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JUAZEIRO – BA
2016
UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB)
JUAZEIRO - BA
2016
MARCIA FERREIRA QUEIROZ
Comissão Examinadora
__________________________________________
___________________________________________
__________________________________________
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, José Carlos Queiroz e Ana Paula Mª Ferreira, e irmãos, pelo
simples fato de existirem em minha vida, o que me dá força e determinação
para superar as dificuldades e alcançar meus objetivos, com muito amor
agradeço!
A Samuel, por estar ao meu lado em muitos momentos difíceis, pela paciência
e por todo cuidado com o “nosso pequeno”.
A minha orientadora, Ana Rosa Peixoto, não apenas pela orientação, mas pela
amizade, compreensão, paciência e constante apoio desde a graduação, com
muito carinho agradeço!
SUMÁRIO
pág.
RESUMO GERAL.............................................................................................vii
GENERAL ABSTRACT....………....................................................................viii
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................10
2.2. Podridão-mole..........................................................................................14
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................27
OBJETIVOS......................................................................................................40
CAPÍTULO I......................................................................................................41
RESUMO...........................................................................................................42
DESENVOLVIMENTO.......................................................................................42
REFERÊNCIAS.................................................................................................46
CAPÍTULO II.....................................................................................................49
RESUMO..........................................................................................................50
ABSTRACT......................................................................................................50
vi
INTRODUÇÃO..................................................................................................51
MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................53
RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................68
CONCLUSÃO...................................................................................................65
REFERÊNCIAS.................................................................................................65
CONCLUSÕES GERAIS..................................................................................71
vii
RESUMO GERAL
GENERAL ABSTRACT
evaluated where as the bioactivity of Pcb in vitro and control of soft-rot in kale,
applied before or after inoculation, in the greenhouse. The oils of clove (0,25%),
citronella (0,75%), bergamot (1%), rosemary (1%), palmarosa (0,5%), sage
(1%), melaleuca (0,75%) and lemongrass (0,5%) completely inhibited the
growth of Pcb. The MIC lemongrass oil was 0,0625% and that of
citral,0.03125%, was the least used. As for clove oil, the MIC was 0.125% and
EA did not present MIC in any of the concentrations used. In general,
treatments with essential oils of lemongrass at 0,5% and clove at 0.25%
showed the best results in controlling the disease. Lemongrass oil (0,5%)
promoted an incidence (INC) of 0%, providing a percentage of disease control
of 100%, in both periods. The clove oil (0,25%) showed lower INC (25%) when
applied after inoculation, promoting a control percentage of 71,42%. In
experiments in vivo, using different concentrations of clove oil, lemongrass,
citral and EA, it was found that lemongrass oil at 0,125% (post-inoculation) and
citral at 0,125%, in both periods, provided the highest percentages of disease
control (33,33; 50 and 100%, respectively). The clove oil at 0,125% (post-
inoculation) showed higher efficiency than EA (0, 25%), promoting a percentage
of disease control of 16,67%. Thus, the findings of this study show the
effectiveness of essential oils of lemongrass and clove, suggesting that the
citral is primarily responsible for bactericidal activity and / or resistance inducer
of the lemongrass oil. As for clove oil, it is believed that their action is related to
the synergistic action of its chemical constituents. These oils are shown as a
promising option for the development of possible phytosanitary products to be
integrated into the management of soft rot, reducing the use of agrochemicals
and contributing to reduction of resistant microorganisms and preservation of
the environment.
10
de plantas cultivadas ou invasoras (CHARKOWSKI, 2015; MARINGONI, 2005),
e disseminação por diversos meios (ELPHISTHONE & PÉROMBELON, 1986,
HADAS et al., 2001; MARINGONI, 2005; PÉROMBELON & KELMAN, 1980).
Portanto, a identificação de novos hospedeiros do patógeno é fundamental,
podendo gerar implicações epidemiológicas importantes, que poderão ser
fundamental para o estabelecimento de estratégias de manejo da doença.
O controle de doenças bacterianas deve ser conduzido combinando-se
diversas medidas. Nos últimos anos, a preocupação crescente com as
questões ambientais e saúde da população tem impulsionado a busca por
alternativas de controle sustentáveis que possam ser integradas ao manejo de
doenças de plantas. Nesse contexto, os óleos essenciais têm sido utilizados
em várias pesquisas que validam sua eficácia no controle de fitopatógenos
(AMORIM et al., 2011; GUERRA et al., 2014; SOTELO-BOYÁS et al. 2015; LA
TORRE et al., 2016).
Diante do exposto, os objetivos desse estudo foram: a) realizar
levantamento de bactérias pectinolíticas do gênero Pectobacterium associadas
à podridão-mole em couve-manteiga e b) verificar o efeito de óleos essenciais
no crescimento in vitro de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, bem
como no controle da podridão-mole, em plantas de couve-manteiga.
2. REVISÃO DE LITERATURA
11
(MADEIRA; REIFSCHNEIDER; GIORDANO, 2008), sendo popularmente
conhecida no país como couve-manteiga, couve-comum e couve-de-folhas
(TRANI et al, 2015 ).
A couve-manteiga é uma planta herbácea, com caule sublenhoso e
vertical, emite continuamente novas folhas em seu ápice e numerosos brotos
na axila das folhas. A parte comestível são as folhas, que não formam
“cabeça”, sendo distribuídas ao redor do caule, em forma de “roseta” e
apresentam limbo foliar bastante desenvolvido, com pecíolo longo e nervuras
bem destacadas (FILGUEIRA, 2000, 2008; VIERA, 2006). No Brasil, é cultivada
o ano todo, raramente produz pendão floral, apresenta certa tolerância ao
calor, permanecendo produtiva durante vários meses (BEZERRA et al., 2005).
A propagação pode ser realizada por sementes ou por mudas, dependendo da
cultivar, sendo a propagação vegetativa realizada a partir dos brotos que
surgem nas axilas das folhas (TRANI et al., 2015). A colheita é realizada 90
dias aproximadamente após o transplantio, quebrando-se as folhas no pecíolo,
rente ao caule, deixando folhas menores em crescimento (FILGUEIRA, 2008).
O consumo da couve-manteiga no Brasil tem aumentado gradativamente
devido, principalmente, às recentes descobertas da ciência quanto as suas
propriedades nutracêuticas e às novas maneiras de utilização na culinária
(NOVO et al, 2010), podendo ser consumida in natura ou minimamente
processada, também em sucos, salgados e doces, apresentando bons teores
de fibras, vitaminas B1, B2 , B3, ácido ascórbico e minerais, como cálcio, ferro,
fósforo e potássio (Tabela 1), além de compostos bioativos como o
glicosinolato e os bioflavonoides, substâncias consideras preventivas ao câncer
(APAK et al., 2007; SEBRAE, 2008; TACO, 2011).
12
Tabela 1. Composição nutricional da couve-manteiga crua para 100 gramas de
parte comestível.
13
NECHET; ARAÚJO, 2010; TRANI et al, 2015 ), que ocorre principalmente em
cultivos de verão, pois a doença é favorecida por alta temperatura e alta
umidade (LOPES; QUEZADO-SOARES,1997), podendo causar grandes
prejuízos econômicos em espécies dessa família (SILVA et al., 2007).
Segundo Silva et al. (2007), no ano de 2004, em levantamento sobre a
podridão-mole em couve-chinesa nas mesorregiões da Mata e Agreste
pernambucanos, a prevalência da doença foi constatada em 100% das áreas
produtoras, com incidência variando de 1 a 67%.
