BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Dalam mikrobiologi, peralatan laboratorium merupakan unsur penting

yang harus ada. Peralatan yang ada dalam laboratorium pun haruslah steril agar

dapat menunjang pekerjaan yang berhubungan dengan mikroorganisme dan hal

tersebut merupakan syarat mutlak. Artinya, pada bahan atau peralatan yang akan

digunakan harus bebeas dari mikroorganisme yang tidak diingikan yang dapat

merusak media atau koloni suatu mikroorganisme yang diinginkan. Adapun

peralatan yang umumnya digunakan di dalam laboratorium mikrobiologi antara

lain : Media yaitu; cair, semi solid, solid (agak miring (siant), agak tegak (deep),

agak cawan(plate)) dan peralatan yaitu; autoklaf, tabung kultur, cawan petri,

jarum inokulasi, pipet,waterbath,inkubator,dan lemari pendingin (Suriawira,2005).

Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan

semua organisme yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ketika anda untuk

pertama kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara aseptik,

sesungguhnya anda telah menggunakan salah satu sterilisasi, yaitu pembakaran.

Namun kebanyakan peralatan dan media yang umum dipakai dalam pekerjaan

mikrobiologis akan menjadi rusak bila dibakar. Untungnya tersedia berbagai

metode lain yang efektif (Hadioetomo, 1993).

Ada tiga cara yang umum digunakan dalam sterilisasi yaitu penggunaan

panas, penggunaan bahan kimia dan penyaringan (Filtrasi). Bila panas digunakan

bersama – sama dengan uap air maka disebut sterilisasi panas lembut atau
sterilisasi basah, bila tanpa kelembapan maka disebut sterilisasi panas kering atau

sterilisasi kering (Hadioetomo, 1993).

Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam lab mikrobiologi.

Dalam melakukan sterilisasi, diperlukan teknik-teknik agar sterilisasi dapat

dilakukan secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain

yang mengkontaminasi media. Sterilisasi adalah proses untuk menjadikan alat-

alat terbebas dari segala bentuk kehidupan. Seperti yang telah disebutkan bahwa

tujuan sterilisasi untuk mematikan mikroorganisme yang tidak diinginkan agar

tidak ikut tumbuh.

Ada beberapa teknik sterilisasi, yaitu dengan cara fisik dengan panas,

mekanik dengan filtrasi dan kimia dengan senyawa-senyawa kimia. Dalam

praktikum ini kami mencoba mempelajari bagaimana cara mensterilisasi alat-alat

yang nantinya dipakai untuk bekerja di dalam laboratorium mikrobiologi. Kami

mencoba untuk melakukan sterilisasi guna bekal untuk keberhasilan dalam

menumbuhkan suatu biakan koloni mikroorganisme yang diinginkan. Proses

sterilisasi dipergunakan pada bidang bedah untuk mencegah pencemarah

organisme luar, pada bidang bedah untuk mempertahankan keadaan aseptis, pada

pembuatan makanan dan obat-obatan untuk menjamin keamanan terhadap

pencemaran oleh mikroorganisme dan di dalam bidang-bidang lain pun sterilisasi

ini juga penting.

Pengetahuan tentang cara-cara mematikan, menyingkirkan dan

menghambat pertumbuhan mikroorganisme merupakan salah satu hal yang

penting dalam mikrobiologi. Disamping itu, kita juga harus mengetahui dan
mempersiapkan alat-alat yang dipakai dalam mensterilkan alat-alat yang akan

digunakan dalam praktikum yang merupakan hal yang melatarbelakangi

dilakukan percobaan sterilisasi dan penyiapan alat ini.

B. MAKSUD DAN TUJUAN PERCOBAAN

1. Maksud Percobaan

Untuk mengetahui dan memahami cara mensterilkan alat-alat

mikroorganisme dengan cara sterilisasi basah menggunakan autoklaf (uap air

bertekanan),air mendidih dan uap air.

2. Tujuan Praktikum

Untuk mengetahui cara-cara sterilisasi dengan menggunakan autoklaf (uap

air bertekanan),air mendidih dan uap air.

