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PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS
DE LA RED NACIONAL
DE TOXOPLASMOSIS
Niveles I, II y III
AUTORES:
Dr. Sergio MOLLINEDO
Dr. José SANTALLA
Tec. Sup. Pamela DURAN
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CONTENIDO
DEFINICIÓN
ESTRUCTURA
LABORATORIO NIVEL I:
LABORATORIO NIVEL II
OBTENCIÓN DE MUESTRA
Obtención de sangre por punción venosa
Obtención de sangre por punción capilar
Uso de anticoagulantes
REGISTRO DE MUESTRAS
CENTRIFUGACIÓN DE MUESTRAS
TRANSPORTE DE MUESTRAS
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III. PROCEDIEMIENTOS TECNICOS
AGLUTINACIÓN DIRECTA
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Pricipios y fundamento
Material, reactivos y equipos
Control
Procesamiento
Lectura e interpretación
Fuentes de error
Reporte y liberación de resultados
IV. BIBLIOGRAFÍA
GLOSARIO
ANEXOS
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I. ESTRUCTURA Y REGLAMENTO DE LA RED
NACIONAL DE LABORATORIOS DE DIAGNOSTICO
DE TOXOPLASMOSIS:
DEFINICIÒN:
ESTRUCTURA:
Laboratorios de Nivel
Laboratorios de Nivel II
Laboratorios de Nivel III
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LABORATORIOS DE NIVEL I.
EFECTUAN:
1. Funciones Técnicas:
Toma, envió y desecho de muestras
Registro de la muestra
Obtención del suero o plasma
Técnica de Aglutinación Directa (AD)
Técnica de Hemoaglutinación Indirecta (HAI)
Información a la comunidad
Envió de muestras a nivel superior de la red.
2. Funciones administrativas:
Envió de informes al Laboratorio Departamental.
Envió de sueros problema para confirmación diagnostica a
nivel superior de la Red.
Envió de sueros para el control de calidad
Solicitud y requerimientos
DEPENDENCIA Y OBLIGACIONES:
OBLIGACIONES:
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Enviar oportunamente la solicitud de requerimientos para el
cumplimiento de sus funciones
Participar en las actividades de reciclaje, capacitación e
información determinadas por el Laboratorio departamental o
la Red nacional
PERSONAL:
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LABORATORIOS DE NIVEL II
EFECTUAN:
1. Funciones Técnicas:
Técnica de Enzimo inmuno ensayo Toxoplasmosis para
detección de Ig. M
Técnica de Enzimo inmuno ensayo Toxoplasmosis para
detección de Ig. G
Hemoaglutinación semi cuantitativa
2. Funciones Administrativas:
Capacitación
Supervisión Directa e Indirecta
Evaluación
Coordinación con e Laboratorio Nacional de Referencia
Envió de Información al Laboratorio Nacional de Referencia.
Envió de sueros problema para confirmación diagnostica a
nivel superior de la Red.
Envío de sueros para el control de calidad
Programar los requerimientos e insumos en su región.
DEPENDENCIA Y OBLIGACIONES:
OBLIGACIONES:
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Confirmar el diagnóstico y titulación de los sueros problemas
enviados por laboratorios periféricos.
Cumplir con el envió de sueros positivos y negativos para el
control de calidad al Nivel III
PERSONAL:
MATERIAL Y EQUIPOS:
Equipo:
Lector de ELISA
Incubadora
Material:
Kit Diagnostico Enzimo inmunoensayo toxoplasmosis Ig. M
Kit Diagnostico Enzimoinmunoensayo toxoplasmosis Ig. G
Kit Diagnostico Hemaglutinación Inrecta Semicuantitativo
Tubos de hemolisis
Tips
Micropipetas
Hipoclorito de Sodio al 0,5% (lavandina)
Guardapolvo
Guantes
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LABORATORIOS DE NIVEL III:
FUNCIONES:
1. Funciones Técnicas:
Inmunofluorescencia Indirecta
ISAGA Ig. M
PCR
INMUNOBLOT
2. Funciones Administrativas:
DEPENDENCIA Y OBLIGACIONES:
OBLIGACIONES:
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Ejecutar sistemas de control de calidad interno y externo.
