Informe Técnico Final 2 7 1 3 1 1 1

SECRETARÍA DE EDUCACIÓN PÚBLICA
SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO
INSTITUTO TECNOLÓGICO DEL VALLE DE MORELIA
“Evaluación de las poblaciones microbianas presentes en un reactor UASB

alimentado con la FORSU”
REPORTE TÉCNICO DE RESIDENCIA PROFESIONAL
QUE PRESENTA:
Iris Sandoval Rojas
COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERÍA AMBIENTAL
ASESOR INTERNO: M.C.I.A. Carmen Cecilia García Castillo
ASESOR EXTERNO: D. en C. Ma del Carmen Chávez Parga
MORELIA, MICHOACÁN, DICIEMBRE 2018

II
Agradecimientos
“El poner nuestro mejor empeño y luego decidir ser felices en nuestras
circunstancias sean cuales sean nos trae paz y satisfacción… No podemos
dirigir el viento, pero podemos ajustar las velas” Thomas S. Monson.
A Dios:
Por cada que me bendijo y me bendice, sin pedirme nada, por no dejarme en mi camino porque cada
obstáculo que veía el me daba una señal de que las cosas pasaban por algo, siempre me acompaño y
puso a las personas indicadas en mi camino.
A mi familia:
Adela, Rafael, Rafa, Tey, Salo, Gaby, Lacho, Jael, Ruth, Grey, Meli, Mari, Dari y Lluvi, Por darme la
oportunidad de poder estudiar y animarme de que siempre se podía, el luchar por mis sueños y ver
más allá de lo que podía ver, le agradezco mucho a mi mamá, es para mí un ejemplo a seguir por ser
una mujer perseverante, a mis hermanita lluvi que siempre veía en mi lo que yo no veía en mí, por
cada momento que estuvo conmigo y no me dejo. Los quiero
A mis Maestros:
De forjarme para poder ser un profesionista con valores y conocimientos gracias, así como mis
asesoras que estuvieron viendo por mí.
Así como a la Profa. Clau que me enseño mucho, a Daniel de igual manera, a la Doctora Ale que me
ayudó mucho y me guio, sin olvidar a Julio que me ayudó mucho me guio, me motivo cuando yo ya no
podía, en verdad muchas gracias.
A mis Amigos: Luis, Ami, Roy, Adrian, Carlos, Angelito, Chelis, Javi, Sam, Kenia por pasar con ustedes
alegrías y de todo gracias por su apoyo.
III
Resumen
Actualmente en México se tiene una producción del 52.4 % aproximadamente de
residuos orgánicos lo cual ocasiona graves problemas de contaminación ambiental
y salud pública, mediante la implementación de un reactor anaerobio UASB, se
pretende mitigar los efectos que se generan, así como la obtención de biogás.
Por consiguiente, el presente proyecto tuvo como objetivo el desarrollar técnicas

microbiológicas de aislamiento e identificación de poblaciones bacterianas
presentes en el lodo anaerobio; así como su aplicación en el estudio de un reactor
UASB alimentado con la FORSU (Fracción Orgánica de Residuos Urbanos), para
la evaluación de las poblaciones existentes en las etapas del reactor siendo el
arranque, estabilización y la obtención de biogás.
Para el cumplimiento de los objetivos, se emplearon medios sólidos específicos en

el aislamiento primario y secundario, evaluando los grupos de bacterias
Hidrolíticos (bacterias proteolíticas, Lipolíticas, Celulolíticas, Amilolíticas),
Fermentativos (Glucolíticas) y Acidogénicas (Acidogénicas); posteriormente el
aislamiento de una cepa a en un medio líquido para llevar a cabo la Tinción de
Gram, realizando un muestreo microbiológico en el lodo anaerobio, en el arranque
del reactor, estabilización y la generación de biogás.
Durante el muestreo microbiológico existió el desarrollo de las bacterias

