Informe de microbiología no.

3
Cinética de crecimiento microbiano
Delgado Lyannea y Andrade Andrésb

Liandelgado29@hotmail.com y andresf.andrade1998@hotmail.com

Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales, a y bPrograma de Química con énfasis en bioquímica,
laboratorio microbiología industrial. Santiago de Cali, Marzo 10 de 2018

RESUMEN
La necesidad de establecer metodologías para monitorizar el crecimiento microbiano con el fin de aplicar
medidas que maximicen la productividad en los procesos industriales, se llevan a cabo con el estudio del
comportamiento cinético de los microorganismos de interés y se establecen los tiempos de latencia y
generación, así como su velocidad de crecimiento. La curva del crecimiento microbiano representa la
evolución del número de número de células viables presente en un cultivo microbiano líquido a lo largo del
tiempo de estudio. En este artículo se estudia la cinética de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en un
medio de cultivo estándar, a partir de los resultados obtenidos se obtuvo una tasa de crecimiento de 0.0533
h-1 y un tiempo de duplicación de 13.0 h.

1. INTRODUCCION
La cinética de crecimiento microbiano, es decir, la relación entre la tasa de crecimiento específica (μ) de
una población microbiana y la (s) concentración (es) de sustrato, es una herramienta indispensable en todos
los campos de la microbiología, ya sea fisiología, genética, ecología o biotecnología, y por lo tanto, es una
parte importante de la enseñanza básica de la microbiología. Aunado a lo anterior, se debe tener en cuenta
que el crecimiento bacteriano es un proceso complejo que implica numerosos procesos anabólicos (síntesis
de constituyentes celulares y metabolitos) y catabólicos (descomposición de constituyentes celulares y
metabolitos) que en última instancia dan como resultado la división celular (Maier, 2009).
Por lo general, para comprender y definir el crecimiento de un particular aislante microbiano, las células se
colocan en un medio líquido en el que los nutrientes y las condiciones ambientales son controladas. Si el
medio suministra todos los nutrientes requeridos para el crecimiento y los parámetros ambientales son
óptimos, el aumento en los números o masa bacteriana se puede medir como una función de tiempo para
obtener una curva de crecimiento. En esta curva se pueden observar distintas fases de crecimiento que
incluyen una fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. Cada de estas fases
representa un período distinto de crecimiento que se asocia con cambios fisiológicos típicos en la célula.
1.1. Fases del crecimiento

1.1.1. Fase de latencia

La primera fase observada bajo condiciones de lote se caracteriza por que la tasa de crecimiento es
esencialmente cero lo que se debe a la adaptación fisiológica de la célula a las condiciones de cultivo (Yates
y Smotzer, 2007). , existe una fase de adaptación al medio de cultivo en la cual el microorganismo no se
reproduce, sino que se dedica a producir la maquinaria enzimática que necesita para degradar el sustrato en
el que se encuentra y crecer (fase lag)
Formatted: Footer
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 2

1.1.2. Fase exponencial

Una vez las células se han adaptado a su nuevo ambiente, ellas empiezan a duplicarse y a crecer
exponencialmente, en esta etapa el crecimiento ocurre a velocidad específica (µ) máxima y constante = µm.
Esta tasa de crecimiento es proporcional al número de células presentes en cualquier momento en particular.
Al final de esta fase se alcanza la máxima concentración microbiana.
1.1.3. Fase estacionaria
Posteriormente a la fase exponencial, hay un rápido período de desaceleración donde µ → 0 y se entra en
la fase estacionaria la cual es causada por agotamiento de algún nutriente (el sustrato limitante) o bien por
acumulación de inhibidores. En un cultivo por lotes esta fase se puede definir como un estado de
crecimiento neto igual a cero.
1.1.4. Fase de la Muerte
La fase final de la curva de crecimiento es la fase de muerte, que se caracteriza por una pérdida neta de
células cultivables. Incluso en la fase de muerte puede haber células individuales que se metabolizan y se
dividen. Finalmente se llega a una última etapa donde la concentración de biomasa disminuye por autolisis
o como consecuencia del metabolismo endógeno.

Figura 1. Curva de crecimiento típica para cultivo bacteriano.

