Trabajo de: Gorky Vladimir Lajones Ruano

Tarea de elaboración de primers Forward y Reverse

ANALIZAR EL ALINEAMIENTO DE LAS PROTEINAS Y DISEÑAR UN JUEGO DE
PRIMERS Forward y Reverse degenerados para la amplificación de una región del
gen.

Luego de analizar la secuencia de proteínas.

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Ingresamos a la página: https://www.idtdna.com/calc/analyzer

Damos clic en la primera opción

Nos aparecerá directamente la página IDT en la herramienta “Oligo Analizer 3.1”

He ingresamos la secuencia a analizar en este caso nuestro forward.

Se introducen los parámetros como concentración

de: Oligos, Na+, Mg+, dNTPs
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Secuencia de nucleótidos
aquí

Luego de ingresar nuestra secuencia

Ingresamos los siguientes parámetros
Concentración de Oligos: 0.60 uM
Na+ conc.: 50mM
Mg++ conc: 1.5mM
dNTPs: 0.2mM

En este lado están todos los análisis que podemos

Secuencia de nucleótidos Forward
hacerle a nuestro primer: Analizar, Hairpin, Dímeros,
Hetero dímeros, NCBI, Tm mismatch.

Forward
Resultados del análisis
Nos muestran los siguientes aspectos que demuestran que nuestro primer este acto
para esta secuencia:
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 Posee 20 nt
 Contiene 40% de G,C
 Una temperatura media de : 56.2 ºC - 60.1 ºC -64.5 ºC
 Peso molecular de 6218.6 g/mol
 Coeficiente de extinción de 213050 L/(mole·cm)
 nmole/OD260: 4.69
 µg/OD260: 29.19

Resultados

Se obtuvo un forward: se encuentra sombreado con celeste.

N-W-D-D-M-E-K
2*1*2*2*1*2*1
Su secuencia de nucleótidos de ADN, del primer
5´AAY-TGG-GAY-GAY-ATG-GAM-AA 3´ Forward
5´TTK-TCC-ATR-TCR-TCC-CAR-TT 3´ COMPLEMENTARIA
Posee 16° de degradación lo cual nos deja con 16 combinaciones posibles
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Resultados de Hairpin

Damos click en Hairpin

Luego saldrá una pantalla con los datos generales y las estructuras q se pueden
formar

Esta es la figura 1 en la cual se puede ver que:

 Su Tm -271 °C
 ΔG(kcal.mole-1) es de 3.6

Es muy probable que estos no se formen en este primer pues las

temperaturas a usarse no serán tan bajas.
En la figura 2 se puede ver que:

 Su Tm es -592

 ΔG(kcal.mole-1) es de 3.6
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Aquí vemos información del primer como:

Max Foldings: 20

Análisis de homo dímeros

Damos click en self- Dimer

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En estos cuadros se ven varios homodímeros

Las siguientes imágenes fueron divididas en varias partes o literales para su mejor
comprensión
A. En esta se puede observar un dímero del delta G que tiene dimerización en 4
pares de bases en los extremos 5´, este primer se puede enviar a diseñar pues
su dimerización no afectara a la polimerización de la cadena pues el lado más
importante para esta es el 3´, esto quiere decir que en un casa se podría enviar
aun cuando solo se produce con una cantidad de energía de -5.12 kcal/mol.
B. Este dímero es más estable que el anterior pero también se puede enviar a
diseñar pues las dimerización está en la parte interna aunque también hay la
posibilidad que se una en los lados 3´ y esto si sería un problema aunque la
posibilidad sería mínima para que funcione pues se forman con muy poca
cantidad de energía de -4.89 kcal/mol.
C. Este es muy inestable pues se pueden unir G y C en los extremos 3´y 5´ a un
poco energía de -4.19 kcal/mol esto nos indica que su formación es rápida no
tanto como la anteriores pero rápida.
D. Este igual que el anterior está comprometido en los lados 3´y 5´ lo cual no nos
permitiría trabajar con ellos.
E. Este dímero es el mucho menos probable que se de en comparación a los
anteriores pero si se podría enviar a diseñar pues el mayor a -6 kcal/mol estaría
dentro del estándar por q su dimerización es interna y no interfiere al terminal 3´
F. Este se encuentra comprometiendo un lado 3´ por lo cual queda descartado
pues es menor a -2 kcal/mol.
G. Este es uno de los más aceptables con el cual se puede trabajar pues su energía
es mayor a -2 kcal/mol y no interfiere en los lados 3´ pues es interno.
H. Este se encuentra comprometiendo a un terminal de la cadena 3´ esto genera
inestabilidad por lo cual a pesar de necesitar una energía alta para formarse no
es recomendable hacerlo pues de darse no permitiría la polimerización de un
lado.
I. Este entra en el mismo rango del anterior pues compromete un terminal 3´.
J. Este es uno de los cuales se puede utilizar pues tiene una energía de -1.47
kcal/mol y sol interfiere en el lado interno de uno y el 5´de otro.
K. Estos tienen un mayor grado de estabilidad y se puede utilizar esto mismo aplica
para el L y el M.
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SEQUENCE