proteolíticas identificándose Staphylococcus y Bacillus, Gram positivos y Gram
negativos respectivamente, en el grupo de las Lipolíticas , Bacillus cortos Gram
positivos, Bacillus cortos Gram negativos, Staphylococcus Gram positivos, en las
Amilolíticas Cocos Gram negativos, Estreptococos Gram positivos, así como en
las Glucolíticas Staphylococcus Gram positivos, Bacillus Largos Gram positivos,
Bacillus cortos Gram negativos, Streptococcus Gram negativos, finalmente en las
Acidogénicas, Bacillus cortos Gram positivos, Estreptobacillus Gram positivos.
IV
Contenido
Resumen
Lista de figuras
1. Introducción......................................................................................................................... - 1 -
2. Antecedentes....................................................................................................................... - 3 -
3. Objetivo general.................................................................................................................. - 8 -
3.1 objetivos específicos ...................................................................................................... - 8 -
4. Justificación ........................................................................................................................ - 9 -
5. Fundamento teórico ........................................................................................................ - 10 -
5.1 Residuo ............................................................................................................................ - 10 -
5.1.1 Clasificación de residuos ..................................................................................... - 10 -
5.1.2 Tratamiento de los Residuos Sólidos Urbanos (FORSU). ........................... - 12 -
5.1.2.1 Tratamiento Anaerobio. ..................................................................................... - 13 -
5.2 Reactor UASB ................................................................................................................. - 14 -
5.2.1 Funcionamiento de Reactor UASB. ................................................................... - 15 -
5.3 Digestión Anaerobia ..................................................................................................... - 17 -
5.3.1 Etapas de la digestión anaeróbica. ................................................................... - 18 -
5.4 Grupos microbianos ..................................................................................................... - 21 -
5.4.1 Bacterias hidrolíticas y fermentativas (GRUPO I) ........................................ - 21 -
5.4.2 Bacterias acetogénicas (GRUPO II).................................................................. - 22 -
5.4.3Bacterias homoacetógenas (GRUPO III) ........................................................... - 23 -
5.4.4 Bacterias metanogénicas (GRUPO IV Y V) ...................................................... - 23 -
6. Metodología ....................................................................................................................... - 25 -
6.1 Localización y condiciones de muestreo................................................................ - 25 -
6.2 Aislamiento e Identificación de microorganismos cualitativamente............... - 25 -
6.2.1 Aislamiento primario (siembra) .............................................................................. - 25 -
6.2.2 Aislamiento secundario (resiembra). .................................................................... - 26 -
6.2.3 Tinción de GRAM.................................................................................................... - 26 -
6.2.3.1 Aislamiento de una cepa en caldo nutritivo. ................................................... - 26 -
7. Resultados y problemas resueltos .............................................................................. - 27 -
V
7.1 Localización y condiciones de muestreo............................................................... - 27 -
7.2. Aislamiento primario, secundario y Tinción de Gram del Grupo de Bacterias
Hidrolíticas del reactor anaerobio UASB. ..................................................................... - 27 -
7.2.1. Aislamiento primario de Bacterias Proteolíticas .......................................... - 27 -
7.2.2 Bacterias Lipolíticas .............................................................................................. - 30 -
7.2.3 Bacterias Amilolíticas ........................................................................................... - 33 -
Fermentativas del reactor anaerobio UASB. ............................................................... - 35 -
7.3.1 Bacterias Glucolíticas ......................................................................................... - 35 -
Acidogénicas del reactor anaerobio UASB.................................................................. - 38 -
7.4.1 Bacterias Acidogénicas ...................................................................................... - 38 -
8. Conclusiones..................................................................................................................... - 42 -
9. Recomendaciones............................................................................................................ - 43 -
10. Referencias bibliográficas ......................................................................................... - 44 -
11. Anexos ............................................................................................................................ - 48 -
VI
Lista de figuras
Figura 1.Composición por tipo de residuo de los RSU (SEMARNAT, 2012) .................. - 11 -
Figura 2. Categoría de residuos para su valorización (DGGMAR, 2013) (SEMARNAT,
2012). ........................................................................................................................................... - 12 -
Figura 3. Procesos bilógicos para el tratamiento de los residuos sólidos orgánicos. ... - 13 -
Figura 4. Tipos de reactores biológicos (Márquez Vázquez & Martínez González, 2011). .. -
14 -
Figura 5. Estructura de un reactor UASB típico.................................................................... - 15 -
Figura 6. Representación esquemática de un reactor UASB y la variación de la
concentración de lodo con altura. ............................................................................................ - 16 -
Figura 7. Digestión anaerobia: Etapas y grupos microbianos implicados ........................ - 21 -
Figura 8. Aislamiento primariode las colonias bacterias proteolíticas en cuatro etapas del
reactor UASB, A) lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C) estabilización,
D) generación de biogás. .......................................................................................................... - 29 -
Figura 9. Bacterias proteolíticas A) Staphylococcus y Bacillus; Gram positivos y Gram
negativos respectivamente. ..................................................................................................... - 30 -
Figura 10. Aislamiento primario de las colonias bacterias proteolíticas en cuatro etapas
del reactor UASB, A) lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C)
estabilización, D) generación de biogás. ................................................................................ - 31 -
Figura 11. Bacterias Lipolíticas del reactor anaerobio UASB. .. ¡Error! Marcador no definido.
Figura 12.Aislamiento primario de las colonias de bacterias Amilolíticas en cuatro etapas
del reactor UASB,A) lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C) estabilización
Figura 13. Bacterias Amilolíticas Cocos Gram Negativos y estreptococos...................... - 35 -
Figura 14. Aislamiento primario de las colonias de bacterias Glucolíticas en cuatro etapas
del reactor UASB,A) lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C) estabilización
Figura 15. Bacterias Glucolíticas del reactor UASB. ........................................................... - 38 -
Figura 16. Aislamiento primario de las colonias de bacterias Acidogénicas en cuatro
etapas del reactor UASB, A) lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C)
estabilización D) generación de biogás. ................................................................................. - 40 -
VII
1. Introducción
En la actualidad, las urbes generan una gran cantidad de residuos sólidos urbanos
(RSU), generados en las casas habitación que se derivan de la eliminación de
residuos utilizados en las actividades domésticas, provenientes de envases o
embalajes principalmente de productos de consumo. Los procedentes de alguna
actividad en la vía pública o algún establecimiento que genere residuos con
características domiciliarias, (SEMARNAT, 2012).
Aumentando considerablemente en las últimas décadas y es previsible que