C. PRINSIP PERCOBAAN

Sterilisai basah menggunakan uap air panas bertekanan dengan prinsip

adanya tekanan akan memudahkan penetrasi panas kedalam sel bakteri sehingga

terjadi koagualsi (penggumpalan) protein bakteri.Alat atau bahan yang akan

disterilkan dimasukkan ke dalam autoklaf kemudian disterilkan pada suhu 121°C

selama 15-30 menit.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. DASAR TEORI

Sterilisasi dalam mikrobiologi ialah suatu proses untuk mematikan

semuaorganisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda atau daerah.

Ketika untuk pertama kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara

aseptic,sesungguhnya hal itu telah lama menggunakan salah satu cara sterilisasi

yaitu,pembakaran. Namun,kebanyakan peralatan dan media yang umum dipakai

di dalam pengerjaan mikrobiologi akan menjadi rusak bila dibakar. Untungnya

tersedia berbagai metode lain yang efektif. (Anonym, 2012).

Cara-cara sterilisasi dan desinfesi yaitu pembersihan,sinar matahari,sinar

ultraviolet,sinar-x,sinar gamma,pendinginan,dan pemanasan. Macam-macam cara

sterilisasi dengan pemanasan yaitu pemanasan dan nyala api,pemanasan dengan

udara panas (dry heat oven), merendam dalam air mendidih (menggondong),

pemanasan dengan uap air yang mengalir, dengan uap bertekanan (autoclave), dan

cara sterilisasi benda-benda yang tidak tahan suhu tinggi, misalnya

pasteurisasi,tyndalisasi,dengan penyaringan (filtrasi),dan dengan menggunakan

zat kimia (desinfektan). (Indan,2013).

Pematian mikroorganisme mendasari metode kerja mikrobiologi dan

pengawetan bahan makanan. Pembebasan suatu bahan dari mikroorganisme hidup

atau dalam stadium istirahatnya disebut sterilisasi.

 Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa :

a. Sterilisai secara fisik (pemanasan,penggunaan sinar gelombang pendek yanng

dapat dilakukan selama senywa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah

atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas digunakan

alat “bejana/ruang panas”(oven dengan temperatur 1700C-1800C dan waktu yang

digunakan adalah 2 jam yang umunya untuk peralatan gelas.

b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan menggunakan desinfektan,larutan

alkohol,dan larutan formalin)

c. Sterilisasi secara mekanik,digunakan untuk beberapa bahan akibat pemanasan

tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan misalnya adalah dengan

saringan/filter. Sistem pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap

partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba).(Suriawira,2006)

d. Sterilisasi dengan panas lembab biasanya dilakukan dalam suatu bejana logam

yang disebut autoklaf. Sterilisasi ini dilakukan dengan uap air jenuh bertekanan 15

lb/in2 (15 Psi/Pound square inch) selama ± 15 menit pada suhu 1210C. Suhu

tersebut merupakan suhu sterilisasi terbaik untuk bahan-bahan yang akan

disimpan dalam waktu yang cukup lama. Hubungan antara tekanan dan suhu

tersebut hanya berlaku bagi tempat-tempat pada permukaan laut. Untuk tempat-

tempat diatas permukaan laut diperlukan tekanan yang lebih tinggi untuk

mencapai suhu yang sama.

Sterilisasi dengan udara panas lembab/uap air meliputi:

1. Uap bertekanan

Sterilisasi termal menggunakan tekanan uap jenuh dilakukan dengan

sebuah autoklaf. Ini merupakan metode sterilisasi yang biasa digunakan dalam

industri farmasi, karena dapat diprediksi dan menghasilkan efek dekstruksi bakteri,

dan parameter-parameter sterilisasi seperti waktu dan suhu dapat dengan mudah

dikontrol dan monitoring dilakukan sekali dalam satu siklus yang divalidasi.

Secara umum, sterilisasi panas lembab dilakukan pada suhu 1210C di bawah

tekanan 15 psig. Pada suhu ini konsep letal dilakukan dengan F0 yang juga

dilakukan bila suhu sterilisasi berbeda dari 1210C. F0 dari proses ini tidak jauh

pada 1210C dengan waktu yang dibutuhkan, dalam menit, untuk menghasilkan

kematian yang setara dengan hasil pada 1210C pada waktu tertentu.