Nas brássicas, a podridão-mole é comumente causada por
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Hauben et al (Sin,
Erwinia. carotovora subsp. carotovora (Jones) Bergey et al.) (FILGUEIRA,
2008; LOPES; QUEZADO-SOARES,1997; MARIGONI, 2005), subespécie que
é mais disseminada nos solos brasileiros (LOPES; QUEZADO-SOARES,1997).
No entanto, o gênero Pectobacterium é composto por uma diversidade de
espécies e subespécies (DUARTE et al., 2004; HAUBEN et al. 1998; GARDAN
et al. 2003; SAMSON et al., 2005; NABHAN et al., 2013), cuja maioria não tem
especificidade, podendo infectar ampla gama de hospedeiros, e uma mesma
planta pode ser infectada por diferentes espécies ou subespécies do gênero
(MARIANO et al, 2005; SILVA, 2012), como exemplo, P. carotovorum subsp.
odoriferum (Gallois et al.) Hauben et al. (SEO et al., 2004) e P. atrosepticum
(Van Hall) Hauben et al. (DE BOER et al., 1987) já foram relatadas em couve-
chinesa (Brassica pikinensis L.)
2.2. Podridão-mole
14
L.), cebolinha (Allium fistulosum L.), chicória (Cichorium spp.), couve-chinesa,
pimentão (Capsicum annuum L.) e couve-manteiga (DANA;
KHODAKARAMIAN; ROUHRAZI, 2015; DUNG; JOHNSON; SCHROEDER,
2012; FILGUEIRA, 2008; GASIC et al., 2013; HALFELD-VIEIRA; NECHET,
2008; HIBAR; DAAMI-REMADI; EL MAHJOUB, 2007; LOPES; QUEZADO-
SOARES,1997; MACAGNAM; ROMEIRO; SCHURT, 2008; MOLELEKI et al.,
2013; NAZERIA et al., 2011; PITMAN; HARROW; VISNOVSKY, 2010;
TEBALDI; MOTA, 2014; WALERON; WALEWRON; LOJKOWKA, 2014),
ocasionando perdas que podem ocorrem no campo durante o desenvolvimento
da cultura e colheita, bem como no transporte e armazenamento de produtos
(VAN DER MERWE et al., 2010; LEE et al., 2014).
Isolados bacterianos do gênero Pectobacterium são gram-negativos,
anaeróbicos facultativos, baciliformes, móveis por flagelos peritríquios e não
formadores de esporos (PÉROMBELON; KELMAN, 1980; KWON et al., 2000;
SCHAAD; JONES; CHUN, 2001). Todas as espécies são oxidase negativas e
catalase positivas, apresentando crescimento ótimo entre 28-30 °C
(SCHAAD; JONES; CHUN, 2001; PÉROMBELON et al., 2002).
Em meio de cultura nutriente-dextrose-ágar a 28-30º C, formam colônias
pigmentadas de coloração creme, opacas, circulares ou ameboides, com
bordos irregulares e de aproximadamente 1,5 a 3,0 mm de diâmetro
(JABUONSKI; TAKATSU; REIFSCHNNEIDER, 1986). Em meio caseína ácida-
peptona-glicose-ágar (CPG), sob iluminação oblíqua, as colônias jovens de
pectobactérias apresentam um aspecto de “vidro quebrado” (KELMAN;
DICKEY, 1995). As colônias também possuem como característica a formação
de uma protuberância no centro, formando o aspecto de um “ovo frito”,
podendo ser melhor visualizadas na lupa (TAKATSU, 2007).
As pectobactérias apresentam como principal fator de patogenicidade e
virulência a produção de uma ampla gama de enzimas capazes de degradar os
componentes da parede celular de plantas (AGRIOS, 2005; DUARTE; EL-
TASSA, 2003; KOTOUJANSKY, 1987; PÉROMBELON; KELMAN, 1980;
PÉROMBELON, 2002), incluindo, celulases, proteases, xilanases e pectinases,
levando ao colapso da parede celular vegetal e liberando nutrientes para o
crescimento da bactéria (AGRIOS, 2005; BARRAS et al., 1994; JANSE, 2005;
PÉROMBELON, 2002).
15
As pectinases ou enzimas pectinolíticas são consideradas as mais
importantes enzimas relacionadas ao desenvolvimento da doença, uma vez
que, estão diretamente envolvidas na digestão da pectina presente na lamela
média da parede celular, causando colapso e maceração do tecido, resultando
na morte celular (AGRIOS, 2005; MATSUMOTO et al., 2003). Essas enzimas
podem ser do tipo, pectato liase, pectina liase, poligalacturonase e pectina metil
esterase (AGRIOS, 2005; PÉROMBELON; KELMAN, 1980; TOTH et al., 2003).
As bactérias pectinolíticas penetram na planta através de ferimentos ou
aberturas naturais. Dentro da planta, invadem o sistema vascular, o que
permite que se espalhem rapidamente por toda a planta (KIM et al., 2011;
KUBHEKA et al., 2013 ). As condições ambientais de umidade, temperatura e
disponibilidade de oxigênio exercem uma grande influência no desenvolvimento
da doença e extensão dos danos causados (PÉROMBELON, 2002). Dessa
forma, as infecções permanecem latentes até que as condições ambientais,
incluindo água livre, baixa concentração de oxigênio e altas temperaturas,
tornem-se apropriadas para o desenvolvimento da doença (BABUJEE et al.,
2012, PÉROMBELON; KELMAN, 1980; TOTH et al., 2003). O tecido
colonizado torna-se mole devido à ação de enzimas pectinolíticas excretadas
pelo patógeno (MARINGONI, 2005). Subsequentes fermentações e
concomitante invasão do tecido em colapso por saprófitas ocasionam o
desprendimento de gases com odor desagradável (ROMEIRO, 1995). Essas
bactérias sobrevivem na água, em restos culturais em decomposição, na
rizosfera de plantas cultivadas ou invasoras, epifiticamente na filosfera de
plantas hospedeiras ou invasoras e no solo (KIKUMOTO, 1980;
PÉROMBELON; KELMAN, 1980; MARINGONI, 2005). No entanto, não
sobrevivem no solo por longos períodos na ausência de água livre e restos
culturais (PÉROMBELON; KELMAN, 1980).
A disseminação ocorre por meio de insetos, movimento de solo, tratos
culturais, implementos agrícolas; aerossóis, sementes e respingos de chuva ou
água de irrigação (ELPHISTHONE; PÉROMBELON, 1986; HADAS et al., 2001;
MARINGONI, 2005; PÉROMBELON; KELMAN, 1980; QUINN; SELLS;
GRAHAM, 1980). Nas brássicas, a bactéria penetra por ferimentos nas folhas
normalmente provocados por insetos e por implementos agrícolas (LOPES;
QUEZADO-SOARES, 1997). Em couve-manteiga, também é comum que a
16
doença se inicie a partir dos ferimentos ocasionados pela remoção sucessiva
de folhas (HALFELD-VIEIRA et al., 2010).
Os sintomas da doença variam de acordo com as condições do
ambiente, uma vez que, a concentração de oxigênio e a umidade são fatores
importantes na intensidade da doença (PÉROMBELON; LOWE, 1975; DE
BOER et al., 1987). Também a resistência ou suscetibilidade da cultivar e parte
da planta afetada irão influenciar na sintomatologia (BAIN et. al., 1990; DE
BOER et al.,1987).
Em plantas de couve-manteiga, as folhas infectadas apresentam
manchas encharcadas que se expandem rapidamente (LOPES; QUEZADO-
SOARES, 1997). Sintomas de murcha e apodrecimento são comuns. No caule
é comum a presença de rachaduras externas, internamente, pode ser
observada a desintegração da medula (Figura 1), devido à ação das enzimas
pectinolíticas excretadas pelo patógeno e, muitas vezes, apresenta secreção
de líquido com odor fétido característico desta bacteriose (MARINGONI, 2005;
TRANI et al., 2015).
