INSTITUTO POLITECNICO

NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLOGICAS
“Químico Bacteriólogo Parasitólogo”
Determinación de algunos factores que
afectan el establecimiento de un método
espectrofotométrico
Sanchez Martinez Victor Jesus
Profesor. Fernando Hernández Derramadero
5QM1
Sección 3
 Determinación de algunos factores que afectan el establecimiento de un método
espectrofotométrico

Objetivos.

a) Seleccionara tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas para el

espectrofotómetro.
b) Manejara algunos de los parámetros que intervienen en el establecimiento de un método
espectrofotométrico.
c) Establecerá las condiciones óptimas de los parámetros probados para la aplicación del
método.

Fundamento de la práctica.

La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se basa en la relación que
existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando se hace
incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de
la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad
del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad
del rayo de luz transmitido. Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra
puede estar en fase líquida, sólida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro
electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para formar una solución.

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que muestra la cantidad
de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro
electromagnético, es decir, a una determinada longitud de onda de la energía radiante, cada
sustancia absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto.
Durante el diseño de un método espectrofotométrico hay que considerar que en la determinación
de sustancias se pueden presentar dos casos: o son incoloras o bien tienen una absortividad muy
baja. En ambos casos es conveniente, para su análisis, la realización de una reacción química entre
el analito de interés y un cromógeno para producir un cromóforo con una absortividad tal, que
permita su determinación fotométrica de manera adecuada. Para el establecimiento de un método
espectrofotométrico es importante seleccionar la longitud de onda de trabajo en función del
cromóforo producido por la reacción, determinar el efecto que tienen la temperatura, el pH, la
concentración del cromógeno, y observar cómo afecta la presencia de sustancias extrañas al
desarrollo de color. También debe establecerse el tiempo óptimo para la producción total del color
y el intervalo de tiempo en este es estable. De esta forma se conocen los factores que afectan el
color desarrollado y se podrán controlar, para que la transmitancia dependa solamente de la
concentración del analito en estudio. Con la elaboración de una curva de calibración, y el
tratamiento adecuado de estos datos espectrofotométricos, se podrá verificar el cumplimiento de
ley de Bouger-Beer, obtener el intervalo útil de concentración, la sensibilidad, el error fotométrico
del método con el instrumento empleado (por el método de Ringbom) y el límite de detección.
Resultados.

a) Resultados de la selección de tubos.

Tabla 1. Selección de tubos comunes para usarlos como celdas

Tubo N° %T400 (H2O) Tubo N° %T400 (H2O) Tubo N° %T400 (NiSO4)

1 95 16 95.1 1 20.1
2 95.6 17 95.2 2 19.7
3 95.2 18 95.3 3 20.9
4 94.8 19 95.3 4 20.2
5 95.8 20 96.1 5 20.5
6 94.8 21 96 6 20.1
7 94.9 22 95.3 7 20.9
8 94.9 23 96.1 8 20.3
9 95.3 24 95.5 9 20.7
10 95.2 25 96.3 10 19.3
11 95.7 11 20
12 94.8 12 20.3
13 95 13 20.5
14 95.1 14 19.7
15 95.7 15 19.7
Pregunta 1.-Explique qué son las superficies ópticas equivalentes y el diámetro interno equivalente.
La superficie óptica equivalente se refiere a que las celdas presenten una superficie homogénea, es
decir que sean idénticas o similares desde el punto de vista óptico en una medición
espectrofotométrica. Asimismo deben presentar un grosor igual en toda la circunferencia del tubo.
El diámetro interno equivalente es análogo a la superficie óptica equivalente: el diámetro de los
tubos deberá ser igual en cada tubo para que el paso de luz sea constante.

Tabla 2. Curva de calibración de Fe3+ por el

método del NH4SCN
Fe3+ A ajustada por y-yA
Tubo N° A480
(μg/mL) regresión lineal
-0.044
1 0.1163 0.007 0.051
-0.045
2 0.3490 0.04 0.085
-0.041
3 0.6980 0.096 0.137
-0.021
4 1.1633 0.186 0.207
0.028
5 1.7450 0.321 0.293
0.038
6 2.3267 0.418 0.380
0.074
7 2.9083 0.541 0.467
 0.042
8 3.4900 0.595 0.553
0.053
9 4.0717 0.693 0.640
0.021
10 4.6533 0.748 0.727
0.000
11 5.8167 0.9 0.900
-0.129
12 8.1433 1.118 1.247
0.024
13 12.797 1.964 1.940