Metode ini tidak dapat digunakan untuk sterilisasi misalnya, produk yang

dibuat dari basis minyak dan serbuk. Uap jenuh pada 1200C mampu membunuh

secara cepat semua bentuk vegetatif mikroorganisme hidup dalam waktu ½ menit.

Uap jenuh ini dapat menghancurkan spora vegetatif yang tahan terhadap

pemanasan tinggi. Keefektifan sterilisasi uap bertekanan tergantung pada 4 sifat

dari uap jenuh kering yaitu:

a. Suhu

b. Panas tersembunyi yang berlimpah

c. Kemampuan untukmembentuk kondensasi air

d. Kontraksi volume yang timbul selama kondensasi

 Waktu yang dibutuhkan untuk mensterilkan larutan saat suhu 1210C

selama 12 menit, ditambah waktu tambahan untuk larutan dalam wadah untuk

mencapai 1210C setelah termometer menunjukkan suhu ini. Secara umum larutan

dalam botol 100-200 ml akan membutuhkan kurang 5 menit botol 500 ml antara

10-15 menit.

Panas lembab merupakan bentuk uap jenuh di bawah tekanan yang

merupakan cara sterilisasi yang paling banyak digunakan. Penyebab kematian

dengan cara sterilisasi panas terhadap lembab berbeda dengan cara panas kering,

kematian mikroorganisme oleh panas lembab adalah hasil koagulasi protein sel,

berbeda dengan cara panas kering, kematian mikroorganisme yang paling penting

adalah proses oksidasi.

USP menentukan sterilisasi uap sebagai penerapan uap jenuh di bawah

tekanan paling kurang 15 menitdengan temperatur minimal 1210C dalam jaringan

tekanan. Bentuk yang paling sederhana dari autoklaf adalah “home pressure

cooker”.

2. Uap panas pada 1000C

Uap panas pada suhu 1000C dapat digunakan dalam bentuk uap mengalir

atau air mendidih. Metode ini mempunyai keterbatasan penggunaan uap mengalir

dilakukan dengan proses sterilisasi bertingkat untuk mensterilkan media kultur.

Metode ini jarang memuaskan untuk larutan yang mengandung bahan-bahan

karena spora sering gagal tumbuh di bawah kondisi ini, bentuk vegetatif dari

kebanyakan bakteri yang tidak membentuk spora. Temperatur suhu titik mati

bervariasi, tetapi tidak ada bentuk non spora yang bertahan. Kesuksesan dari
proses ini bergantung pada spora yang berkembang ke bentuk vegetatif selama

masa istirahat.

3. Pemanasan dengan bakterisida

Ini menghadirkan aplikasi khusus dari pada uap panas pada 1000C.

Adanya bakterisida sangat meningkatkan efektifitas metode ini. Metode ini

digunakan untuk larutan berair atau suspensi obat yang tidak stabil pada

temperatur yang biasa diterapkan pada autoklaf. Larutan yang ditumbuhkan

bakterisida ini dipanaskan dalam wadah bersegel pada suhu 1000C selama 20

menit dalam pensterilisasi uap atau penangas air. Bakterisida yang dapat

digunakan termasuk 0,5% fenol, 0,5% klorbutanol, 0,2% kresol atau 0,002% fenil

merkuri nitrat saat larutan dosis tunggal lebih dari 15 ml larutan obat untuk injeksi

intratekal atau gastro intestinal sehingga tidak dibuat dengan metode ini.

4. Air mendidih

Penangas air mendidih mempunyai kegunaan yang sangat banyak dalam

sterilisasi jarum spoit, penutup karet, penutup dan alat-alat bedah. Bahan-bahan

ini harus benar-benar tertutupi oleh air mendidih dan harus mendidih paling

kurang 20 menit. Setelah sterilisasi bahan-bahan dipindahkan dan air dengan

pinset yang telah disterilisasi menggunakan pemijaran. Untuk meningkatkan

efisiensi pensterilan dari air, 0,5% fenol, 1-2% Na-carbonat atau 2-3% larutan

kresol tersaponifikasi yang menghambat kondisi bahan-bahan logam.