17
MORETTI; AMATULLI; BUONAURIO, 2009; ONKENDI; MOLELEKI, 2014;
PINHEIRO et al., 2011).
A identificação em nível específico de estirpes de Pectobacterium
carotovorum pode ser realizada através de PCR com oligonucleotídeos
iniciadores específicos Y1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3') e Y2
(5' CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3'), que amplificam 434 pares de
bases de parte do gene da pectato liase (pel) (DARRASSE et al., 1994). Além
disso, vários trabalhos vêm realizando a análise filogenética de uma região
conservada do genoma bacteriano denominada rDNA 16S (gene rRNA 16S)
para identificação de espécies, subespécies e estirpes do gênero
Pectobacterium (ASHMAWY et al., 2015; DANA et al., 2015; GARDAN et al.,
2003; HAUBEN et al., 1998; KWON et al., 1997; LEE et al., 2014; ZHU et al.,
2010).
Dessa forma, o gênero tem sido objeto de extensa pesquisa taxonômica
e, consequentemente, dividido em várias espécies e subespécies baseado em
características bioquímicas, diferenças de hospedeiros e, principalmente em
análises moleculares (DUARTE et al., 2004; KWON et al. 1997; HAUBEN et al.,
1998; GARDAN et al., 2003; NABHAN et al., 2013).
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entanto, essa proposta não foi amplamente aceita, pois apenas a característica
da atividade pecnolítica não foi considerada suficiente para formar um novo
gênero (DUARTE, 1999). Posteriormente, Hauben et al. (1998) com base na
análise de sequência do rDNA 16S de 29 estirpes de bactérias associadas a
plantas, propuseram que as espécies do grupo Carotovora do gênero Erwinia
fossem reunidas no gênero Pectobacterium, sendo então renomeadas: E.
carotovora subsp. atroseptica (van Hall) Dye para Pectobacterium carotovorum
subsp. atrosepticum (van Hall) Hauben et al., E. carotovora subsp.
betavasculorum Thomson et al. para P. carotovorum subsp. betavasculorum
(Thomson et al.) Hauben et al., E. carotovora subsp. carotovora (Jones) Bergey
et al. para P. carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Hauben et al., E.
carotovora subsp. odorifera Gallois et al. para P. carotovorum subsp.
odoriferum (Gallois et al.) Hauben et al., E. carotovora subsp. wasabiae Goto e
Matsumoto para P. carotovorum subsp. wasabiae (Goto & Matsumoto) Hauben
et al., E. cacticida Alcorn et al. para P. cacticidum Hauben et al., E.
chrysanthemi Burkholder et al. para P. chrysanthemi (Burkholder et al.) Brenner
et al. e E. cypripedii (Hori) Bergey et al. para P. cypripedii (Hori) Brenner et al.
Em 2003, considerando estudo utilizando hibridação de DNA-DNA, taxonomia
numérica de 120 características fenotípicas, sorologia e nova análise
filogenética de sequências de rDNA 16S, previamente relatadas em base de
dados, P. carotovorum subsp. betavasculorum (Thomson et al.) Hauben et al.,
P. carotovorum subsp. atrosepticum (van Hall) Hauben et al. e P. carotovorum
subsp. wasabiae (Goto & Matsumoto) Hauben et al. foram elevadas ao nível de
espécies e renomeadas em P. betavasculorum (Thomson et al.) Gardan et al.,
P. atrosepticum (van Hall) Gardan et al. e P. wasabiae (Goto and Matsumoto)
Gardan et al, respectivamente (GARDAN et al., 2003). Samson et al. (2005)
baseado em análise filogenética da sequência de genes da região rDNA 16S
de estirpes de P. chrysanthemi propuseram a reclassificação da espécie para
o gênero Dickeya Samson et al.
Em trabalho realizado por Duarte et al. (2004), bactérias isoladas de
cultivos de batata (Solanum tuberosum L.) com sintomas de canela-preta no
Rio Grande do Sul, Brasil, apresentaram perfis bioquímicos, fisiológicos,
sorológicos e genéticos que não se enquadraram em nenhuma das espécies
de Pectobacterium, sobretudo apresentando características diferentes de
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Pectobacterium atrosepticum, principal agente causal de canela-preta em
batata. No entanto, apresentaram-se semelhantes a P. carotovorum subsp.
carotovorum, levando a sugestão de uma nova subespécie de P. carotovorum,
denominada de P. carotovorum subsp. brasiliensis Duarte et al. Também
Nabhan et al. (2012) através de hibridação DNA-DNA de isolados identificados
em estudos anteriores como P. carotovorum subsp. brasiliensis (DUARTE et
al., 2004; NABHAN et al, 2011), confirmaram a proposta da nova subespécie,
brasiliensis. Adicionalmente, Nabhan et al. (2013) propuseram a inserção de
uma nova espécie causadora de podridão-mole, infectando principalmente
monocotiledôneas: P. aroidearum Nabhan et al.
Diante do exposto, a espécie P. carotovorum tem sido dividida em três
subespécies, carotovorum, odoriferum e brasiliensis.
20
Unidos, Coréia, Canadá, Quênia, Egito, Israel, Holanda, Suíça, Peru, Nova
Zelândia, Síria e Zimbábue (ALI et al., 2013; ASHMAWY et al., 2015; CHOI;
KIM, 2013; DE BOER; LI; WARD, 2012; LEITE et al., 2014; MA et al., 2007;
NABHAN et al., 2011; NGADZE et al.,2012; ONKENDI; MALULEKE;
MOLELEKI, 2014; ONKENDI et al., 2016; PANDA et al., 2012; WERRA et al.,
2015).
No Brasil, essa espécie foi encontrada apenas em cenoura e batata,
nesta é considerada o principal agente patogênico responsável por quadros de
canela-preta (DUARTE et al, 2004; EL TASSA & DUARTE, 2004; MALAVOLTA
JÚNIOR et al, 2008). No entanto, mundialmente P. carotovorum subsp.
brasiliensis tem sido registrada em diversas famílias botânicas, incluindo a
família Brassicaceae, como exemplo, a couve-chinesa (LEE et al., 2014),
tornando provável que essa espécie também esteja presente em cultivos de
brássicas no Brasil, devido a sua ampla gama de hospedeiros e distribuição
geográfica (LEE et al., 2014), o que pode gerar implicações epidemiológicas
importantes, que poderão ser fundamental para o estabelecimento de
estratégias de manejo e controle da doença em couve-manteiga.
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maior espaçamento possível entre plantas (LOPES; QUEZADO-SOARES,
1997; MARIANO et al., 2001; MARINGONI, 2005).
Outras medidas também são recomendadas, como o controle biológico
(BARRA et al., 2009; DONG et al., 2004; MANEFIELD et al., 2001; SILVA et al.,
2014), o uso de variedades resistentes (REN; PETZOLDT, DICKSON, 2001),
uso de indutores de resistência (acibenzolar-S-metil) (BENELLI; DENARDIN;
FORCELINI, 2004), tratamento com cálcio (FLEGO et al., 1997; GOMES et al,
2005); aplicação de produtos alternativos (fosfito de cálcio, fosfito de potássio e
extratos vegetais) (SILVA et al., 2012a; SILVA et al., 2014), controle químico
através do uso de antibióticos e fungicidas à base de cobre (ZAMBOLIM;
VALE; COSTA, 1997; CHARKOWSKI, 2015).
O controle químico tem sido considerado pouco eficiente e/ou
economicamente inviável, uma vez que, produtos fitossanitários têm preços
elevados no mercado brasileiro e impactam significativamente o custo de
produção agropecuária (PEREIRA, 2013).