continúen creciendo y constituyendo un problema ambiental que lo sitúa en las
cuestiones prioritarias a resolver, (Forster-Carneiro, L.A. Fernández, Pérez García,
Romero García, & Álvarez Gallego, 2004), teniendo presente que los RSU
orgánicos generan contaminantes y gases de efecto invernadero, contaminación
de los suelos y cuerpos de agua, además de contribuir a la proliferación de fauna
nociva y transmisión de enfermedades (SEMARNAT, RESIDUOS , 2012).
La Fracción Orgánica de Residuos Sólidos Urbanos (FORSU), alimentos

putrescibles, papel y cartón, ropas y telas (productos textiles, residuos de jardín
(restos de poda y follaje), madera (fragmentos, serrín, etc.), otros restos orgánicos
(huesos, cueros, etc.) y su manejo es especialmente complicado debido al alto
contenido de humedad y a la rápida putrefacción (Lastra Bravo, 2013).Es por eso
que la Ley General para la Prevención y Gestión Integral de los Residuos
(LGPGIR) (2012) tiene un sistema de manejo integral para los RSU así como para
la FORSU, el cual tiene un apartado donde describe los tratamientos bajo los
criterios de (PNPGIR, 2012), divididos en físicos, químicos y biológicos; donde los
biológicos se dividen en aerobios y anaerobios.
Los procesos anaerobios son aquellos que se llevan en ausencia de oxigeno

donde ocurre la digestión anaerobia la cual está dividida en cuatro fases que son:
hidrólisis, acidogénesis o fermentación, acetogénesis y la metanogénesis teniendo
la finalidad de formación de biogás.
Esencialmente es posible dividir los reactores anaerobios en dos tipos de acuerdo

al tipo de crecimiento microbiano que se presenta: a) lecho fijo, siendo estos los
reactores donde se lleva a cabo el crecimiento en forma de biopelícula y b)
crecimiento libre o en suspensión, donde los microorganismos se encuentran
libres dentro del reactor( Márquez Vázquez & Martínez González, 2011), entre los
reactores de crecimiento libre o suspendido podemos encontrar al reactor Upflow
Anaerobic Sludge Blanket (UASB) o Reactor Anaerobio de Manto de Lodos de
Flujo Ascendente (RAFA), el cual se caracteriza por poder soportar cargas
orgánicas elevadas y aun así tener una remoción eficiente y una buena
estabilidad; los desechos son introducidos por la parte inferior del reactor, el flujo
ascendente pasa a través de un lecho de fango que contiene partículas formadas
biológicamente. La digestión ocurre cuando hay contacto entre el material
orgánico y las partículas( Chiriboga Novillo, 2010). Estos han sido empleados para
tratar aguas residuales industriales, domésticas, municipales y lodos residuales,
obteniendo excelentes resultados (Ramalho, 2003. ).
Es por eso que se busca que exista una mayor eficiencia en estos procesos, una
parte fundamental de la digestión anaerobia es la existencia de consorcios
microbianos en el inóculo, los cuales presentan un comportamiento mutualista;
que dan como resultado la descomposición de sustancias orgánicas complejas en
compuestos simples, obteniendo como producto metano y CO 2 (Biogás) (Takashi
Narihiro, 2015).
Por lo tanto se realizará la implementación de técnicas microbiológicas de