Supervisar directa e indirecta de Laboratorios dependientes de
la red.
Diseñar programas de capacitación
Diseñar sistemas de Evaluación Nacional
Elaborar informes escritos de control de calidad nacionales y
departamentales.
Programar actividades nacionales e internacionales
PERSONAL:
MATERIAL Y EQUIPOS:
Equipo:
Microscopio de inmunofluorescencia.
Campana de flujo laminar
Centrifugadoras
Estufas de cultivo
Heladeras
Aparato de hibridación
Balanza de precisión
Vortex
Agitador magnético
Container de Nitrógeno líquido
Campana de extracción
Cámara Húmeda
Material:
Guantes
Secador de cabello
Portaobjetos especiales IFI
Cubreobjetos 24 x 48mm
Jarras Koplin
Vasos de precipitado
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Frasco gotero
Papel filtro
Micropipetas
Tips
Tubos de hemólisis
Gradillas
Reactivos:
Solución Buffer fosfato salina Ph 7,2 (PBS)
Antígeno Toxoplasma gondii
Anti gamma globulina Humana marcada con
isotiocianato de fluorescenina o conjugado.
Azul de Evans
Solución de montaje.
Kit ISAGA
Kit PCR
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II. PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS PATRON
(POPs)
OBTENCIÓN DE MUESTRA
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ANTISÉPTICO: Alcohol al 70%
TORNIQUETE: Aplicar por el lapso de un minuto y liberarlo
después de la punción.
AGUJAS Y JERINGAS DESECHABLES: Estériles, de volumen
entre 3 a 5 ml. Con agujas Nº 21 a 23G , en niños se recomienda
aguja mariposa Nº 21 a 23G.
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Recomendaciones:
En el informe indicar el tipo de punción realizada.
No se debe usar agujas para jeringa.
USO DE ANTICOAGULANTES
REGISTRO DE MUESTRAS
Debe existir un libro de registros en los que se inscriba los datos del
paciente como:
Nombre completo
Edad
Sexo
Procedencia
Antecedentes clínicos de la enfermedad:
Antecedentes gineco obstétricos (Menarca, gesta, para, abortos,
FUM)
Tipo de prueba a realizarse
Bajo las siguientes condiciones las muestras no deben ser aceptadas para
su análisis:
Identificación inadecuada o falta de identificación
Muestras hemolizadas
Transporte inadecuado (ejemplo: tapones mojados, tubos rotos,
no refrigerados, muestras no conservadas)
Ordenes de examen que no contengan todos los datos: nombre,
edad, sexo, procedencia y antecedentes clínicos de la
enfermedad, en casos de mujeres embarazadas tiempo de
gestación y antecedentes gineco obstétricos.
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CENTRIFUGACIÓN DE MUESTRAS
TRANSPORTE DE MUESTRA
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ENTREGA DE INFORME DE RESULTADOS
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- Nivel I: HAI, AD
- Nivel II: HAI, ELISA
- Nivel III: HAI; ELISA; ELISA inverso, ISAGA, PCR,
INMUNOBLOT
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b) En el producto de la gestación: Si el diagnóstico de infección
materna se confirma lo más importante es precisar si existe o no
infección fetal; el riesgo de contaminación fetal cuando la madre a
tenido una seroconversión en su embarazo varia de 5 a 80%
dependiendo de la fecha de contaminación, por lo tanto toda primo
infección de la embarazada debe hacernos proponer un diagnóstico
antenatal y si no se realiza este, deberá realizarse un abanico de
pruebas al nacimiento del niño, seguido de un control periódico
serológico que permita confirmar o desestimar el diagnóstico de
infección congénita.
Para este efecto el Nivel I tendrá que remitir el paciente a un nivel de
mayor complejidad para que se realicen un abanico de pruebas que
permitan emitir un diagnóstico mediante:
Diagnóstico antenantal:
amniocentesis
Cordonocentesis
Diagnóstico posnatal:
sangre del niño para buscar IgM o IgA anti-Toxoplasma,
por medio de ELISA, western blot o ELIFA.