1.2. Cultivo en Batch.

La evolución del cultivo en el tiempo, sigue una curva típica la cual recibe el nombre de “curva de
crecimiento en batch”. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden separarse en las cuatro fases
previamente mencionadas (Fase lag, exponencial, estacionaria y muerte). La duración de cada una de estas
fases es función del microorganismo en estudio y de la composición del medio de cultivo. En particular la
fase lag depende además de la fase de crecimiento en que se encuentran las células en el momento de ser
sembradas y de la composición del medio de cultivo en que fueron crecidas. Si éste es igual a la composición
del medio en que se van a sembrar y las células están en fase exponencial, la duración de la fase lag, en
general se acorta y puede llegar a desaparecer, lo cual es deseable ya que constituye tiempo perdido. 1
1.2.1. Descripción matemática del cultivo en Batch.
La descripción matemática (modelado) de las cuatro fases descriptas es sumamente compleja y escapa a los
fines de esta guía, por lo que sólo veremos una más simple que sólo contempla la fase exponencial y la
estacionaria. De la definición de µ obtenemos

rx = µ . x (1)
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 3

Donde x = concentración de biomasa. Hemos visto que µ varía durante el cultivo, siendo un valor constante
y máximo en la fase exponencial (µm) y nulo en la estacionaria. Monod ha propuesto una relación muy
simple entre el valor de µ y la concentración de sustrato limitante, S, entendiéndose por éste al componente
del medio de cultivo que esté en menor proporción respecto de las necesidades del microorganismo. Por
tanto, S puede ser la fuente de N, de C, algún aminoácido, etc. La ecuación es:
µ = µm S /K S +S (2)

Por otra parte se puede definir el tiempo de duplicación (Td) el cual es el tiempo necesario para que a partir
de una célula se formen dos (para que una célula se duplique). La ecuación que define a Td se expresa
como:

𝐿𝑛2
𝑇𝑑 = (3)
µ

1.2.2. Aplicaciones y ventajas de las fermentaciones en Batch

El crecimiento en fermentadores continuos es a veces preferido para procesos industriales puesto que estos
permiten la obtención del producto de manera constante y permite operar en periodos largos teniendo
tiempos muertos bajos. Sin embargo, el cultivo continuo puede presentar algunas desventajas sobre el
cultivo por lotes, entre estas desventajas se encuentra el alto costo de los equipos y accesorios utilizados en
los procesos continuos, por otra parte, los fermentadores industriales utilizados para estos procesos son
sistemas abiertos, los cuales se encuentran expuestos constantemente a contaminantes, por lo que se debe
realizar una constante purificación del producto 2. Durante las fermentaciones en Batch las condiciones
cambian constantemente, particularmente las concentraciones de los nutrientes y productos. Por lo tanto,
nunca se alcanza un estado estacionario en una sola fase, bien sea la fase lag o fase estacionaria. En estos
procesos se deben realizar distintas etapas como cargar el fermentador con medio fresco, esterilizarlo,
inocularlo, realizar la producción, recolectar la biomasa y por último limpiar el recipiente. Esto tiene un
impacto económico puesto que en un periodo considerable de tiempo, el fermentador no está produciendo
productos microbianos, sino que se está limpiando, llenando, etc. Siendo este un tiempo muerto. 3 En casos
específicos se ha utilizado el cultivo en batch para Antrodia camphorata para la síntesis de exopolisacáridos
puesto que permite obtener mayores pesos moleculares con mejor rendimiento que en los procesos
continuos.4

1.3. Melaza de la caña de azúcar.

1.3.1. Descripción
La caña de azúcar es una gramínea tropical cuyo jugo es rico en sacarosa, y que al ser extraído y cristalizado
forma azúcar. Sin embargo, no es posible cristalizar todo el jugo de la caña, sino que una parte de ella queda
en forma de miel o melaza (Aguilar et al., 2015). Este líquido denso y viscoso de color oscuro se utiliza
generalmente para la producción de alimentos concentrados para animales y como suplemento alimenticio
dietario de consume humano (Fajardo y Sarmiento, 2007).