aislamiento e identificación enfocadas en los lodos presentes en reactor UASB en
el arranque, monitoreo y la obtención de biogás que será alimentando con la
FORSU, para de esta manera conocer los consorcios microbianos existentes(Villa
Gómez & Ramos Alvarez , 2000)
2. Antecedentes
En la actualidad, el estudio microbiano en los procesos anaerobios es de gran

importancia, dado que en base a estos es posible brindar las condiciones
ambientales necesarias para favorecer la proliferación de ciertos grupos
microbianos presentes en un reactor anaerobio,(Villa Gómez & Ramos Alvarez ,
2000)
El estudio realizado se llevó a cabo una enumeración, aislamiento e identificación

de bacterias anaerobias no metanogénicas presentes en el lodo del reactor
experimental UASB, en el proceso de doble etapa, donde se empleó la técnica del
NMP en viales de penicilina con 9 ml de medio reducido YPG para las bacterias
hidrolíticas y el medio líquido Touzel y Albanac para las bacteria metanogénicas
acetoclásticas, en el aislamiento e identificación usaron el método de
enriquecimiento sucesivo y después en el medio reductivo contenido en el agar, se
usó en esquema de Holdeman L.W respectivamente, se obtuvo que existe una
flora heterofermentativa compuesta en su mayoría por Bacilos Gram positivos
anaerobios y Streptococcus, productores de ácidos lácticos y acético precursores
del gas metano y las bacterias más frecuentes aisladas pertenecieron a géneros
de Bacillus, Clostridium, Eubacterium y Streptococcus.(Villa Gómez & Ramos
Alvarez , 2000)
En la investigación usaron cargas de 2 y 3 kgDQO/m 3 d de glucosa. Los

parámetros fisicoquímicos medidos fueron pH, DQO, temperatura, alcalinidad
total, sólidos suspendidos volátiles, % de metano y volumen de biogás. Se utilizó
la metodología convencional para el aislamiento e identificación de bacterias
anaerobias. Los grupos fisiológicos encontrados en el lodo anaeróbico estudiado
fueron: Bacterias fermentadoras de glucosa (BFG), Bacterias nitrato reductoras
(BNR), Bacterias sulfato reductoras (BSR) y Bacterias metanogénicas (BM). Los
resultados fueron homogéneos a lo largo del proceso de degradación anaeróbica
mostrando que las variaciones de los parámetros fisicoquímicos inherentes al
-3-
mantenimiento del reactor anaeróbico mesofílico, no influyeron en la biodiversidad
encontrada.(Escorihuela, Chávez, RangeI, Daimarys , Díaz, & Rincón, 2001).
Su trabajo consto en el estudio del comportamiento de reactores anaerobios de

residuos sólidos a través de ensayos microbiológicos fue realizado teniendo en
cuenta dos aspectos fundamentales: el comportamiento de diferentes grupos
tróficos representativos del proceso: glucolítico, sulfato reductor y metanogénico y
la potencialidad, medida sobre la base de la actividad metanogénica específica.
Los resultados demostraron que el pre tratamiento químico le proporciona a la
digestión posterior el mejor sustrato a bio-degradar. La alternativa del pre-
tratamiento térmico del residuo debe ser evitada si el tratamiento posterior es un
proceso de digestión con tiempos de retención hidráulica de 10 d .Se corroboró
que la disminución del número de microorganismos en el digestor térmico es
consecuencia de las limitaciones en la difusión interna, a través de la capa de
microorganismos que conforman la biomasa. La fuerte correlación encontrada
entre la actividad metanogénica específica y el conteo de los microorganismos a
través de la técnica del número más probable, puede ser explicada a través del
modelo Log NMP = 36,1878 AME, donde NMP es el número más probable de
microorganismos y AME la actividad metanogénica específica.(Torres López, Villa
Gómez, & Escobedo, 2004)
En la investigación caracterización microbiológica de lodos anaerobios utilizados