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d) En el Inmunodeprimido: En este tipo de pacientes conviene
identificar sobre todo a los sujetos en riesgo de reactivar una
Toxoplasmosis anteriormente adquirida, una quimioprofilaxis
específica es recomendada cuando existe una inmunodepresión
importante.
Se recomienda la utilización de técnicas serológicas las más
sensibles.
DISPOSICIONES REGLAMENTARIAS
1) Todo Examen deberá precisar el umbral de positividad del reactivo
7) En caso de un resultado que sea límite (se aproxime al umbral), una nueva
muestra de control se aconseja a los 21 días (3 semanas).
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III. PROCEDIEMIENTOS TECNICOS
La mayor utilidad del test específico para IgM es para determinar si una
mujer embarazada no se ha infectado recientemente. Una prueba negativa
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para IgM en una mujer embarazada descarta virtualmente una infección
reciente.
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AGLUTINACIÓN DIRECTA
Principio:
Es una técnica simple que posibilita la detección cualitativa de
anticuerpos en suero o plasma.
Los anticuerpos tanto IgG como IgM se detectan mediante una reacción
inmunológica de aglutinación, utilizando el reactivo látex que posee anti
IgG y anti IgM absorbidas sobre las partículas de látex.
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HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
Fundamento:
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define la infección aguda aunque en ocasiones, cuando su concentración
es baja, esto no es cierto. La versión ELISA con captura de cadena pesada
es más sensible y específica ya que no tiene interferencias con el F.R. De
igual diseño que el anterior es la prueba de ISAGA-IgM empleando como
antígeno toxoplasmas enteros. Es muy sensible.
Interpretación de resultados :
La reacción es considerada reactiva cuando forma una malla o red de
bordes irregulares con 50 a 100% de aglutinación.
La reacción es considerada negativa cuando los hematíes se depositan en
el fondo de la placa formando un botón de eritrocitos no aglutinados.
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ENZIMOINMUNOENSAYO CLÁSICO DE TOXOPLASMOSIS (IgG)
I. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS
a. Material:
- Cuaderno de Registro
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- Guantes desechables
- Placas de tiras microelisa recubiertas con Ag de T. gondii
- Precintos para placas
- Micropipeta automática graduable de 4 a 200ul
- Micropipeta multicanal automática
- Tips
- Tubos de ensayo
- Cronómetro
- Papel absorbente
- Recipientes de desechos, biológicamente peligrosos, para los
materiales potencialmente contaminados.
b. Reactivos
- Agua destilada o desionizada
- Conjugado: Liofilizado de antigammaglobulinas G marcadas con
HRP.
- Control Negativo: Suero humano, no reactivo a anti-toxoplasma IgG.
- Calibrador 1: Suero humano. Fuertemente reactivo para anticuerpos
anti-toxoplasma IgG.
- Calibrador 2: Suero humano. Moderedamente reactivo anti-
toxoplasma IgG.
- Tampón fosfato concentrado
- Solución TMB (tetrametilbencidina en ácido cítrico)
- Solución de peróxido de urea
- Ácido sulfúrico 1 mol/l para análisis
c. Equipo
- Lector de microplacas (espectrofotómetro para microplacas con filtro
de 405nm)
- Incubador (seco o humedecido) o baño maría a 37 2°C.
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b. Control:
Los calibradores y controles deben incluirse en cada prueba.
El valor de absorbancia del calibrador 1 debe ser al menos de 0.4
cuando se lee frente al blanco.
El valor de absorbancia del blanco debe ser menor de 0.35.
El control negativo debe presentar un valor inferior de 27 IU/ml y
un índice menor de 0.9.
El control positivo debe presentar un valor de índice dentro del
rango indicado en el vial.
IV. PROCEDIMIENTO
a. Preparación de reactivos:
Atemperar todos los reactivos y muestras antes de usar. Devolverlas
pronto al frigorífico después de usar.
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12. Leer y anotar la absorbancia del contenido de cada pocillo a 405
nm frente a blanco. Las lecturas deben realizarse dentro de las 2
horas después de que la reacción se detuvo.