COMPLEMENT
B

SEQUENCE

COMPLEMENT

SEQUENCE
D
COMPLEMENT
SEQUENCE
E
COMPLEMENT
SEQUENCE

FCOMPLEMENT

SEQUENCE

COMPLEMENT
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Aquí se puede observar un primer

correcto pues dímeros > - 2kcal/mol
este posee -1.95 kcal/mol

SEQUENCE
H
COMPLEMENT

SEQUENCE
I
COMPLEMENT
SEQUENCE
J
COMPLEMENT
SEQUENCE

COMPLEMENT
K

SEQUENCE
L
COMPLEMENT
SEQUENCE
M
COMPLEMENT
SEQUENCE

COMPLEMENT
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REVERSE

Secuencia de nucleótidos Reverse

Damos analizar

Resultados del análisis

Nos muestran los siguientes aspectos que demuestran que nuestro primer este acto
para esta secuencia a pesar de que estamos en el límite:
 Posee 18 nt
 Contiene 30.6% de G,C
 Una temperatura media de : 52 ºC - 54 ºC -56.5 ºC
 Peso molecular de 5557.7 g/mole
 Coeficiente de extinción de 195850 L/(mole·cm)
 nmole/OD260: 5.11
 µg/OD260: 28.38

Resultados

Se obtuvo un Reverse: se encuentra sombreado con celeste.

Se le aplico Iosina debido a que tiene 4 grados de degradación y esto mejorara su
adición al lado 5´.
M-Q-K-E-I-T
1-2- -2-3-1
Su secuencia de nucleótidos de ADN, del primer
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5´ICA-TTA-RAG-RAA-RAC-GTA 3´ REVERSE

5´TAC-GTY-TTY-CTY-TAA-TGC 3´ COMPLEMENTARIA

Posee 24° de degradación lo cual nos deja con 24 combinaciones posibles

Hairpin

Damos Hairpin

Luego saldrá una pantalla con los datos generales y las estructuras q se pueden
formar

Esta es la figura 1 en la cual se puede ver que:

 Su Tm -24.9 °C
 ΔG(kcal.mole-1) es de 1.73
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Aquí podemos ver información sobre nuestro Reverse

Homo- dímeros del Reverse

Damos self-Dimer

Esta sección igual se ha dividido en literales

A. Este dímero está comprometiendo el lado 3´ con 4 bp lo cual no es
muy bueno y este es demasiado inestable para trabajarlo ya que se da
con baja energía - 6.3kcal/mol.
B. Este es más aceptable pues se unen en el 5´ pero son enlaces de T y
A los cuales fácilmente se pueden romper así que en una maniobra
arriesgada podríamos usarlos.
C. También se puede utilizar y su energía es -1.96 kcal/mol es mayor a
lo pedido > a – 2 kcal/mol.
D. Esta también se puede utilizar su energía es mayor al anterior
disminuyendo la probabilidad de que se dé y de darse es solo de (T y
A), que al aumentar la temperatura evitaríamos su unión.
E. También es muy válido pues tiene las mismas condiciones que el
anterior
F. Aceptable por sus condiciones
Tienen condiciones aceptables
G. Aceptable por sus condiciones
H. Aceptable como son mayores a – 2kcal/mol y
I. Aceptable no comprometen a los lados 3´
J. Aceptable
K. Es posible correr el
riesgo arriesgarse El problema con estos dos a pesar de tener una necesidad
L. Es posible correr el energética muy alta de -0.96, estos están comprometiendo
riesgo arriesgarse los lados 3´ lo cual podría generar algunos problemas a la
hora de la polimerización. Pero se puede utilizar
Trabajo de: Gorky Vladimir Lajones Ruano