en el tratamiento de la fracción orgánica de los residuos sólidos urbanos
presentaron los resultados obtenidos de la caracterización microbiológica de un
reactor anaerobio en dos fases para el tratamiento de la Fracción Orgánica de los
Residuos sólidos Urbanos (FORSU) mediante recuentos por sensibilidad al
oxígeno y grupos metabólicos por la técnica del Número Más Probable (NMP). Se
encontró un predominio de la población fermentativa (10 5 – 106 NMP ml-1),
seguida por la acetogénica (105 NMP ml- 1) y la sulfatorreductora (104 – 105 NMP
ml-1) en el reactor acidogénico. No se detectó competencia entre la población
sulfatorreductora (104 – 105 NMP ml- 1) y la metanogénica (105 NMP ml-1) en el
reactor metanogénico. Se observaron principalmente los géneros, Methanotrixsp,
-4-
Methanosarcina sp, Methanoccocus sp y Methanobacterium sp.(Sandoval C. ,
Carreño , Castillo , & Vergara, 2007).
La investigación se basó en sobre la importancia de desarrollar un inóculo

debidamente caracterizado e identificado, para lograr un biogás con la calidad
energética óptima. Se propone una hipótesis sobre la relación de inóculos
empíricos a base de excreta de cerdo, con los problemas de rendimiento de
metano, debido la competencia de las bacterias reductoras de sulfatos y las
arqueas metanógenas acetoclásticas, por el acetato.
Se analizaron las especies más comunes en reactores y se expuso una estrategia
mediante un esquema general, para la confección de metodologías y para una
correcta selección de cepas metanógenas de ambientes autóctonos.
Se enumeraron los diferentes métodos de aislamiento e identificación establecidos
para un estudio taxonómico polifásico, que permita obtener cepas autóctonas de
ambientes naturales o fermentadores, se observó la posible competencia entre el
grupo de BSR y las arqueas metanógenas acetoclásticas, por el acetato generado
en la fermentación de las BHA, concluyendo que los lodos obtenidos a partir de
excretas de cerdo brindan los consorcios microbianos idóneos para los procesos
anaerobios en su país.(Yoandy Ferrer, 2010)
En esta investigación de la Diversidad microbiológica del lodo anaerobio durante el

tratamiento de aguas de producción petroleras venezolanas; se compararon las
abundancias microbianas presentes en el lodo granular de dos reactores
anaerobios de manto de lodo con flujo ascendente (UASB): el primero alimentado
con aguas de producción de petróleo liviano (31.1-39.0°API), provenientes de la
región zuliana (Venezuela) (APP) y el segundo con glucosa. En tal sentido, se
monitorearon las poblaciones de bacterias fermentadoras de glucosa (BFG),
bacterias acetogénicas (BAC), metanógenos (MET), bacterias sulfato-reductoras
(BSR), bacterias nitrato-reductoras (BNR) y heterótrofos, usando medios de cultivo
selectivos. La densidad de los grupos microbianos estuvo correlacionada con los
-5-
parámetros fisicoquímicos: pH, alcalinidad total, DQO, SO4=, NO3-, así como con
los porcentajes de CH4, CO2 y de N2 en el biogás.
Los resultados exhiben diferencias significativas entre la diversidad microbiana de

ambos reactores, con una proporción de BFG > BSR > MET > BAC > BNR para el
reactor con glucosa y de MET > BNR > BAC > BSR > BFG para las APP. La
abundancia de bacterias en el reactor con glucosa estuvo en el orden de 108,
mientras que en el reactor con APP fue de 10 5, lo cual resulta de la composición
orgánica y mineral de los afluentes. Los resultados presentados en este estudio
aportan evidencias sobre la dinámica poblacional en lodos de reactores
anaerobios UASB, durante el tratamiento de aguas de producción
petrolera.(Cajacuri, Rincón , Araujo , Behling , Colina , & Marín L. , 2013).
En la siguiente investigación realizada que fue el Análisis comunitario microbiano

de reactores anaerobios en el tratamiento de aguas residuales, ellos trataron
reactores de lecho anaeróbico (AP) e híbrido (HP) que contenían consorcios
microbianos metanogénicos para tratar aguas residuales de refrescos sintéticos
que contenían polietilenglicol (PEG) y fructosa como constituyentes primarios,
alcanzaron una alta eficiencia de eliminación de la DQO (> 95%) funcionando
constantemente durante 2 años.
Para la identificación usaron el método 16S rRNA obteniendo un total de 25