1.3.2. Características físico-químicas de la melaza.

La melaza posee un 3 % de proteínas, 60 – 63% sacarosa, 3 – 5% de azúcares reductores, 0.4 % de grasas,
9% de cenizas y un 16% de agua. Esta proporción puede variar dependiendo del tipo de melaza, algunas
pueden tener una composición de azúcares fermentables del 40%. Los nutrientes de la melaza pueden ser
aprovechados para la producción de biomasa, siendo las levaduras uno de los microorganismos de gran
importancia en la actualidad por su capacidad de sintetizar algunas vitaminas, grasas y proteínas a partir de
azucares simples (Pérez, 2011).
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 4

La melaza constituye una matriz compleja que contiene sacarosa, azucares invertidas, sales y otros
compuestos. Además de la sacarosa, glucosa, fructosa y rafinosa, los cuales son azucares fermentables, las
melazas también contienen sustancias reductoras no fermentables. Por ejemplo, compuestos no
fermentables del cobre, son principalmente caramelos libres de nitrógeno producidos por el calentamiento
requerido por el proceso de cristalización de azúcar y las melanoidinas derivadas a partir de condensación
de azúcar y amino compuestos (Honig, 1974).

Las melazas comerciales usan comúnmente la escala Brix como indicador de la gravedad específica y como
una aproximación al contenido de sólidos totales. La escala Brix mide la gravedad específica de un líquido
en relación con una solución de azúcar (sacarosa) en agua; en otras palabras, es el contenido de azúcar en
una solución de azúcar que tiene la misma gravedad específica del líquido de interés. Así, una melaza de
80º Brix tiene una gravedad específica de 1.416, la cual es la misma de una solución de sacarosa en agua
que contiene 80% en peso de sacarosa. Es necesario aclarar que la escala Brix no mide la concentración
real de azúcares o de sólidos totales en las melazas.

1.3.3. Evaluación de la melaza de caña como sustrato para la producción de Saccharomyces cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae requiere elementos básicos nutricionales como carbono, hidrógeno, oxígeno,
nitrógeno y fósforo. Por otra parte, también requiere de otros elementos igual de importantes, los cuales se
pueden determinar por su composición (Tabla 1 y 2). La melaza de caña puede suplir con muchos de estos
nutrientes requeridos por la levadura, puesto que en el proceso de extracción del azúcar de la caña se añaden
sales inorgánicas que finalmente quedan en la melaza (Fajardo y Sarmiento, 2007). A pesar de esto, la
melaza no es una fuente rica en fósforo y nitrógeno accesible a las levaduras, por lo que se añaden en forma
de sales inorgánicas para la producción industrial de S. cerevisiae.

Tabla 1. Composición de materia seca de la levadura. Tomado de (Fajardo y Sarmiento, 2007).

Componentes Porcentaje (%)

Ceniza 7
Carbohidratos 43
Proteína 48
Grasa 2

Tabla 1. Composición de Mg, P, Ca, Mn, Fe, Cu, y Zn en Saccharomyces cerevisiae. Tomado
de Groombridge et. al.5

1.4. Factores a tener en cuenta para el crecimiento y desarrollo de la levadura

 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 5

1.4.1. Presión osmótica

La nutrición de la levadura es un proceso puramente osmótico, es importante evitar medios hipertónicos o
hipotónicos para evitar la plasmoptisis y plasmólisis. El estrés osmótico puede causar una disminución en
el volumen celular, afecta además, la velocidad de fermentación, así como la viabilidad celular.
1.4.2. Temperatura
Las altas temperaturas ocasionan una disminución de la biomasa, producto de un descenso en el contenido
de proteínas, RNA; DNA y aminoácidos libres e induce a la rigidez de la membrana celular. Temperaturas
muy bajas provocan un estado de latencia en la célula, deteniendo su desarrollo (Tomasso, 2004).
1.4.3. Desecación
Es uno de los principales agentes que inhiben las actividades y desarrollo de los microorganismos.
1.4.4. Luz
En general la luz es perjudicial para los microorganismos que carecen de clorofila, o cualquier otro
pigmento que les permita usar la energía de las radiaciones en el proceso de fotosíntesis.
1.4.5. pH
El pH óptimo en el cual se desarrollan mejor los microorganismos, está entre 4 y 5. Las levaduras tienen la
ventaja de soportar, medios más ácidos, que otros microorganismos, lo que es aprovechado en los procesos
industriales para mantener el medio controlado de bacterias que puedan competir por el sustrato (Beltran et
al., 2002).
1.4.6. Alcohol
El efecto del etanol en la célula es una combinación de inhibición del crecimiento y disminución de la
viabilidad, puede actuar como inhibidor de la fermentación a partir de un 8 %.