Para uso de antibióticos agrícolas deve-se considerar o custo, registro
para a cultura, período de carência e, principalmente, a interferência no
ecossistema envolvido (MELO et al, 2011). Dessa forma, o baixo número de
agroquímicos registrados para as doenças bacterianas em hortaliças (BERIAM,
2007; CRUZ, 2013) favorece a utilização de produtos em cultura diversa da
indicada no registro (CRUZ, 2013). No Brasil, há registro de apenas um produto
formulado comercial contendo antibiótico de uso agrícola, o Kasumim®
(casugamicina 2,0%) (AGROFIT, 2016). Porém, a utilização repetida e
frequente do mesmo antibiótico leva a seleção de bactérias resistentes aos
princípios ativos fazendo com que estes produtos percam a eficiência
(AGRIOS, 2005; BERIAM, 2007; LOPES; QUEZADO-SOARES, 1997), além
disso, a utilização excessiva de agroquímicos gera uma série de danos
ambientais, bem como para saúde humana e animal (JARDIM; ANDRADE;
QUEIROZ, 2009).
Não há nenhum produto registrado para controle da podridão-mole nas
brássicas (AGROFIT, 2016), tendo em vista que são consideradas culturas
com suporte fitossanitário insuficiente, denominadas “minor crops” (MAPA,
2010), sobretudo para o patossistema couve-manteiga x Pectobacterium
carotovorum subsp. brasiliensis. Nesse contexto, alternativas de controle
22
eficientes, que agreguem sustentabilidade, para serem integradas ao manejo
da podridão-mole tornam-se necessárias.
24
crescimento de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. e a incidência
do moko em mudas de bananeira inibiram o crescimento de R. solanacearum
em todas as concentrações testadas. Nas mudas de bananeira pulverizadas, o
óleo de citronela proporcionou o melhor resultado, com 100% de controle da
doença (AMORIM et al., 2011).
Santos et al. (2014), avaliando a eficácia do óleo essencial de alecrim
da chapada (Lippia gracilis Schauer) no crescimento in vitro de Xanthomonas
campestris pv. viticola (Nayudu) Dye (Xcv), constataram inibição do
crescimento de Xcv em todas as concentrações, apresentando porcentagens
de inibição variando de 62,67% a 96,50%.
Lima (2016), em ensaio in vitro, verificou que OEs de alecrim, capim-
limão, citronela, cravo, eucalipto e palmarosa (Cymbopogon martin [Roxb.]
Wats) inibiram completamente o crescimento de R. solanacearum. Já in vivo
a população de R. solanacearum no solo foi reduzida pelos óleos de alecrim,
cravo, capim limão, gengibre, melaleuca (Melaleuca alternifolia Maiden &
Betche, Cheel) e palmarosa, destacando-se o cravo com redução de 42,3%.
Sendo que o óleo de cravo reduziu a incidência, o índice de murcha
bacteriana (IMB) e a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD)
em 90,2; 97 e 98,8, respectivamente, e o seu composto majoritário, o
eugenol, teve os mesmos efeitos na redução da doença.
Existem algumas pesquisas mostrando a eficácia de OEs na inibição de
Pectobacterium carotovorum e controle da podridão-mole. In vitro, Costa et al.
(2008a) observaram que o óleo de alecrim na concentração mínima inibitória
(CMI) de 4% foi efetivo sobre seis isolados de P. carotovorum, com valores
médios de halos de inibição entre 10 e 12 mm de diâmetro. Utilizando óleo de
citronela, Costa et al. (2008b) verificaram que na CMI de 1%, esse óleo inibiu o
crescimento de isolados de P. carotovorum. Também Costa et al. (2009)
observaram que o óleo de manjericão promoveu a formação de halos de
inibição entre 24 e 28 mm, quando na CMI de 2% sobre isolados de P.
carotovorum. Huang e Lakhsman (2010) verificaram o efeito bactericida do
óleo de cravo a 0,5% sobre P. carotovorum subsp. carotovorum.
Em trabalho realizado por Silva et al. (2012a), os óleos de eucalipto
globulus (Eucalyptus globulus Labill) e laranja-doce (Citrus sinensis L.)
reduziram significativamente a severidade da podridão-mole em alface crespa.
25
Já a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) foi reduzida pelos
óleos de limão (Citrus limon L.), sálvia-esclaréia (Salvia sclarea L.), eucalipto
globulus, gengibre, erva-doce (Foeniculum vulgare Mill), laranja-doce, eucalipto
citriodora e capim-limão. Mais recentemente, Guerra et al. (2014), avaliando o
efeito de OEs na redução da podridão-mole em couve-chinesa, verificaram que
os OEs de bergamota (Citrus bergamia Risso et Poiteau ), capim-limão,
copaíba (Copaifera officinalis), eucalipto citriodora, eucalipto globulus, erva-
doce, gengibre, hortelã (Mentha piperita L.), laranja-doce, limão e sálvia-
esclaréia reduziram significativamente a severidade e a área abaixo da curva
de progresso da doença.
Na literatura, não foram encontrados trabalhos utilizando óleos
essenciais para o controle da podridão-mole na couve-manteiga, no entanto, os
relatos acima sugerem o potencial dos mesmos para estudos de controle
alternativo nesse patossistema.
26
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39
OBJETIVOS
40
CAPÍTULO I
41
1 COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS
6 1
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, Universidade do Estado da Bahia,
7 Juazeiro, BA, Brasil
8 2
Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE,
9 Brasil
10
11 RESUMO
42
35 mais consumidas no mercado nacional, sobretudo pelo seu alto valor nutricional
36 (Novo et al., 2010). Infecções bacterianas são comuns em cultivos de couve-
37 manteiga, muitas das quais são limitantes para o desenvolvimento da cultura, entre
38 elas, encontram-se as ocasionadas por bactérias do gênero Pectobacterium,
39 responsáveis por sintomas de podridão-mole (Filgueira, 2008).
40 Em visitas realizadas em hortas comunitárias nos municípios de Juazeiro, BA
41 e Petrolina, PE, foram observadas plantas de couve-manteiga com sintomas de
42 podridão-mole (Figura 1). A partir do tecido infectado foi realizado o isolamento
43 parcialmente seletivo para Pectobacterium carotovorum utilizando-se frutos de
44 pimentão verde (Takatsu et al., 1981). Após 48 h, realizou-se o isolamento em meio
45 CPG (caseína hidrolisada 1 g, peptona 10 g, dextrose 10 g, ágar 18 g, água
46 destilada 1000 mL) a partir de frutos de pimentão sintomáticos. Colônias com bordos
47 irregulares, opacas, com característica de "vidro quebrado" (Duarte & El Tassa,
48 2003), protuberância no centro, formando o aspecto de “ovo frito” visualizadas em
49 microscópio estereoscópico (Takatsu, 2007) foram preservadas em água destilada
50 esterilizada (ADE) e mantidas em temperatura ambiente (Mariano & Silveira, 2005).
51 O teste de patogenicidade foi realizado em mudas de couve-manteiga (T de 30°C ±2
52 e UR de 62% ± 2) e folhas destacadas de couve-manteiga e couve-chinesa (T de
53 28°C ± 2 e UR de 65% ± 2), empregando-se o método de injeção da suspensão
54 bacteriológica A530 = 0,36 (1x109 UFC. mL-1) dos isolados com 48 h de incubação
55 (Mariano & Silveira, 2005). Os sintomas de podridão-mole foram observados após
56 12-24 h de incubação, procedendo-se o reisolamento do patógeno, completando-se
57 os postulados de Koch.