 Para determinar la cantidad de ión férrico

2.5
presente en cada tubo, se procede al
siguiente cálculo: 2 y = 0.149x + 0.0334
R² = 0.9896

Absorbancia 480nm
55.84 g/mol --------------- 1M (1 litro) 1.5
X --------------- 0.00025 M (1 litro)
X = 0.01396 g/mol (por litro en una solución 0.00025 1
M)
0.5
Peso molecular Fe3+ = 55.84 g/mol
[FeCl3] = 0.00025 M 0
0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000 10.000012.000014.0000
Concentracion de Fe3+ (µg/ml)
Ahora calculamos la cantidad de Fe3+ por mililitro en
el tubo no. 2 por ejemplo: Fig 1.Curva de calibración de Fe3+ lineal (puntos azules) y su regresión lineal (línea
azul) con la ecuación de la recta a partir de los datos experimentales en la tabla
0.01396 g/mol ----------- 1000 mL 2

X ----------- 0.05 mL (mL adicionados de FeCl3)

-7
X = 9.98x10 g = 0.698 µg y dividimos entre el volumen total (6ml)=0.1163 µg/ml
Se realizan los mismos cálculos para cada tubo.

 Para calcular los valores de A ajustada por regresión lineal, simplemente usamos la siguiente
ecuación:

y = 0.149x + 0.0334

Sustituyendo en x los datos de Fe3+ (µg/mL) de la tabla anterior. Ejemplo tubo 2:

y = 0.149(0.349) + 0.0334= 0.085

Límite de detección o concentración mínima detectable (LDD).

Para su cálculo, primero se obtiene la desviación estándar SB teniendo en cuenta que n = 13 ya que
éste fue el número de tubos usados. SB = 0.01359
Ahora se usa la ecuación y = yB + 3SB, en donde:

y = Medida de absorbancia producida por la concentración mínima detectable.

yB = Medida de absorbancia del blanco u ordenada al origen = 0.007
SB = Desviación estándar del blanco = 0.01359
Entonces se obtiene que y = yB + 3SB = 0.007 + 3(0.01359) = 0.04777

Finalmente se despeja a “x” de la ecuación de la recta de regresión lineal y el resultado obtenido

será el límite de detección.
y = 0.149x + 0.0334

𝐿𝐷𝐷 = 𝑥 = 𝑦 − 𝑎⁄𝑏 = (0.04777 − 0.0334)⁄0.149 = 0.09644

b) Método de Ringbom

Tabla 3. Datos para aplicar el método de Ringbom en la determinación de Fe3+ por el método del
SCN-
Tubo
No. Fe3+ (µg/mL) Log [Fe3+] A480 %T Absortancia
1 0.116 -0.934 0.051 88.975 11.025
2 0.349 -0.457 0.085 82.148 17.852
3 0.698 -0.156 0.137 72.878 27.122
4 1.163 0.066 0.207 62.125 37.875
5 1.745 0.242 0.293 50.886 49.114
6 2.327 0.367 0.380 41.680 58.320
7 2.908 0.464 0.467 34.140 65.860
8 3.490 0.543 0.553 27.963 72.037
9 4.072 0.610 0.640 22.905 77.095
10 4.653 0.668 0.727 18.761 81.239
11 5.817 0.765 0.900 12.587 87.413
12 8.143 0.911 1.247 5.666 94.334
13 12.797 1.107 1.940 1.148 98.852
 120.000 90.000
80.000 y = 73.061x + 32.201
100.000 R² = 0.9986
70.000
80.000 60.000
Absrotancia

Absortancia
50.000
60.000
40.000
40.000 30.000
20.000
20.000
10.000
0.000 0.000
-1.500 -1.000 -0.500 0.000 0.500 1.000 1.500 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800
Log[Fe3+] Log[Fe3+]

Fig. 2. Gráfico de Ringbom. En el se puede observar un intervalo Fig. 3. Intervalo útil en absortancia y logaritmo de la concentración. La
(intervalo útil) que sigue la ley de Lambert-Beer (intervalo rojo). pendiente obtenida sirve para calcular el error fotométrico

%Ep (% de error fotométrico)= 230.3/m

M= Pendiente de la recta del intervalo útil = 73.061

%Ep = 230.3/73.061= 3.15%

c) Efecto del tiempo en la estabilidad del color.