V. LECTURA E INTERPRETACIÓN
a. Lectura:
- Hacer blanco al aire sin la placa y leer la absorbancia de la solución
de cada pocillo a 450 5 nm (longitud de onda única).
b. Cálculos:
Punto Final: (calibrador 2) : Determinar el valor del índice o IU/ml para
cada muestra (o control) usando la fórmula siguiente:
c. Interpretación:
El Toxoplasma gondii es un parásito ubicuo en el humano y los
animales. La mayoría de las infecciones en el humano pasan
inadvertidas, aunque, en algunos casos, la enfermedad pueda tener un
carácter benigno o más grave y de larga duración. No obstante si una
mujer embarazada está infectada, el parásito Toxoplasma puede pasar
por la placenta e infectar al feto. Estas infecciones congénitas pueden
tener consecuencias muy serias, en algunos casos, incluso el aborto o
el mortinato.
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permanecer en algunos pacientes por el lapso de un año o más, es
mejor realizar dos controles con 21 días de diferencia. El aumento de la
tasa de Inmunogobulinas es indicativa de una infección reciente.
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Cuando se obtienen valores equívocos, se debe obtener otra muestra
dos o tres semanas después y valorarla de nuevo en paralelo con la
muestra inicial.
I PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS
La prueba Human Elisa Toxo IgG esta basada en la clásica técnica ELISA.
Los micropocillos ELISA son recubiertos con antígenos de Toxoplasma
preparados con parásitos sonicados Toxoplasma gondii (taquizoitos). En la
primera etapa la incubación , los anticuerpos anti TOXO , contenidos en la
prueba o el control se fijan específicamente a los antígenos inmovilizados. Al
final de la incubación los componentes excesivos son eliminados por lavado.
En la segunda etapa de incubación se añade un conjugado anti IgG
(anticuerpos anti-IgG-humana marcados con peroxidasa) que se fijan
específicamente a los anticuerpos IgG. Se forman inmunocomplejos típicos.
Después de eliminar el conjugado excesivo por lavado y añadir TMB /
substrato (etapa 3) , se forma un color azul que se transforma a amarillo
después de parar la reacción. La intensidad de este color es directamente
proporcional a la cantidad de anticuerpos anti- TOXO IgG en la muestra.
a. Material:
- Cuaderno de Registro
- Guantes desechables
- Placas de tiras microelisa recubiertas con Ag de T. gondii
- Precintos para placas
- Micropipeta automática graduable de 4 a 200ul
- Micropipeta multicanal automática
- Tips
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- Tubos de ensayo
- Cronómetro
- Papel absorbente
- Recipientes de desechos, biológicamente peligrosos, para los
materiales potencialmente contaminados.
b. Reactivos
- Agua destilada o desionizada
- Conjugado: Anti-IgG-humano, marcado con peroxidasa (conejo).
- Control Negativo: Suero humano, no reactivo a anti-toxoplasma IgG.
- Control Cut off
- Control positivo IgG alto, medio y bajo.
- Buffer de dilución IgG.
- Reactivo substrato A y B. Solución TMB (tetrametilbencidina en
ácido cítrico)
- Solución de lavado.
- Ácido sulfúrico 1 mol/l para análisis
c. Equipo
- Lector de microplacas (espectrofotómetro para microplacas con filtro
de 450nm)
III PROCEDIMIENTO.-
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ENZIMOINMUNOENSAYO TOXOPLASMOSIS (IgM)
I. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS
a. Material:
- Cuaderno de Registro
- Guantes desechables
- Placas de tiras microelisa recubiertas con IgM anti-
humana (oveja)
- Precintos para placas
- Micropipeta automática graduable de 5 a 200ul
- Micropipeta multicanal automática
- Tips
- Tubos de ensayo
- Cronómetro
- Papel absorbente
- Recipientes de desechos, biológicamente peligrosos, para
los materiales potencialmente contaminados.
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b. Reactivos
- Agua destilada o desionizada
- Antígeno/conjugado: Antígeno toxoplasma y anti-toxoplasma (de
oveja) marcado con HRP liofilizado.
- Control Negativo: Suero humano, no reactivo a anti-toxoplasma
IgM.