2. METODOLOGIA
2.1. Preparación de jarabe de melaza
Se preparó 150ml de un jarabe de melaza de caña con una concentración de azúcar de ~ 7% p/v. Puesto que
la melaza tiene una concentración de 45% de azúcares fermentables, se realizó el cálculo para la cantidad
de melaza que se debía medir. Este cálculo se encuentra en la sección de anexos. Una vez pesado la melaza
y calculado el volumen de esta cantidad, se procedió a completar el volumen de 150mL con agua destilada.
Luego, se ajustó el pH del jarabe a 4.5 utilizando ácido sulfúrico (H2SO4) 4N. Posteriormente, se procedió
a adicionar dos sales: urea y fosfato diamónico, que quedaran a una concentración de 700 y 500 ppm
respectivamente. Este cálculo se encuentra en la sección de anexos. Por último, luego de añadir estas sales,
el pH se volvió a acidular a 4.5.

2.2 Cinética de crecimiento microbiano

Un cultivo de S. cerevisiae en agar Sabouraud se inoculó en un medio de cultivo líquido estándar. Esto se
llevó a cabo añadiendo 1 mL del medio líquido en la caja Petri en condiciones estériles y posteriormente
por medio de un asa de siembra se desprendió la biomasa del agar. La solución con levaduras concentradas
fue tomada con una pipeta e introducida en el Erlenmeyer donde se encontraba el caldo de cultivo. Este
procedimiento se realizó una vez más para garantizar la mayor concentración del inóculo. En la figura 1 se
muestra el medio de cultivo e inóculo utilizado.
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 6

Figura 1. Caldo de cultivo estándar y cultivo en caja de S. cerevisiae.

En total se realizaron tres inoculaciones diferentes: La inoculación 3 se realizó un día antes de la
práctica (18 horas antes), la 2 se preparó 4 horas antes y la 1 fue preparada durante la práctica de
laboratorio (0 horas). Las fechas y horas de la inoculación se encuentra en anexos. El conteo de las
levaduras se realizó de dos maneras, una por unidades formadoras de colonias (UFC) y la otra por
conteo de células en la cámara de Neubauer.
Para el conteo de unidades formadoras de colonias, se tomó las inoculaciones 2 y 3, realizando la
siembra en placa en agar Sabouraud. Esto se realizó tomando el inóculo inicial y haciendo una dilución
seriada hasta 10-3. Luego, se tomó 0,1 mL de cada dilución y se sembró en el agar. Las cajas fueron
incubadas a 30°C por 4 días. Por otra parte, se realizó el conteo de levaduras en cámara de Neubauer
de un caldo de cultivo inoculado con Saccharomyces cerevisiae muestreado a los inóculos 1, 2 y 3.
2.3 Observación de estructuras sexuales de hongos
Adicional a la cinética de crecimiento, se identificó la estructura sexual de dos hongos Aspergillus
fumicatus y Aspergillus flavus mediante una tinción con azul de lactofenol. Para esto se tomaron las
estructuras sexuales de los dos hongos por medio de una cinta adhesiva, pegándola en la superficie de
estos y luego añadiendo el azul de lactofenol para la visualización. Esto fue puesto en el microscópio
y se observándolo con el objetivo de 100X.
3. RESULTADOS
A continuación, se presentan los resultados obtenidos para cada uno de los procedimientos realizados en el
laboratorio.
3.1. Preparación de jarabe de melaza
Se obtuvo un medio de cultivo a base de melaza de caña con una concentración de azúcar ~ 7% p/v, una
concentración de urea de 700ppm y una concentración de fosfato diamónico de 500ppm. El medio se
observa en la Figura 2. Al calcular las concentraciones de nitrógeno y fosforo que aportaban estas sales al
medio de cultivo, se obtuvo que el nitrógeno se encontraba a una concentración de 432,35 ppm y el fósforo
a una concentración de 117,25 ppm. Los cálculos realizados se encuentran en detalle en los anexos.
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 7

Figura 2. Caldo de cultivo a base de melaza de caña

3.2 Cinética de crecimiento microbiano

En la figura 3, se muestra los tres inóculos que se utilizaron para medir la cinética de crecimiento
microbiano.