Tabla 4. Estabilidad del color respecto al tiempo 1.- ¿Es estable el color?
Tiempo (min) A480 No, debido a que con el tiempo la
0 0.582 intensidad de este disminuye.
30 0.546 2.- ¿Cuál es el tiempo óptimo para
hacer las lecturas?
60 0.528
El tiempo a 0 min ya que es donde se
90 0.498
presenta la mayor intensidad
120 0.477
además de que es cuando la
absorbancia obtenida se acerca más
0.59 al centro de la curva de calibración,
0.57 lugar donde se presenta el error
Absorbancia 480nm

0.55 fotométrico mínimo.

0.53
0.51
0.49
0.47
0.45
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (min)

Fig. 4. Estabilidad del color respecto al tiempo.

 D) Efecto de la concentración del cromógeno

Tabla 5. Efecto de la concentración de SCN- en la

0.12
determinación de Fe3+
SCN- Fe3+ 0.1

Absorbancia (480nm)
Tubo No. (µg/mL) (µg/mL) SCN-/ Fe3+ A480
0.08
Blanco 870 - - 0
0.06
1 290 4.2 20.71 0.008
2 870 4.2 55.24 0.018 0.04
3 2900 4.2 207.14 0.037 0.02
4 5800 4.2 690.48 0.052
0
5 8700 4.2 1380.95 0.099 0 1000 2000 3000 4000
6 11600 4.2 2071.43 0.084
Relacion [SCN-/Fe3+]
7 14500 4.2 2761.9 0.101

Fig. 5. Grafica de absorbancia contra la relación concentración [SCN-/Fe3+]

Para la cantidad de Fe3+ en todos los tubos:

56 g/mol --------------- 1M (1 litro) Peso molecular Fe3+ = 56 g/mol

X --------------- 0.00025 M (1 litro) [FeCl3] = 0.00025 M

X = 0.014 g/mol

0.014 g/mol ----------- 1000 mL

X ----------- 1.5 mL (mL adicionados de FeCl3)

X = 2.1x10-5 g = 21 µg entre 5 mL (totales) = 4.2 µg/mL

Para la cantidad de SCN- en el tubo 2:

58 g/mol --------------- 1M (1 litro) Peso molecular SCN- = 58 g/mol

X --------------- 0.5 M (1 litro) [NH4SCN] = 0.5 M

X = 29 g/mol

29 g/mol ----------- 1000 mL

X ----------- 0.15 mL (mL adicionados de NH4SCN)

X = 4.35x10-3 g = 870 µg entre 10 mL (totales) = 870 µg/mL

¿Qué concentración de tiocianato se recomienda? Una concentración de 5800 microgramos/ml

ya que esta se encuentra dentro de un intervalo útil que sigue la ley de Lambert-Beer.
 E) Efecto del pH en el desarrollo de color de la reacción entre el Fe3+ y el SCN-

Tabla 6. Efecto del pH 1

Tubo N° pH A480 0.9
0.8
1 0 0.859

Absorbancia 480nm
0.7
2 1 0.928 0.6
3 2 0.893 0.5
4 9 0.015 0.4
0.3
5 9 0.015
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10
pH

Fig. 4. Efecto del pH

¿De qué manera influye el pH en el sistema colorido?

A pH’s ácidos se mantiene el sistema colorido. Conforme aumenta el valor de pH, el sistema pierde
la capacidad de absorción de la radiación y se obtienen absorbancias muy bajas.

¿Cuál es el pH recomendado para que se efectúe la reacción Fe3+ y el SCN? pH = 1

F) Efecto de algunos aniones sobre la absorbancia absoluta

1
Tabla 7. Efecto de algunos aniones en la reacción de Fe3+ -
SCN- 0.8
Anión A480 inicial A480 final ΔA480
Fluoruro 0.936 0.324 0.612 0.6

Oxalato 0.922 0.181 0.741 0.4

Tartrato 0.922 0.902 0.02
Fosfato 0.912 0.907 0.2
0.005
0
Fluoruo Oxalato Tartrato Fosfato
¿Cuál es el efecto de los diferentes aniones sobre la A inicial A final
reacción entre el ión férrico y el tiocianato? Fig. 5. Efecto del pH. Efecto de algunos aniones en la reacción de
Fe3+ - SCN-
Disminuyen los valores de absorbancia. En orden
decreciente de interferencia se tienen a los aniones: oxalato, fluoruro. El tartrato y el fosfato casi
no presentan interferencias.
¿A qué se debe este efecto? Los fosfatos, fluoruros y oxalatos aun en pequeñas cantidades
interfieren formando complejos estables con los iones férricos.