- Control positivo: Suero Humano reactivo a anti-toxoplasma IgM
- Control fuertemente positivo: Suero bovino conteniendo
anti.toxoplasma IgM (monoclonal humano)
- Tampón fosfato concentrado
- Solución TMB (tetrametilbencidina en ácido cítrico)
- Solución de peróxido de urea
- Ácido sulfúrico 1 mol/l para análisis
c. Equipo
- Lector de microplacas (espectrofotómetro para filtro de 405nm)
- Incubador (seco o humedecido) o baño maría a 37 2°C.
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IV. PROCEDIMIENTO
a. Preparación de reactivos:
V. LECTURA E INTERPRETACIÓN
a. Lectura:
- Hacer blanco al aire sin la placa y leer la absorbancia de la solución
de cada pocillo a 450 5 nm (longitud de onda única).
b. Cálculos:
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Punto Final: (calibrador 1 o calibrador 2) : Determinar el valor del índice
o IU/ml para cada muestra (o control) usando la fórmula siguiente:
c. Interpretación:
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- Esta destinado solo a la detección de anticuerpos IgM frente al
Toxoplasma gondii.
- Existen algunas sustancias interferentes que podrían afectar la
interpretación de los resultados.
- Se recomienda volver a analizar las muestras que resulten
reactivas después de 21 días (3 semanas).
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INMUNOFLUORESCENCIA TOXOPLASMOSIS
I. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS
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- Tubos de hemólisis
- Gradillas
b. Reactivos:
- Solución Buffer fosfato salina Ph 7,2 (PBS)
- Antígeno fijado a portaobjetos
- Antigammaglobulina Humana marcada con isotiocianato
de fluoresceina o conjugado.
- Azul de Evans
- Solución de montaje.
c. Equipos:
- Microscopio de inmunofluorescencia.
- Estufa de cultivo
- Heladera
- Cámara Húmeda
III. CONTROL
IV. PROCEDIMIENTO
- Sacar los portaobjetos con los antígenos de la heladera y dejar que
sequen en papel filtro.
- Diluir los sueros control positivo y negativo en PBS a 1:32.
- Diluir los sueros problema a partir de 1:16
- Colocar una gota de cada una de las soluciones en las divisiones de
la placa incluyendo los controles positivos y negativo.
- Incubar los portaobjetos en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos
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- Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, cada vez por 5 minutos.
- Secar los portaobjetos con corriente de aire frío .
- Diluir el conjugado de acuerdo a su título en azul de Evans.
- Colocar una gota del conjugado diluido en cada una de las
divisiones del portaobjeto.
- Incubar los porta objetos en cámara húmeda a 37°C por 30
minutos.
- Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, cada vez por 5 minutos.
- Secar los portaobjetos con corriente de aire frío .
- Colocar los cubreobjetos con el líquido de montaje.
V. LECTURA E INTERPRETACIÓN
a. Lectura:
- Leer en microscopio de inmunofluorescencia.
- Hacer la lectura de los testigos antes que los sueros problemas.
- La fluorescencia es particularmente intensa en la membrana del
parásito.
- La dilución diagnóstica para esta prueba corresponde a 1:32 por lo
que cualquier título igual o superior se considera como positivo.
b. Interpretación:
- La IFI como cualquier otra prueba de diagnóstico serológico, no
puede ser concebida como un método de diagnóstico definitivo,
por lo tanto todo resultado debe ser interpretado como una
probabilidad mayor o menor de acierto en relación al caso
estudiado dentro de una población normal o parasitada.
- Los individuos parasitados por T. gondii infectados después del
nacimiento suelen dar resultados positivos para IFI antes que en
la HAI, esto porque el antígeno utilizado en la IFI es de superficie.
En los recién nacidos infectados dentro del útero la reacción
positiva puede demorarse un tiempo en aparecer , sin embargo
también hará su aparición antes que la HAI.
- Los infectados en más del 95% de los casos suelen dar títulos de
1:16 o mayores, a pesar de esto la línea de corte se ha fijado a
una dilución 1:32 porque a diluciones menores suelen presentarse
reacciones cruzadas con otras parasitosis.