Figura 3. Caldo de cultivo de S. cerevisiae en los tiempos A. 0 horas, B. 4 horas y C. 18 horas

Para los medios 4 y 18 horas se realizaron cultivos en caja Petri de diluciones seriadas hasta 10-3. En la
Figura 4, se observa en A el medio inoculado por 4 horas y en B el medio inoculado por 18 horas. En ambos
casos, se registró un crecimiento estimado de >3x10^6 UFC/ml
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 8

Figura 4. Siembras de diluciones seriadas del medio de cultivo en agar Sabouraud de las muestras A. 4
horas y B. 18 horas
En el recuento de cámara de Neubauer se utilizó azul de metileno para la identificación de las células
muertas. Los resultados obtenidos para cada inóculo se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3. Conteo por cámara de Neubauer de Saccharomyces cerevisiae en diluciones de 10-2.

Número de células
Tiempo (horas)
Vivas Muertas
0 29 0
4 58 0
18 77 14

A partir de estos datos se puede calcular la viabilidad celular la cual es el porcentaje de células vivas en
una muestra. Esta se calcula como
𝑁𝑢𝑚. 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑣𝑎𝑠
𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = × 100% (4)
𝑁ú𝑚. 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

De esta manera se obtiene que la viabilidad celular a tiempo 0 y 4 es del 100%, mientras que a 18 horas la
viabilidad es de 84,6%. Por otro lado, se tiene que la concentración de células por mililitro se encuentra
como

29 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 × 250000 𝑐𝑒𝑙𝑑𝑎𝑠⁄ 3

𝑐𝑚 × 100 = 2,9 × 107 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠⁄
25 𝑐𝑒𝑙𝑑𝑎𝑠 𝑐𝑚3
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 9

Realizando este cálculo para cada una de las inoculaciones se obtiene valores del orden de 107. Por medio
de estos datos, se puede construir una gráfica de crecimiento. En las Figuras 5 y 6, se muestra la curva
cinética de crecimiento aritmética y semi logarítmica, respectivamente.

9.E+07
8.E+07
7.E+07
Número de celulas /mL

6.E+07
5.E+07
y = 3E+07e0.0533x
4.E+07
R² = 0.9966
3.E+07
2.E+07
1.E+07
0.E+00
0 5 10 15 20
Tiempo (horas)

Figura 5. Curva de la cinética de crecimiento aritmética de S. cerevisiae en medio estándar

18.4

18.2
Número de celulas /mL

18.0

17.8
y = 0.0533x + 17.208
17.6 R² = 0.9966

17.4

17.2

17.0
0 5 10 15 20
Tiempo (horas)

Figura 6. Curva de la cinética de crecimiento semi-logarítmica de S. cerevisiae en medio estándar

Teniendo en cuenta la ecuación de la Figura 6, se determinó que la tasa de crecimiento microbiano µ es
0.0533h-1 y se calculó que el tiempo de duplicación es 13.0 horas de acuerdo con la ecuación 1.
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 10

3.3 Observación de estructuras sexuales de hongos.

En la Tabla 4, se observan los esporangióforos de dos especies de hongos; Aspergillus fumicatus y
Aspergillus flavus Commented [LD1]: Andres yo siento que hice estas
actividades
Crecimiento en placa Crecimiento en placa Estructura sexual Registrar en una hoja electrónica el tiempo y la población de
Especie
Vista frontal Vista del reverso células vivas/ mL obtenidos en cada muestreo.
B) Calcular el Logaritmo Natural (LN) de la población
celular e identificar la fase de crecimiento exponencial.
C) Graficar la curva de crecimiento (aritmética y semi-
logarítmica).