58
59 Figura 1. Sintomas de podridão-mole (Pectobacterium carotovorum subsp.
brasiliensis) em caules de couve-manteiga.
43
60 Um dos isolados (UNEB8) foi submetido à identificação bioquímica e
61 fisiológica por meio dos seguintes testes: maceração em tubérculos de batata,
62 crescimento a 37 °C, sensibilidade à eritromicina (Hyman et al., 2002) e reação de
63 Gram (KOH 3%) (Mariano & Assis, 2000). A caracterização metabólica foi realizada
64 por meio do sistema Biolog, Inc (Hayward, Estados Unidos) utilizando-se
65 microplacas Biolog GenIII, contendo 71 fontes de carbono. As avaliações foram
66 realizadas visualmente observando-se a mudança de coloração dos poços para
67 púrpura (positivo). A identificação específica foi realizada por meio de PCR utilizando
68 os oligonucleotídeos iniciadores Y1 (5’-TTA CCG GAC GCC GAG CTG TGG CGT-
69 3’) e Y2 (5’-CAG GAA GAT GTC GTT ATC GCG AGT-3’) de parte do gene da
70 pectato liase (pel) de acordo com Darrasse et al. (1994) e os iniciadores universais
71 yf1 (5’-TGATGGAGGGGGATAACTACTGGA-3’) e yr1 (5’
72 CCCCTACGGTTACCTTGTTACGAC-3’) de parte do gene 16S rRNA (Hauben et al.,
73 1998). A sequência parcial do gene 16S rRNA obtida, a qual foi sequenciada pela
74 Macrogen®, foi comparada com outras oriundas do GenBank utilizando-se a
75 ferramenta Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). A análise filogenética foi
76 realizada com o programa MEGA versão 4.0, utilizando o método “Neighbor-Joining”
77 e modelo de substituição de nucleotídeos Kimura-2-parâmetros com “bootstrap” de
78 2000.
79 UNEB8 foi positivo para maceração em tubérculos de batata, resistente a
80 eritromicina, cresceu a 37 °C e apresentou células Gram-negativas. A caracterização
81 metabólica mostrou a sua capacidade em utilizar melibiose, gentibiose, trealose,
82 ácido galacturônico e ácido glucônico, bem como a não utilização de dextrina,
83 sorbitol e maltose. Os produtos da amplificação do DNA pela PCR com os
84 iniciadores específicos (Y1/Y2) para P. carotovorum produziram uma banda de 434
85 pb. A amplificação com os iniciadores yf1/ yr1 gerou uma sequência de
86 aproximadamente 1249 pb do gene 16S rRNA. A sequência parcial do gene 16S
87 rRNA foi 99,9% similar a Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis C18 (N°
88 acesso JF926718.1).
89 Filogenicamente o isolado UNEB8 relacionou-se com os isolados A17 e 8 de
90 Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis (Figura 2). Os resultados baseados
91 em testes fisiológicos, bioquímicos, metabólicos e moleculares permitiram identificar
92 o isolado UNEB8 como Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis.
93
44
94
95 Figura 2. Árvore filogenética baseada na sequência 16S rRNA de isolados de
pectobactérias relacionadas ao isolado UNEB8. A barra da escala indica o número de
96 alterações esperadas por sítio.
45
106 Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis foi relatada pela primeira vez
107 em cultivos de batata no Brasil em 2004 (Duarte et al., 2004), desde então, sua
108 ocorrência vem sendo registrada em diversos países, como África do Sul, Estados
109 Unidos, Coréia, Canadá, Quênia, Egito, Israel, Holanda, Suíça, Peru, Nova Zelândia,
110 Síria e Zimbábue (Ali et al., 2013; Ashmawy et al., 2015; Choi e Kim, 2013; De Boer
111 et al., 2012; Leite et al., 2014; Ma et al., 2007; Nabhan et al., 2011; Ngadze et al.,
112 2012; Onkendi et al., 2014; Onkendi et al., 2016; Panda et al., 2012; Werra et al.,
113 2015). No Brasil, essa espécie foi encontrada apenas em cenoura e batata no
114 Estado do Rio Grande do Sul (Duarte et al., 2004; Malavolta Júnior et al., 2008).
115 Portanto, este é o primeiro relato de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis
116 como agente causal da podridão-mole em couve-manteiga no Brasil.
117
118 REFERÊNCIAS
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215 Panda P., Fiers M.A.W.J., Armstrong K., Pitman A. R., 2012. First report of blackleg
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217 New Zealand. New Disease Reports. 26:15.
218 Samson R., Legendre J. B., Christen R., Fischer-Le Saux M., Achouak W. and
219 Gardan L., 2005. Transfer of Pectobacterium chrysanthemi (Burkholder et al., 1953)
220 Brenner et al. 1973 and Brenneria paradisiaca to the genus Dickeya gen. nov. as
221 Dickeya chrysanthemi comb. nov. and Dickeya paradisiaca comb. nov. and
222 delineation of four novel species, Dickeya dadantii sp nov., Dickeya dianthicola sp.
223 nov., Dickeya dieffenbachiae sp. nov. and Dickeya zeae sp. nov. Internacional
224 Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 55:1415-1427
225 Silva A.S., 2012. Percloreto de ferro como sinalizador de injúrias em tubérculos de
226 batata e caracterização de isolados de Pectobacterium spp. Tese. Universidade
227 Federal de Uberlândia, Minas Gerais, Brasil.
Artigo formatado com base nas normas para publicação na revista “ACTA
SCIENTIARUM. AGRONOMY”, para a qual será submetido.
49
1 Óleos essenciais no manejo da podridão-mole em couve-manteiga, no
2 semiárido brasileiro
3 Marcia Ferreira Queiroz1*, Ana Rosa Peixoto*1, Meridiana Araújo Gonçalves Lima2,
4 Josineide Edinalva Pereira, Cristiane Domingos da Paz1
5
1
6 Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais, Universidade do Estado da Bahia,
7 CEP 48900-000, Juazeiro, BA, Brasil. 2 Departamento de Agronomia, Universidade
8 Federal Rural de Pernambuco, 52171-900, 5 Recife, PE, Brasil.3 *Autores para
9 correspondência: E-mail: marcyabioagro@gmail.com; arpeixoto@gmail.com
10
11 RESUMO. Os óleos essenciais (OEs) de cravo a 0,25%, capim-limão e palmarosa a
12 0,5%, citronela, melaleuca e laranja a 0,75%, bergamota, alecrim, sálvia e gengibre
13 a 1%, bem como capim-limão, cravo, citral e acetato de eugenol (AE) em diferentes
14 concentrações foram avaliados na inibição de Pectobacterium carotovorum subsp.
15 brasiliensis (Pcb) e controle da podridão-mole em couve-manteiga, pulverizados 72
16 horas antes ou sete horas após a inoculação. Os óleos de cravo, citronela,
17 bergamota, alecrim, palmarosa, sálvia, melaleuca e capim-limão inibiram
18 completamente o crescimento de Pcb. O óleo de capim-limão (0,5%) promoveu uma
19 incidência (INC) de 0%, proporcionando um percentual de controle da doença de
20 100%, em ambos os períodos. O óleo de cravo (0,25%) apresentou menor INC
21 (25%) quando aplicado após inoculação, promovendo um percentual de controle de
22 71,42%. A CMI foi de 0,03125, 0,0625 e 0,125% para o citral, capim-limão e cravo,
23 respectivamente. O AE não apresentou CMI. O óleo de capim-limão a 0,125% (pós-
24 inoculação) e o citral a 0,125%, em ambos os períodos, proporcionaram os maiores
25 percentuais de controle da doença (33,33; 50 e 100%, respectivamente). O óleo de
26 cravo a 0,125% (pós-inoculação) mostrou maior eficiência que o AE (0,25%),
27 promovendo um percentual de controle da doença de 16,67%. OEs de capim-limão
28 e cravo destacaram-se na eficiência de controle da podridão-mole em couve-
29 manteiga.