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- Las personas presumiblemente no parasitadas, en el 95% de los
casos no superan la dilución de 1:8, este título tiende a aumentar
en personas de bajo nivel socio-económico, en las que el título
puede alcanzar a 1:16 pero en ningún caso es mayor.
- Un suero reactivo a título 1:8 no podrá ser considerado como
negativo si es que se sospecha una toxoplasmosis de transmisión
congénita ya que en esta caso se deberá repetir la prueba a los 30
días
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BIBLIOGRAFÍA
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GLOSARIO
42
ANEXO
LABORATORIO DE ZOONOSIS PARASITARIAS
DIAGNOSTICO DE TOXOPLASMOSIS
Nombre: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Edad: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procedencia: . . . . . . . . . . . . .
Médico Tratante: . . . . . . . . . . . . . . . . Folio: . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fecha toma de muestra: . . . . . . . . . . . Fecha resultado: . . . . . . . . . .
Impresión diagnóstica: . . . . . . . . . . . .
Examen solicitado: . . . . . . . . . . . . . . .
B) HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA:
Inmunoglobulina G (IgG):
Inmunoglñobulina M (IgM):
FIRMA
Responsable del laboratorio
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Control serológico de la embarazada para la prevención de la toxoplasmosis
a
Ante un título estable de IgG, o en espera de que transcurran las 3-4 semanas para la
obtención de la 2ª muestra, podemos determinar la avidez de las IgG, efectuar una
determinación de IgA anti-Toxoplasma y valorar todos los factores de probabilidad de
toxoplasmosis, cuya positividad incrementará el grado de probabilidad de infección aguda:
antecedente de adenopatías
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Pauta de actuación ante un recién nacido con sospecha de infección congénita (TC).
a
La presencia de calcificaciones cerebrales, hidrocefalia o coriorretinitis en el recién nacido (RN), es muy
sugestiva de toxoplasmosis congénita (TC). Hay que considerar la posibilidad de efectuar PCR o aislamiento
del parásito en LCR, sangre u orina. La positividad de cualquiera de estas técnicas, confirmará el diagnóstico
de TC. En el RN asintomático se realizará el seguimiento serológico según el algoritmo propuesto.
b
Es muy importante no efectuar la determinación en sangre de cordón, para evitar la contaminación con IgM
maternas.
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Toxoplasmosis (Toxoplasma gondii)
Test en suero para detectar la presencia de anticuerpos anti Toxoplasma – IgG específicos
Ig G Negativo : Ig G Positivo:
No infectada Infectada
IgG Positivo
IgM Positivo: IgG Positivo
1. Infección dentro de IgM Negativo:
los últimos 2 años, o Infectado por más de 1
2. Falso positivo IgM año
46
LABORATORIO NACIONAL DE PARASITOLOGÍA
PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD
RED NACIONAL DE DIAGNOSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS (2003)
2. RESULTADO DE SU PARTICIPACIÓN:
TÉCNICA AD HAI ELISA IFI OTROS
Total de muestras
Positivo Ig. G (tasa)
Positivo Ig. M (tasa)
Negativo Ig. G
Negativo Ig. M
3. ERRORES ENCONTRADOS:
Informe de resultado falso negativo
Informe de resultado falso positivo
Resultados con solo una técnica serológica
Solamente determinación de Ig G
Falta de titulación de la muestra
Contaminación de la muestras
Resultados sin interpretación
4. RESULTADOS:
Control positivos Control negativos TOTAL
Laboratorio positivos
Laboratorio negativos
TOTAL
SENSIBILIDAD: %
ESPECIFICIDAD: %
VALOR PREDICTIVO POSITIVO: %
VALOR PREDICTIVO NEGATIVO: %
5.- COMENTARIO:
La Paz, ...............................de 2003
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UNIDAD DE PARASITOLOGÍA Y MEDICINA TROPICAL (UPAMET)
RED NACIONAL DE DIAGNOSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS (2003)
PRIMERA REUNIÓN
PROGRAMA
Lugar: Auditórium INLASA
Diagnóstico Clínico
Diagnóstico Biológico (Métodos Directos e Indirectos)
HAI
ELISA
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