 BAB III

METODE KERJA

A. Alat Dan Bahan

Alat yang digunakan untuk sterilisasi panas basah adalah

 Autoclave

 Tabung Reaksi

 Beaker Gelas

 Spoit

Bahan yang digunakan untuk srelisasi panas basah adalah

 Aquades

 Media Peptone Water (PW)

 Media Sabourund Dextrose Agar (SDA)

 Nutrient Agar (NA)

B. Prosedur kerja

● Autoclave Tipe I :

1. Tempat air (sebaiknya mengguakan aquadest) diisi denga air .

2. Kompor dihidupkan (bisa berupa kompor miyak atau penangas air dengan

elemen listrik), ditunggu sampai terjadi penguapan.

3. Alat dan bahan yang akan disterilkan dalam erlenmeyer atau tabung gelas,haru

ditutup dengan kapas kemudian dengan kertas.

4. Tutup autoclave dipasang dan sekrup-sekrupnya dikencangkan

5. Kran pengatur pengeluaran uap air dibiarkan tetap terbuka sampai uap air

banyak keluar, maksudnya supaya didalam bejana hanya terdapat uap air kerja
 (semua udara terdesak keluar). Karena adanya udara (misalnya 10%) meski

teanan sudah 15lbs atau 1,5 s/d 2 atm temperature bari 120oC.

6. Setelah itu kran pengatur pengeluaran uap air ditutup sehingga tekanan uap

dalam autoklaf mencapai 121oC, didiamkan selama 15-30 menit. Autoklaf

ditunggu sampai tekanan menjadi nol sebelum dibuka kemudian dengan kran

pengatur pengeluaran dibuka perlahan-lahan.

● Autoclave Tipe II:

Autoclave tipe ini dilengkapi dengan tempat air,uap air panas yang

dimasukkan dengan saluran uap panas dari pembangkit uap.Cara kerja ini

pada prinsipnya sama dengan tipe pertama.

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Adapun hasil pengamatan pada praktikum ini adalah :

NO. Nama Alat Yang Disterilkan Cara/Prosedur Sterilisasi

1. Tabung Reaksi Sterilisasi basah menggunakan autoclave

●Tabung reaksi digunakan sebagai

tempat atau wadah media yang akan

disterilkan di autoclave.

2. Gelas Kimia/Beaker Gelas Sterilisasi basah menggunakan autoclave

●Gelas kimia/Beaker Gelas digunakan

sebagai tempat penyimpanan tabung

reaksi yang akan dimasukkan ke dalam

autoclave.
Media yang digunakan :

Media Cara Kerja

Peptone Water  Di timbang PW sebanyak 2 gram

dengan menggunakan timbangan

analitik. Kemudian dimasukkan

ke dalam gelas beker dan

ditambahkan air suling sebanyak

100 ml. Di aduk dengan

menggunakan batang pengaduk.

 Setelah PW larut dengan air

suling, di tetesi metil and blue

beberapa tetes hingga terbentuk

warna yang jelas.

 Setelah itu, dispoit dan

dimasukkan ke dalam tabung

reaksi sebanyak 5 ml (tabung

reaksi yang digunakan sebanyak 9

buah)

 Tabung reaksi yang telah berisi

larutan PW disumbat dengan

menggunakan kapas.

 Semua tabung reaksi dimasukkan

ke dalam gelas beker. Setelah itu

dimasukkan ke dalam autoklafe

untuk disterilkan.
Sabouraud Dextrose Agar  Ditimbang 6,5 SDA dilarutkan 100

ml

 Dimasukkan kedalam beaker gelas,

dilarutkan dengan aquadest sebanyak

100 ml.

 Diaduk, dinaikkan diatas api hingga

larut.

 Diambil tabung reaksi yang akan

disterilkan

 Larutan SDA dispoit dan di

masukkan ke dalam tabung reaksi

sebanyak 5 ml (tabung reaksi yang

digunakan sebanyak 18 buah)

 Tabung reaksi yang telah berisi

larutan NA disumbat dengan

menggunakan kapas.