Asperigillus 1. Definir donde inicia y termina la fase exponencial de

fumigatus crecimiento.
Excepto la ultima activida, porfa completala y revisa las
otras que yo hice

Aspergillus
flavus

4. DISCUSION
Según la Figura 3, se observa una diferencia en la turbidez del medio debido al aumento del número de
microorganismos a lo largo del tiempo. Las células aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de
cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles, sintetizando sus propios
componentes celulares y dividiéndose en cuanto duplican su masa y su material genético. El tiempo que
tarda una célula en cumplir ese proceso se denomina tiempo de generación (τ) y puede variar desde unos
20 minutos en condiciones óptimas hasta varios meses en condiciones ambientales, en el caso de S.
cerevisiae fue de 13 horas. Cada vez que transcurre un tiempo de generación, el número de células se
duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial. Sin embargo, según Muñoz (2013), el tiempo de
duplicación de esta levadura puede variar entre 1 y 3 horas dependiendo de la fuente de carbono que se use
y la disponibilidad de los otros nutrientes en el medio de cultivo. En este caso y teniendo en cuenta las
Figuras 5 y 6, se observa que no es posible distinguir las fases de crecimiento típicas reflejadas por el
comportamiento de la levadura por lo que no se puede predecir cuál es la fase exponencial ni es posible
asumir que los cálculos basados en los ajustes de la gráfica sean confiables, a esto se debe el tiempo de
duplicación de 13 horas reportado anteriormente y que no coincide con Fajardo y Sarmiento (2007) quienes
reportaron un tiempo de duplicación para la misma levadura en melaza de caña de 8 horas.
A nivel industrial es muy importante conocer el tiempo de duplicación y la tasa de crecimiento puesto que,
son variables claves en la productividad. Conocer estas variables de un microorganismo, optimiza los
procesos industriales por dos razones. La primera es obtener el menor tiempo de duplicación para disminuir
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 11

el tiempo de producción y por tanto aumentar la productividad. La segunda consiste en saber en qué etapa
de crecimiento se encuentra las células y por tanto saber el tipo de metabolitos que produce la célula en un
determinado tiempo, ayudando a obtener la mayor cantidad del metabolito de interés.
A pesar de que no se puede evidenciar claramente donde empieza cada fase de crecimiento, se podría decir
que el primer inóculo, se encontraba en la fase de latencia, puesto que la medida del número de levaduras
fue tomada poco tiempo después de su inoculación. Por otro lado, se podría decir que el segundo inóculo,
se encontraba ya en su fase exponencial, en donde ya había asimilado el medio de cultivo y había empezado
a crecer evidenciándose por un aumento del número de células con respecto al primer inóculo. Y por último,
el inóculo que había sido sembrado 18 horas antes de la medición celular, se podría considera en una fase
madura, bien sea estacionaria o incluso, la fase de la muerte. Esto porque ya se empezaba a ver una cantidad
considerable de células muertas, por lo que la viabilidad de la muestra empezaba a disminuir. Debido a
esto, se puede considerar un causal de error considerar que los tres puntos tomados para la cinética de
crecimiento pertenecen a un crecimiento exponencial. Por esto se recomienda que se tomen más puntos
para mejorar la curva. Por otra parte, otra causa del error obtenido se puede asociar a que el inóculo no fue
el mismo para las tres muestras tomadas, esto afecta a que la concentración inicial en las tres inoculaciones
no es equivalente, y puesto que, la fase de latencia depende de la concentración inicial de inóculo, juega un
papel importante en la determinación de la cinética de crecimiento de la levadura. Por esto, se recomienda
que se tomen los puntos de la curva de un mismo inóculo, para que no ocurra este tipo de errores.
El conteo por unidades formadoras de colonias dio un valor estimado de más de 3,0 x 106 UFC, en la figura
4 se puede observar que en la dilución seriada 10-3 las levaduras presentan crecimiento en masa, por lo que
el conteo se dificulta. Por lo tanto, se considera un valor estimado. Para este caso se dice que es mayor a
300 multiplicado por el valor de la dilución, esto quiere decir, >300 x 103. Además, si se toma en cuenta
que se sembró 0,1mL del cultivo, el grado se aumenta en una unidad dando como resultado el valor
previamente mencionado (3,0 x 106 UFC). Esta estimación es deficiente, puesto que no se tiene una
información útil para la obtención de una cinética de crecimiento. Sin embargo, es consistente con lo
obtenido por el conteo de la cámara de Neubauer, ya que se obtuvieron un número de orden de 107, lo cual
es mayor que 3,0 x 106. Esto se hubiera mejorado al haber realizado por lo menos dos diluciones seriadas
adicionales.
Antes de realizar el proceso de fermentación alcohólica, es necesario someter a las melazas a tratamientos
previos para acondicionarla. En primer lugar, las melazas pueden contener microorganismos que pueden
ser nocivos para la fermentación. El más común es la bacteria Leuconostoc mesenteroides, la cual
polimeriza las moléculas de sacarosa en dextranos no fermentables, por lo que es necesaria una
esterilización del medio (Arteaga, 2013). Debido a la altísima concentración de azúcares y sales presentes
en las melazas impiden que los microorganismos puedan fermentarlas, debido a la gran presión osmótica
que generan sobre sus paredes celulares; asimismo, las melazas son altamente viscosas, y su manipulación
es difícil en estas condiciones. Por estas razones, es necesario diluir las melazas; para ello, se les agregó
agua, hasta obtener un caldo como se observa en la Figura 2. Aunado a lo anterior, en ocasiones es
necesario añadir algunos elementos nutricionales adicionales, con el fin de complementar los nutrientes
necesarios para los microorganismos que realizarán la fermentación. Para las melazas de caña de azúcar,
es necesario añadir algo de nitrógeno y fósforo. Para producción de alcohol carburante, el nitrógeno
puede añadirse en forma de urea y los requerimientos en fósforo pueden cubrirse con fosfato de
diamonio, con la correspondiente disminución de urea o la fuente de nitrógeno usada.
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 12