SEQUENCE
B
COMPLEMENT
SEQUENCE
C
COMPLEMENT
SEQUENCE
D
COMPLEMENT
SEQUENCE
E
COMPLEMENT
SEQUENCE

COMPLEMENT
F

SEQUENCE
G
COMPLEMENT
SEQUENCE
H
COMPLEMENT
SEQUENCE
I
COMPLEMENT
SEQUENCE
J
COMPLEMENT
SEQUENCE
K
COMPLEMENT
LSEQUENCE
COMPLEMENT
SEQUENCE

COMPLEMENT
Trabajo de: Gorky Vladimir Lajones Ruano

Hetero dímeros

Damos click en Homo- Dimer

Ingresamos nuestro Reverse

Y damos click en calcular

Análisis de los Hetero dímeros

Se la dividió en literales para facilitar su análisis
A. El primero está dentro del rango aceptable >-6kcal/mol aunque sería
arriesgado pues posee un C y G en el extremo 5´.
B. Este es no utilizable pues está comprometiendo al extremo 3´ con una
G esto puede darnos algunos problemas.
C. Tiene las condiciones del anterior pues este tiene una guanina en el
lado 5´.
D. Con este vale la pena correr el riesgo pues su dimerización está hecha
en el lado 5´y esta no afectara la polimerización además se puede jugar
un poco con la temperatura y romper los enlaces de A y T.
E. Este debido a su alta cantidad de energía es poco probable que se dé
además esto pues su energía es > a -2kcal/mol y está en el lado 5´.
F. Es valido
G. Es valido
H. Es valido Esta son aceptables por su
I. Es valido cantidad de kcal/mol que es
J. Es valido mayor a – 2 y es poco probable
K. Es valido que suceda se pueden utilizar sin
L. Es valido ningún problema
M. Es valido
N. Es valido
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SEQUENCE
B
COMPLEMENT
SEQUENCE
C
COMPLEMENT
SEQUENCE
D
COMPLEMENT
SEQUENCE

COMPLEMENT

SEQUENCE
F
COMPLEMENT
SEQUENCE
G
COMPLEMENT
SEQUENCE
H
COMPLEMENT
SEQUENCE
I
COMPLEMENT
SEQUENCE

COMPLEMENT
J

SEQUENCE
K
COMPLEMENT
SEQUENCE
L
COMPLEMENT
SEQUENCE
M
COMPLEMENT
SEQUENCE

COMPLEMENT
Trabajo de: Gorky Vladimir Lajones Ruano

Conclusiones

 El mayor contenido Mg++ aumenta la temperatura de melting del primer y

ayuda a aumentar su especificidad siempre y cuando no se exceda la cantidad
a niveles muy altos pues esto bajaría la fidelidad del primer.
 Los primers seleccionados no deben tener en su lado 3´más de una G o C por
q de lo contrario se unirán fuertemente a cualquier lado que tenga G o C.
 La temperatura a la que se establecen los Hairpin debe ser por lo menos 50°c
– a la Tm del primer o por lo menos tener una buena distancia para evitar malos
apareamientos del primer
 En lo posible es mejor evitar los mismatch en el lado 3´ por q este es el lado
donde se inicia la polimerización y debe estar bien unido a la cadena
 La temperatura de alineamiento debe ser – 4°C que la Tm
 Los primers no deben tener más de 5°C entre ellos (Forward-Reverse)

El tamaño del amplicon esperado es de 228 bp.

Utilizando este forward y reverse
5´AAY-TGG-GAY-GAY-ATG-GAM-AA 3´
5´ICA-TTA-RAG-RAA-RAC-GTA 3´