not adapted to pigeons also
seems to have influenced the low frequency of Salmonella in samples obtained from
cloacal swabs. The use of strains adapted to the species can result in higher rates of
fecal excretion. Ishola et al. (20) inoculated adapted strains in laying hens (10-8 cfu) and
found that the greater frequency of positive results for Salmonella in feces within five
weeks of experimental evaluation was 100% and the lower was 40%. The absence of
major findings with swabs in our work appears to be due to false negatives. Authors
such as Gast (12) highlighted this possibility in the results with paratyphoid infections
when working with chickens reported the possibility of sub-clinical infection where the
infected chickens continued harboring the bacteria in their bodies and feces excreting it
in a variable period of time. Which requires Salmonella control programs to be more
52
effective, not only by adopting the method of cloacal swab incubation as a determinant,
but also by increasing the quantity of samples and the frequency of these collections in
such cases, in order to know the real state of the birds (22).
Table 3 Presents the recovery rates of Salmonella Enteritidis in feces of pigeons
post-inoculation (cfu/g).
Table 3. Recovery of Salmonella Enteritidis in feces of pigeons post-inoculation (cfu/g)
3rd dpi 7th dpi 14th dpi 21st dpi 28th dpi 35th dpi
2 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0
10 0 3x102 4x103 0 0 0
16 0 0 0 0 0 0
18 0 2x105 0 0 0 0
19 3,8x105 0 0 0 0 0
23 4x107 0 0 0 0 0
Group A: cages 2, 5, 7 and 10: pigeons inoculated with 1mL of a diluted broth overnight 10-3 (1,9 x 106 ufc /
mL); Group B: cages 16, 18, 19 and 23: pigeons inoculated with 1mL of diluted broth overnight 10-7 (1,9 x 108
cfu / mL)
53
the excretion in feces and detection of the pathogen is carried out by incubation of feces
or cloacal swabs.
Because it is a strain not adapted to the experimental species used, the doses
administered in this study do not appear sufficient to generate a greater systemic
dissemination, as no bird presented excretion in greater quantity or frequency
considering all the pigeons assessed. Gast (12) stated that inoculated chickens and
turkeys can excrete in the first two weeks after experimental oral infection and
paratyphoid Salmonella can be isolated from the intestinal tract, however, there may be
a high percentage of null contaminated feces.
The short period of pathogen excretion in feces of pigeons can be justified
possibly by the not colonization of the intestine or just a temporary occurrence of the
pathogen in the intestinal tract (6). Another hypothesis for the decline in the frequency
of SENalr excretion in the feces of pigeons seems to be an indication that the birds were
able to reduce the level of systemic infection, probably through a humoral immune
response. (18, 22). However, even if it is a small amount of contaminated feces,
González-Acunã et al.,(15), argued that the dried and fresh pigeon stool pose a high risk
of transmitting to humans, particularly children, elderly, or individuals
immunocompromised, as well as domestic animals.
The doses administrated in pigeons, although relatively low considering the
results found in the organs, cloacal swabs and feces along the 35 dpi, show that these
birds can excrete Salmonella Enteritidis strain not adapted to their species. Since the birds
have access to rural and urban settings, there is the possibility that these birds invade
industrial sheds, defecate on the poultry litter and cause major economic losses and
public health. Experiments with chickens on the litter, showed that reinfection may play a
more important role in the persistence of the infection (7, 11).
ACKNOWLEDGMENTS
We acknowledge the National Council of research and technology development
(CNPq) and the Laboratory of Ornithological Studies (LABEO/FAVET/UECE) for their
support to this study.
54
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