50
35 at 1%, and lemongrass, clove, citral and eugenol acetate (EA) at different
36 concentrations were evaluated in the inhibition of Pectobacterium carotovorum
37 subsp. brasiliensis (Pcb) and control of soft rot in kale, sprayed 72 hours before or
38 seven hours after inoculation. Clove, lemongrass, bergamot, rosemary, palmarosa,
39 sage, tea tree and lemongrass oils completely inhibited the growth of Pcb.
40 Lemongrass oil (0,5%) promoted an incidence (INC) of 0%, providing a percentage of
41 disease control of 100%, in both periods. The clove oil (0,25%) showed lower INC
42 (25%) when applied after inoculation, promoting a control percentage of 71,42%. The
43 MIC was 0,03125, 0,0625 and 0,125% for citral, lemongrass and clove, respectively.
44 The EA did not present MIC. Lemongrass oil at 0,125% (post-inoculation) and citral
45 at 0,125%, in both periods, provided the highest percentages of disease control (33,
46 33; 50 and 100%, respectively). The clove oil at 0,125% (post-inoculation) showed
47 higher efficiency than EA (0,25%), promoting a percentage of disease control of
48 16,67%. EOs of lemongrass and clove were highlighted in the efficiency control of
49 soft rot in kale.
52 INTRODUÇÃO
51
67 Maiss & Wydra, 2013), sendo que a maioria não tem especificidade, podendo
68 infectar uma ampla gama de hospedeiros, e uma mesma planta pode ser infectada
69 por várias espécies ou subespécies do gênero (Mariano, Silveira, Alvarado & Silva,
70 2005). Em 2004, uma nova subespécie, altamente agressiva, nomeada de P.
71 carotovorum subsp. brasiliensis Duarte et al (Pcb) foi caracterizada em cultivos de
72 batata no Brasil (Duarte et al., 2004). Desde então, a subespécie vem sendo
73 relatada em diversos países e famílias botânicas, incluindo a Brassicaceae, a
74 exemplo da couve-chinesa (Brassica pikinensis L) (Lee, Kim, Lim, Han & Heu, 2014).
75 Na couve-manteiga, até o presente não foram encontrados relatos de ocorrência de
76 Pcb.
77 A podridão-mole é uma doença de difícil controle devido à heterogeneidade
78 das espécies do gênero Pectobacterium, que possuem ampla gama de hospedeiros
79 e distribuição geográfica (Lee et al., 2014), apresentando capacidade de
80 sobrevivência em restos de cultura, no solo e na rizosfera de plantas cultivadas ou
81 invasoras (Charkowski, 2015; Kikumoto, 1980; Pérombelon & Kelman, 1980;
82 Maringoni, 2005), e disseminação por diversos meios (Elphisthone & Pérombelon,
83 1986, Hadas, Kritzman, Gefen & Manulis, 2001; Maringoni, 2005; Pérombelon &
84 Kelman, 1980). No entanto, algumas medidas de controle integradas envolvem: o
85 plantio em solos bem drenados, controle de insetos, eliminação de plantas doentes,
86 rotação de culturas (Mariano et al., 2001; Maringoni, 2005), controle biológico
87 (Dong, Zhang, Xu & Zhang, 2004; Silva, Carvalho, Silva, Lins & Oliveira, 2014), uso
88 de indutores de resistência (acibenzolar-S-metil) (Benelli, Denardin & Forcelini,
89 2004), utilização de fosfito de cálcio, fosfito de potássio e extratos vegetais (Silva et
90 al., 2012a; Silva et al, 2014) e controle químico através do uso de antibióticos e
91 fungicidas à base de cobre (Zambolim, Vale & Costa,1997; Charkowski, 2015). No
92 entanto, não há nenhum produto registrado para controle da podridão-mole nas
93 brássicas (Agrofit, 2016).
94 Os óleos essenciais têm sido muito estudados nos últimos anos, mostrando-
95 se promissores no manejo alternativo de doenças de plantas, devido às suas
96 propriedades antimicrobianas. O potencial de óleos essenciais foi verificado no
97 controle da podridão-mole, causada por Pcc, em couve-chinesa (Guerra, Guerra,
98 Souza & Mariano, 2014) e alface (Lactuca sativa L.) (Silva et al., 2012a). Também
99 resultados positivos in vitro de óleos essenciais foram obtidos para Pcc (Costa,
52
100 Santos, Barros, Agra & Farias , 2008a; 2008b; Fernández et al., 2014; Jeong et al.,
101 2009; Salem, Abdel-Mageed & Ali, 2014; Sotelo-Boyás et al., 2015).
102 Dessa forma, o presente trabalho foi realizado com os objetivos de avaliar o
103 efeito in vitro e in vivo de óleos essenciais em diferentes concentrações na inibição
104 do crescimento de Pcb e controle da podridão-mole, em couve-manteiga.
155 Foram utilizados óleos vegetais 100% puros e naturais (marca Phytoterápica -
156 Solua Comercial Ltda) de cravo (Eugenia caryophyllata Thunb), citronela
54
157 (Cymbopogon winterianus Jowitt), bergamota (Citrus bergamia Risso et Poiteau),
158 alecrim (Rosmarinus officinalis L.), palmarosa (Cymbopogon martin [Roxb.] Wats),
159 sálvia (Salvia sclarea L.), gengibre (Zingiber officinale Roscoe), melaleuca
160 (Melaleuca alternifolia Maiden & Betche, Cheel), laranja (Citrus aurantium L.) e
161 capim-limão (Cymbopogon citratus Stapf).
181 A sensibilidade de Pcb aos diferentes OEs in vitro foi determinada por meio
182 da contagem de colônias por placa (Paret, Cabos, Kratky & Alvarez, 2010). O
183 volume de 100 mL de meio CPG foi utilizado para cada tratamento. Foram
184 misturados ao meio 250 μL, 500 μL, 750 μL e 1000 μL dos óleos para atingir as
185 concentrações finais de 0,25, 0,5, 0,75 e 1 % (v/v), respectivamente. O óleo de cravo
186 foi utilizado a 0,25%, os óleos de capim-limão e palmarosa a 0,5%, citronela, laranja
187 e melaleuca a 0,75% e os demais a 1%. O meio misturado a cada óleo emulsionado
188 com tween 20 (1:1), em sua respectiva concentração foi adicionado em placas de
55
189 Petri e resfriado em câmara de fluxo laminar por 20 min. Em seguida, 100 μL da
190 suspensão bacteriana de Pcb, previamente diluída em ADE até 10-4 UFC/mL foi
191 espalhada sobre o meio. As placas foram incubadas a 28 °C por 48 h.
192 Posteriormente, foi realizada a contagem do número de colônias por placa e cálculo
193 da UFC/mL. O meio com adição de 1 mL de tween 20 representou a testemunha. O
194 experimento foi constituído por 11 tratamentos (10 óleos essenciais + testemunha)
195 com quatro repetições e três parcelas, sendo cada parcela representada por uma
196 placa de Petri.
57
252 inoculação e as avaliações da INC foram realizadas conforme descrito
253 anteriormente.
254 Os experimentos tiveram delineamento inteiramente casualizado com oito
255 tratamentos cada, constituídos por óleo de cravo (uma concentração); óleo de
256 capim-limão (duas concentrações); acetato de eugenol (uma concentração); citral
257 (três concentrações) e testemunha (tratada com ADE, inoculada com Pcb). Cada
258 tratamento teve quatro repetições, sendo cada repetição constituída por uma planta,
259 com três folhas inoculadas.