Parámetro Valor óptimo

pH 1
Tiempo 0
-
Concentración de SCN 5800 µg/mL
Límites de concentración con %Ep mínimo 1.163-4.653 µg/mL
Aniones que interfieren (en orden
Oxalato, fluoruro, fosfato y tartrato
creciente)
Límite de detección del método (LDD) 0.09644

Discusión de resultados.

Para la selección de tubos, se eligieron a aquéllos que presentaban características visualmente

similares, como: mismo diámetro, mismo grosor y con boquilla gruesa y pronunciada. Todas estas
características nos facilitan las lecturas de porcentaje de transmitancia, ya que si no fuera de esta
manera, los valores nos variarían más del 2% de diferencia establecida. De igual manera, el paso de
luz es constante o casi constante cuando se realiza una selección de tubos de la forma antes descrita.

Obtuvimos una curva de calibración con los datos experimentales cuyo factor de correlación lineal
fue de 0.989 (ver ilustración 1) En la misma gráfica se trazó la concentración vs las absorbancias
ajustadas por regresión lineal. Se puede ver que ambos trazos coinciden bastante. Entonces esta
reacción sí sigue la ley de Bouger-Beer. A reserva de los valores extremos que ocasionan las
desviaciones.

El límite de detección, que se define como aquella concentración que proporciona una señal
instrumental significativamente diferente de la señal del blanco, obtenido en este experimento fue
de 0.9644. Existe una relación entre el LDD y la sensibilidad. La palabra sensibilidad se utiliza como
sinónimo de límite de detección bajo, por lo que se puede decir que nuestro método
espectrofotométrico es sensible gracias a que se obtuvo un límite de detección pequeño.

Existe un valor de porcentaje de error fotométrico máximo, el cual es del 5%. El %Ep que obtuvimos
fue del 3.15% por lo que nos encontramos dentro del intervalo permitido de error.

La tabla y figura 4 muestran los resultados de este experimento. Claramente se ve como la

absorbancia va disminuyendo respecto a la primera lectura. El color no es estable puesto que el
cromógeno disminuye en su absorbancia con el paso del tiempo por una descomposición de este
por lo que el tiempo óptimo para hacer las lecturas es el inmediato a cuando se añadió o el ion
férrico o el tiocianato.
En la figura 5 se observa que, conforme se añade más cromóforo la absorbancia de 480 nm aumenta,
esto es porque se asocia al ion férrico presente en la solución. Hasta alcanzar lo que parece una
absorbancia estable o máxima desde 0.7 aunque la relación sigue creciendo. Haría falta añadir un
poco más del cromóforo para conocer la relación de concentraciones máxima o de punto final.
Recomendaría la concentración de tiocianato mínima de 2900 μg/mL

El pH cercano a 1 que se midió con tiras indicadoras, no parece afectar los valores de absorbancia
con respecto al testigo de pH igual a 2. En cambio, los pH altos, desde 7, disminuyen la absorbancia
hasta 96%. El pH influye en el sistema colorido, cuando es ácido mantiene disponibles en solución a
los iones férrico y tiocianato, pero cuando es alcalino, el ion férrico precipita como hidróxido
imposibilitando la captación por parte del tiocianato. Se recomienda un pH de 1 para la reacción
entre ion férrico y anión tiocianato.

El efecto que ejercen los aniones parece ser dirigido sobre la interacción del ion férrico con el
tiocianato, en especial el oxalato y el floruro, aniones muy electronegativos que compiten con ion
cianuro para formar un nuevo complejo con ion Fe3+.

CONCLUSIONES

Para un buen establecimiento de un método espectrofotométrico es necesario elegir inicialmente

tubos con superficies ópticas equivalentes y diámetros similares, al igual que controlar variables
como pH, tiempo, concentración de analitos y presencia de interferencias.

Las condiciones óptimas para el buen funcionamiento del método espectrofotométrico realizado
son pH’s ácidos (de 1), tiempo mínimo de reposo (menos del minuto), concentración de SCN- de
5800 µg/mL y evitar la presencia de aniones como fluoruros, oxalatos y fosfatos.

BIBLIOGRAFÍA

 Torres Cartas Sagrario, Gómez Benito Carmen. “Técnicas instrumentales. Manual de

Laboratorio”. Editorial Universidad Politécnica de Valencia. pp. 60-61.