5. CONCLUSIONES
Se determinó que la tasa de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae es 0.0533 h-1 en un caldo de cultivo
estándar y que el tiempo de duplicación es 13.0 horas.
La melaza de caña sirve como medio de cultivo requiere de una dilución para ajustar el porcentaje de azúcar,
ajustar el pH y esterilización para ser usada como medio de cultivo
Se comprobó que la observación de las estructuras sexuales o esporandioforos de los hongos sirven como
estrategia de identificación de Aspergillus
6. BIBLIOGRAFIA
Arteaga, L. (2013). Proceso de producción de etanol a partir de melazas. Grupo de Investigación
INMECNAR. Facultad de Ingeniería. Corporación Universitaria Autónoma de Nariño
Beltran, G.; Torija, M.J.; Novo, M.; Ferrer, N.; Poblet, M.; Guillamon, J.M. Analysis of yeast populations
during alcoholic fermentation: a six year follow-up study, Systematic and Applied Microbiology, 25: 287-
293, (2002).
Fajardo, E.; Sarmiento, S. 2007. Evaluación de melaza de caña como sustrato de Saccharomyces cerevisiae.
Tesis. Microbiología Industrial. Facultad de Ciencia Básicas. Pontificia Universidad de Javeriana. Bogotá.
Colombia.

Groombridge AS, Miyashita S, Fujii S, et al. High sensitive elemental analysis of single yeast cells
(Saccharomyces cerevisiae) by time-resolved inductively-coupled plasma mass spectrometry using a high
efficiency cell introduction system. Anal Sci. 2013;29(June):597-603. doi:10.2116/analsci.29.597

Honig, P. 1991. Bioquímica de las fermentaciones. Editorial Aguilar. España 42-48p.

Maier, R. (2009). Bacterial growth. Chapter 3. Elsevier. pp. 6-24

Pérez, J. 2011. Evaluación del efecto de diferentes diluciones de agua de coco suplementada con biotina,
para la producción de levadura (Saccharomyces cerevisiae) a nivel de matraz y en bioreactor de tanque
agitado. Tesis. Universidad de Vera Cruz. Córdova. Argentina.