58
285 0,5% e cravo a 0,25% inibiram completamente o crescimento do patógeno (P≤0,05),
286 após 48 h de incubação a 28 °C. Já os OEs de gengibre a 1 % e laranja a 0,75%
287 não inibiram significativamente o crescimento bacteriano em relação à testemunha
288 (Tabela 2).
289 Tabela 2. Sensibilidade in vitro de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis a
290 óleos essenciais, determinada por meio da contagem de colônias por placa de Petri
TRATAMENTOS CONCENTRAÇÕES (%) Log(UFC/mL+1)
Alecrim 1 0 a1
Bergamota 1 0a
Capim-limão 0,5 0a
Citronela 0,75 0a
Cravo 0,25 0a
Melaleuca 0,75 0a
Palmorosa 0,5 0a
Sálvia 1 0a
Gengibre 1 8,53 b
Laranja 0,75 8,47 b
Testemunha - 8,62 b
291 1
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si de acordo com o teste de Tukey
292 (P≤0,05).
293
294 A atividade antimicrobiana in vitro de OEs vem sendo comprovada por
295 diversos autores, inclusive para bactérias fitopatogênicas. Paret et al. (2010)
296 verificaram que os óleos de palmarosa e capim-limão a 0,07 e 0,14% inibiram
297 completamente o crescimento de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
298 (Rs). Também Amorim et al.(2011) testando diferentes concentrações (1,25; 3,5,
299 3,75 e 5%) de OEs sobre o crescimento de Rs observaram que os óleos de citronela
300 e cravo inibiram o crescimento bacteriano em todas as concentrações testadas.
301 Lucas, Alves, Pereira, Perina e Souza (2012a) verificaram o efeito tóxico direto dos
302 OEs de citronela, cravo, capim‑limão, eucalipto, melaleuca, tomilho (Thymus
303 vulgaris L.) e canela (Cinnamomum zeylanicum Blume) a 10% sobre Xanthomonas
304 vesicatoria (ex Doidge) Vauterin et al. Já Silva, Martins e Alves (2014) constataram
305 que os óleos de citronela, capim-limão, canela e eucalipto (Corymbia citriodora Hill &
306 Johnson) a 1%, tomilho e cravo a 10% foram eficientes na inibição do crescimento
307 de Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe) Young, Dye & Wilkie. Esses
308 resultados reforçam o potencial antibacteriano dos óleos essenciais de palmarosa,
309 capim-limão, citronela, cravo e melaleuca também verificados neste trabalho.
310 Embora não tenham sido encontrados trabalhos que comprovem a atividade
311 inibitória de OEs sobre Pcb, alguns autores relataram o potencial antibacteriano de
59
312 OEs sobre Pcc. O óleo essencial de citronela a 1% e alecrim a 4% apresentaram
313 elevada inibição sobre seis isolados de Pcc obtidos de Brassica oleraceae L. var.
314 capitata DC e Lactuca sativa L (Costa et al., 2008a; 2008b). Também Jeong et al.
315 (2009) comprovaram a atividade inibitória do óleo de capim-limão sobre três isolados
316 de Pcc, observando-se completa inibição a 0,5%. Esse resultado corrobora com o
317 encontrado neste trabalho, em que o óleo de capim-limão a 0,5% inibiu
318 completamente o crescimento de Pcb.
319 Outros óleos essenciais têm apresentado eficiência sobre Pcc. Fernández et
320 al. (2014) constataram que o óleo essencial de tomilho a 0,1% inibiu completamente
321 o crescimento de Pcc, enquanto Sotelo-Boyás et al. (2015) observaram atividade
322 inibitória sobre Pcc do óleo de tomilho a 2,8 % e lima (Citrus aurantifolia (Cristm.)
323 Swingle) a 11,2%.
324 A ação bactericida dos OEs de alecrim, citronela, melaleuca, palmarosa,
325 cravo e capim-limão verificada neste trabalho pode estar relacionada aos seus
326 complexos constituintes químicos, como os monoterpenos e sesquiterpenos.
327 Os componentes dos OEs são altamente citotóxicos, exercendo atividade
328 antimicrobiana por interferência na estrutura da parede celular e membranas
329 citoplasmáticas, aumentando a permeabilidade e a perda dos constituintes celulares,
330 alterando uma variedade de sistemas enzimáticos, incluindo aqueles envolvidos na
331 produção de energia celular, síntese de componentes estruturais e inativação ou
332 destruição do material genético (Bakkali, Averbeck, Averbeck & Idaomar, 2008; Burt,
333 2004, Kim, Marshall, Cornell, Prestom & Wel, 1995). Como exemplo, Huang e
334 Lakshman (2010) sugeriram que os componentes do óleo de cravo foram os
335 principais responsáveis por suas propriedades antibacterianas sobre Pcc, Rs,
336 Rhizobium rhizobacter (Beijerinck and van Delden) Young et al., Xanthomonas
337 hortorum pv. pelargonii (Brown) Vauterin et al., Streptomyces spp. e Rhodococcus
338 fascians (Tilford) Goodfellow).
339 No presente estudo, os OEs de gengibre e laranja não apresentaram
340 resultados satisfatórios. No entanto, alguns trabalhos já verificaram a bioatividade do
341 óleo de gengibre sobre Rs (Amorim et al., 2011), Staphylococcus aureus e
342 Escherichia coli (Silva, Ushimaru, Barbosa, Cunha, Fernandes Junior, 2009 ).
343 Provavelmente, algumas células bacterianas de Pcb permaneceram viáveis e foram
344 capazes de multiplicar-se, mesmo na presença desses óleos. Lucas et al. (2012a)
345 constataram através de microscopia eletrônica de transmissão que os óleos
60
346 essenciais de cravo, capim-limão, citronela e melaleuca a 0,1% causaram danos à
347 estrutura das células de X. vesicatoria, no entanto, não foram capazes de inibir o
348 crescimento bacteriano, indicando que algumas células permanecem viáveis e
349 promovem a multiplicação das bactérias. Adicionalmente, outros fatores podem
350 influenciar a bioatividade dos OEs, entre eles, o patógeno a ser controlado e a
351 composição química dos OEs. Esta poderá ser determinada pelas condições de
352 cultivo, clima, método de extração, época de colheita da planta e órgão colhido (Burt,
353 2004; Faleiro et al, 2003), sendo que composição química diferente pode pressupor
354 propriedades bioativas distintas (Torras, Grau, López & Heras, 2007). Guerra et al.
355 (2014) e Silva et al. (2012a) não verificaram efeito direto do óleo de laranja doce
356 (Citrus sinensis L.) na concentração de 0,5% sobre Pcc. Estes resultados
357 corroboram com obtidos para o óleo de laranja azeda a 0,75%, neste estudo.
358 Plantas de couve-manteiga tratadas com o óleo de capim-limão, antes ou
359 depois da inoculação, apresentaram INC de 0%, representando um percentual de
360 controle da doença de 100%, diferindo significativamente dos demais tratamentos
361 quando aplicado antes da inoculação. No entanto, quando aplicado após inoculação
362 não diferiu do óleo de cravo que proporcionou um percentual de controle de 71,42%
363 (P≤0,05) (Tabela 3).
364 Tabela 3. Efeito de óleos essenciais na redução da incidência da podridão-mole
365 causada por Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, em couve-manteiga,
366 em condições de casa de vegetação.