 Semua tabung reaksi di masukkan ke

dalam gelas beker. Setelah itu di

masukkan ke dalam autoklafe untuk

di sterilkan.
Medium NA 1. Di timbang NA sebanyak 5 gram

dengan menggunakan timbangan

analitik. Kemudian di masukkan

ke dalam gelas beker dan

ditambahkan air suling sebanyak

100 ml. Diaduk dengan

menggunakan batang pengaduk

2. Setelah NA larut dengan air

suling, dipanaskan hingga sedikit

mengental.

3. Larutan NA dispoit dan di

masukkan ke dalam tabung reaksi

sebanyak 5 ml (tabung reaksi

yang digunakan sebanyak 18

buah)

4. Tabung reaksi yang telah berisi

larutan NA disumbat dengan

menggunakan kapas.

5. Semua tabung reaksi di masukkan

ke dalam gelas beker. Setelah itu

di masukkan ke dalam autoklafe

untuk di sterilkan.
B. Pembahasan

Sterilisasi dalam bidang mikrobiologi merupakan suatu upaya atau metode

yang bertujuan untuk membebaskanalat-alat atau bahan/sample secara lengkap

dari dekontaminasi segala macam bentuk kehidupan mikroorganisme lain.

Sterilisasi ini sangat penting dilakukan di dalam praktikum mikrobiologi,hal

ini dikarenakan agar bahan atau peralatan yang digunakan tersebut tidak di

dapatkan kehadiran mikroorganisme lain yang tidak diinginkan yang akan

mengganggu atau merusak media ataupun mengganggu kehidupan dan proses

yang sedang dikerjakan sehingga pelaksanaan praktikum dapat berjalan dengan

lancar.

Sterilisasi alat-alat laboratorium untuk pengamatan mikroba sebelum

digunakan adalah penting,cara yang salah satu digunakan adalah autoclave.

Autoclave adalah cara sterilisasi dengan menggunakan uap bertekanan

panas.Autoclave merupakan sebuah alat yang terdiri atas suatu bejana yang tahan

terhadap tekanan tinggi yang dilengkapi manometer (barometer), termometer dan

klab bahaya.Prinsip kerja alat ini sama dengan prinsip kerja kukusan hanya saja

memiliki tekanan sehingga menghasilkan panas yang lebih tinggi tinggi.

Dalam sterilisasi yang menggunaakan aautoclave kita menggunakan suhu

121°, ini dikarenakan pada suhu ini mikroorganisme sudah mati.Pada sterilisasi

alat dibutuhkan waktu 15-30 menit.

 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoclave uap yang mulai

diangkat dengan menggunakan uap air jenuh pada suhu 121°C selama 15 menit-

30 menit.Adapun alasan digunakannya suhu 121°C ini disebabkan oleh tekanan 1

atm pada ketinggian permukaan laut.Autoclave merupakan alat yang esensial

dalam setiap laboratorium mikrobiologi,ruang sterilisasi di rumah-rumah sakit

serta tempat-tempat lain yang memproduksi produk steril.Pada umumnya (tidak

selalu) autoclave dijalankan pada tekanan kira-kira 15-16 per (5 kg/cm2) pada

suhu 121°C.Waktu yang diperlukan untuk sterilisasi bergantung pada sifat bahan

yang disterilkan,tipe wadah dan volume wadah.

B. Saran

Pada saat melakukan praktikum, sebaiknya para praktikan betul-betul

memperhatikan setiap alat yang akan disterilkan dan bahan yang akan digunakan

agar mendapat hasil praktikum yang maksimal.Dan pada saat proses sterilisasi

harus selalu menjaga dan mengawasi autoklaf hingga mencapai suhu ketentuan.

Diharapkan untuk semua praktikan dapat mengetahui teknik dan cara-cara

sterilisasi menggunakan autoklafe termasuk penggulungan kapas dan melipat

kertas pada alat-alat yang akan disterilkan.

 DAFTAR PUSTAKA

Sesilia, dkk. 2017. Penuntun Praktikum Mikrobiologi dan Umum PKM

Makassar.

Hadioetomo. Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: P.T.
Gramedia Pustaka Utama

Lay dan Hatowo. 1992. Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada,
Jakarta

Ratna, 1985. Mikrobiologi Dasar. Gramedia. Jakarta

Dwijoseputro. 1990. Dasar-dara Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.

Suriawiria., Unus. 1995. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung: Angkasa

LAMPIRAN