Shu C-H, Lung M-Y. Effect of pH on the production and molecular weight distribution of
exopolysaccharide by Antrodia camphorata in batch cultures. Process Biochem. 2004;39(8):931-937.
doi:10.1016/S0032-9592(03)00220-6

Skovgaard N. Industrial Microbiology: An Introduction. Vol 77.; 2002. doi:10.1016/S0168-

1605(02)00154-X

Tomasso, M. Tolerancia de las levaduras al etanol. Universidad de la República Uruguay. Facultad

de Química (2004).

Trabajo práctico: Cultivo Batch. Departamento de Ciencia y Tecnología Universidad Nacional de Quilmes.
http://bioprocesos.unq.edu.ar/Biopro I/TP Cultivo Batch.pdf. Accessed March 10, 2018.

Yenizey D, Alvarez M. Fermentaciones. http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/acym/Fermentaciones-

.pdf. Accessed March 10, 2018.
 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 13

7. ANEXOS

7.1. Fecha y hora de la siembra de cada inóculo

 Punto 1: Sábado 3 de Marzo del 2018 a las 9:00 am

 Punto 2: Sábado 3 de Marzo del 2018 a las 7:00 am
 Punto 3: Viernes 2 de Marzo del 2018 a las 3:00 pm

7.2. Cálculo para la determinación de la cantidad de melaza a utilizar.

Puesto que la melaza tenía una concetración de azúcares del 45% y una densidad de 1,45g/ml. La cantidad
de melaza a pesar para obtener una concentración final de 7% se obtiene como

100𝑔
7% × = 15,56 𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑙𝑎𝑧𝑎
45%

El volumen de la melaza se halla por medio de la densidad como

1 𝑚𝐿
15,56 𝑔 × = 10,72 𝑚𝐿
1,45 𝑔

Por lo tanto, el volumen de agua destilada requerido para obtener la solución de 150mL a una concentración
de azúcar de 7% se obtiene de la diferencia.

150𝑚𝐿 − 10,72𝑚𝐿 = 139,28 𝑚𝐿

7.3. Cálculo para la determinación de la cantidad de urea y fosfato diamónico (FDA) a pesar.

Para obtener la cantidad de urea que hay que añadir para tener una concentración 700 ppm de nitrógeno en
150mL se procede como sigue

𝑚𝑔 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑁 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑈𝑟𝑒𝑎 60,06 𝑚𝑔 𝑁

700 𝑁× × × × 0,15𝐿 = 225,22𝑚𝑔 𝑈𝑟𝑒𝑎
𝐿 14,0 𝑚𝑔 𝑁 2𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑁 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑈𝑟𝑒𝑎

Para obtener la cantidad de fosfato diamónico que hay que añadir para tener una concentración 500 ppm de
fósforo en 150mL se procede como sigue

𝑚𝑔 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑃 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐹𝐷𝐴 132,06 𝑚𝑔 𝐹𝐷𝐴

500 𝑃× × × × 0,15𝐿 = 319,81𝑚𝑔 𝐹𝐷𝐴
𝐿 30,97 𝑚𝑔 𝑃 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑃 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐹𝐷𝐴

Nota: La unidad de concentración ppm es equivalente a mg/L.

 Delgado Lyanne; Andrade Andrés / Laboratorio de microbiología (2018) 14

7.4. Cálculo de la concentración de fósforo y nitrógeno añadida a la melaza.

La cantidad de fósforo añadida es de 500 ppm, y la cantidad de nitrógeno añadida se calcula con la suma
de la cantidad añadida por medio de la Urea y la sal de fosfato diamónico. El cálculo se muestra a
continuación.

𝑚𝑔 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑃 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐹𝐷𝐴 2 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑁 14,0 𝑚𝑔 𝑁 𝑚𝑔

500 𝑃× × × × = 452,05 𝐹𝐷𝐴
𝐿 30,97 𝑚𝑔 𝑃 1𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑃 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝐹𝐷𝐴 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑁 𝐿

𝑚𝑔 𝑚𝑔 𝑚𝑔
𝑁 = 700 + 452,05 = 1152,05
𝐿 𝐿 𝐿

La concentración final del nitrógeno que se añadió fue de 1152,05 ppm.