Tratamentos/ INC* % de controle4
Concentrações (%) Pré2 Pós3 Pré Pós
Capim Limão (0.5) 0,00a1 0,00a 100 100
Cravo (0.25) 50 b 25 ab 42,85 71,42
Citronela (0.75) 75 b 62,5 bc 14,28 28,57
Melaleuca (0.75) 75 b 62,5 bc 14,28 28,57
Palmarosa (0.5) 75 b 50 bc 14,28 42,85
Bergamota (1) 62,5 b 62,5 bc 28,57 28,57
Laranja (0.75) 62,5 b 87,5 c 28,57 0,00
Gengibre (1) 62,5 b 75 bc 28,57 14,28
Alecrim (1) 62,5 b 50 bc 28,57 42,85
Sálvia (1) 75 b 62,5 bc 14,28 28,57
Testemunha 87,5 b 87,5 c NA NA
CV(%) 22,76 23,75 NA NA
367 1
Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Duncan (P≤0,05).2
368 Aplicação dos tratamentos antes da inoculação. 3 Aplicação dos tratamentos após inoculação.
*Dados transformados pela equação √(x+0,5) para melhor atender aos pressupostos da análise de
variância (ANOVA). Incidência (INC), expressa pela porcentagem de plantas doentes; 4 Em relação a
testemunha; Não aplicável (NA).
61
369 Os óleos essenciais são conhecidos por sua ação antimicrobiana direta e
370 atividade indutora de resistência em plantas (Lucas et al.,2012a; Lucas, Alves,
371 Pereira, Zacaroni & Perina, 2012b; Aminifard & Mohammadi, 2013; Pereira et al.,
372 2008; Pereira, Lucas, Perina, Ribeiro Jr. & Alves, 2012; Schwan – Estrada,
373 Stargarlin, & Cruz 2003). O óleo de capim-limão em ambos os períodos de
374 aplicação foi eficiente na redução da incidência da doença, o que provavelmente
375 está relacionado à sua ação direta e atividade elicitora de defesa. Resultado
376 semelhante foi encontrado por Lucas et al. (2012a) em que o óleo de capim-limão a
377 0,1% aplicado em pré e pós- inoculação promoveu redução significativa da mancha
378 bacteriana do tomateiro. Também Guerra et al. (2014) avaliando o potencial de
379 diferentes óleos essenciais na redução da severidade da podridão-mole em couve-
380 chinesa causada por Pcc constatou que o óleo de capim-limão a 0,5% reduziu
381 significativamente a severidade em relação a testemunha, atribuindo esse resultado
382 a possível atividade indutora de resistência.
383 Os óleos de cravo, citronela, melaleuca, palmarosa, bergamota, alecrim e
384 sálvia não apresentaram os resultados esperados de acordo com a eficaz
385 bioatividade dos mesmos apresentados nos ensaios in vitro. No entanto, testes in
386 vitro nem sempre são representativos, pois os patógenos se comportam de forma
387 diferente quando estão interagindo com as plantas e exposto às variáveis
388 ambientais. Em geral, as concentrações inibitórias observadas in vitro devem ser
389 elevadas quando aplicadas in vivo para que se mantenha a mesma eficácia (Burt,
390 2004). Contudo, o óleo de cravo promoveu um maior percentual de controle da
391 doença de 71,42% quando aplicado pós-inoculação, evidenciado a sua maior
392 eficiência na ação antibacteriana direta. Resultados positivos utilizando o óleo de
393 cravo no controle de doenças de plantas já foram verificados. Huang e Lakshman
394 (2010) verificaram que o óleo de cravo a 0,5% proporcionou um controle de 100% da
395 murcha bacteriana do tomateiro. Também Amorim et al. (2011) observaram
396 eficiência de 25% no controle da moko da bananeira utilizando o óleo de cravo a
397 3,75%.
398 Nos ensaios in vitro com os óleos essenciais de capim-limão e cravo e seus
399 componentes majoritários verificou-se que os mesmos apresentaram diferenças
400 quanto a concentração mínima inibitória do crescimento de Pcb (Tabela 4). O óleo
401 essencial de capim-limão inibiu completamente o crescimento de Pcb a 0,5; 0,25;
402 0,125; 0,0625%, enquanto o seu componente químico citral promoveu inibição total
62
403 em todas as concentrações testadas. Já o óleo de cravo promoveu inibição completa
404 apenas nas maiores concentrações (0,25 e 0,125%) e seu componente químico
405 acetato de eugenol não foi eficaz na inibição de Pcb em nenhuma das
406 concentrações testadas.
407 Tabela 4. Concentrações mínimas inibitórias (CMI) dos óleos essenciais de capim
408 limão e cravo e de seus componentes químicos majoritários frente à
409 Pectoctobacterium carotovorum subsp. brasiliensis.
ÓLEO DE ACETATO DE ÓLEO DE CITR
CONCENTRAÇÕES (%)
CRAVO EUGENOL CAPIM-LIMÃO AL
0,5 NA NA1 -2 -
0,25 - +3 - -
0,125 - + - -
0,0625 + + - -
0,03125 + + + -
0,015625 + + NA NA
CONTROLE DE CRESCIMENTO + + + +
CONTROLE DO MEIO - - - -
410 1
(NA) Não aplicável, 2(-) Ausência de crescimento, 3(+) Crescimento microbiano
63
422
423 Figura 1. Efeito dos óleos essenciais de capim-limão e cravo e seus componenetes majoritários
(citral e acetato de eugenol) sobre a podridão-mole causada por Pectobacterium carotovorum
424
subsp. brasiliensis, em couve-manteiga. TESTE (Testemunha); CR0,125(óleo de cravo a 0,125%);
425 EU0,25 ( acetato de eugenol a 0,25%); CL0,0625 (capim-limão a 0,0625%); CL0,125 (capim-limão
a 0,125%); CT0,03125 (citral a 0,03125%); CT0,0625 (citral a 0,0625%); CT0,125 (citral a 0,125%);
426 Pré (aplicação dos tratamentos antes da inoculação); Pós (aplicação dos tratamentos após
inoculação). Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Duncan (P≤0,05).
427
428 O óleo de cravo apresenta como componente químico majoritário o eugenol
429 (Costa et al., 2011; Scherer, Wagner, Duarte & Godoy, 2009), enquanto o óleo de
430 capim-limão tem em sua composição majoritariamente o citral (mistura isomérica de
431 neral e geranial) (Guimarães, Cardoso, Sousa, Andrade & Vieira, 2011).
432 Usualmente, o mecanismo de ação dos óleos essenciais estão associados
433 aos seus componentes químicos majoritários (Bakkali et al., 2008), que apresentam
434 amplo espectro de ação atuando diretamente sobre as estruturas do patógeno
435 (Lucas et al., 2012a; Nazzarro et al., 2013), assim como ativando vias bioquímicas
436 de defesa da planta, tais como o incremento da atividade de peroxidases e
437 quitinases ( Pereira et al., 2008)
438 Considerando os resultados obtidos, pode-se inferir que o citral é o
439 componente responsável pela atividade bactericida do óleo de capim-limão sobre
440 Pcb e controle da podridão em couve-manteiga, nos ensaios realizados.
441 Diferentemente, o acetato de eugenol, não mostrou ser responsável pela eficácia do
442 óleo de cravo, pois mesmo em concentração maior que o óleo de cravo apresentou
443 resultados insatisfatórios. Isto sugere que a ação do óleo de cravo é dada pelo efeito
444 sinérgico dos seus constituintes. De acordo com Burt (2004) e Bakalli et al. (2008) o
445 sinergismo é observado quando o efeito das substâncias combinadas é maior do
64
446 que os efeitos individuais, uma vez que, os óleos essenciais são misturas complexas
447 de numerosas moléculas.
448 CONCLUSÃO
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