biofilms muestras generadas 98.057 lecturas, que se agruparon en 2.882 unidades
taxonómicas operativas (OTUs). Ambos AP y HP comunidades fueron
predominantes por Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Otros OTUs
relacionados de Geobacter y Spirochaetes no caracterizados y con el GN04
también fueron detectados con abundancia alta; Sin embargo, su relación con el
tratamiento de aguas residuales sigue siendo poco clara. En particular, KSB3,
GN04, Bacteroidetes y Chloroflexise asocian consistentemente con el aumento de
la tasa de carga orgánica (OLR) a 1,5 g COD / L-d. Curiosamente, KSB3 y GN04
disminuyen dramáticamente en ambos reactores después de un aumento
adicional de OLR a 2,0 g COD / L-d. Estos resultados indican que la OLR influye
fuertemente en la composición de la comunidad microbiana. Esto sugiere que los
-6-
consorcios no específicos no cultivados pueden desempeñar un papel central en
la eliminación de la DQO de las aguas residuales de los refrescos.(Takashi
Narihiro, 2015).
-7-
3. Objetivo general
Evaluar el desarrollo de las poblaciones microbianas presentes en los lodos

presentes anaerobios en un reactor UASB alimentado con la FORSU bajo
condiciones operativas no controladas.
3.1 objetivos específicos
• Establecer las técnicas de aislamiento microbiológicas bajo los estándares

correspondientes.
• Identificar los grupos bacterianos presentes en el inoculó, arranque de

reactor, estabilización y en la obtención de biogás.
• Evaluar los grupos bacterianos presentes en los lodos anaerobios de

manera cualitativa por medio de la técnica de Tinción de Gram.
-8-
4. Justificación
En México el porcentaje de residuos alimenticios, de jardines y materiales

orgánicos similares es del 52.4% respecto al 100%; de los Residuos Sólidos
Urbanos (RSU), provocando problemas en el medio ambiente tales como la
generación de gases de efecto invernadero, lixiviados provocando contaminación
de suelos y agua; así como la proliferación de fauna nociva y transmisión de
enfermedades(INECC & SEMARNAT, 2012); mostrando que es un porcentaje
bastante alto.
Por lo cual es necesario la implementación de procesos eficientes para el

tratamiento de dicha fracción, dentro de los cuales la digestión anaerobia muestra
la ventaja de la degradación de materia orgánica convirtiéndola en biogás; a causa
de la acción combinada de diferentes poblaciones microbianas; junto con una baja
producción de biomasa; implementada en los reactores anaerobios siendo un
tratamiento económicamente viable, de bajos costos, fácil operación y como se
mencionaba anteriormente permite la recuperación de energía que podría ser
empleada como como combustible (García Castillo, 2012),(Díaz Báez, Espitia
Vargas, & Molina Pérez, 2002).
El presente trabajo plantea establecer técnicas de aislamiento e identificación

microbiológicas para su aplicación en el estudio de un reactor UASB alimentado
con la FORSU; para así identificar y evaluar los consorcios microbianos
predominantes en el reactor. Con el fin de conocer algunas características del
consorcio presente para tener en cuenta las exigencias y limitaciones del mismo
con vistas a obtener un funcionamiento óptimo en el reactor anaerobio UASB.(Villa
Gómez & Ramos Alvarez , 2000).
-9-
5. Fundamento teórico
5.1 Residuo
Residuo es todo resto, material resultante de un proceso de producción,
transformación, utilización que sea abandonado; que su poseedor o productor
tenga la obligación o decida desprenderse de él ( Bertolino, Fogwill, Chidiak,
Cinquangelis, & Forgione, 2010).
Los residuos sólidos son cualquier material generado en los procesos de

extracción, beneficio, transformación, producción, consumo, utilización, control o
tratamiento cuya calidad no permita usarlo nuevamente en el proceso que lo
genero (LGPGIR, 2015).
5.1.1 Clasificación de residuos

Estos se clasifican en diferentes criterios tales como su origen, composición y el
tiempo que tardan en degradarse. De acuerdo a su origen y composición, la Ley
General para la Prevención y Gestión Integral de los Residuos, los clasifica en
residuos peligrosos, residuos de manejo especial y los residuos de sólidos
urbanos.
Los residuos peligrosos (RP), tienen algunas características CRETIB

(corrosividad, reactividad, explosividad, toxicidad, inflamabilidad y agentes
biológicos infecciosos) así como envases recipientes, embalajes y suelos que
hayan estado expuestos a contaminarse con estos residuos al ser transferidos a
otro sitio en términos dispuestos en la Norma Oficial Mexicana NOM- 052-
SEMARNAT-2006 (SEMARNAT, 2012)
Los residuos de manejo especial (RME) generados en los procesos productivos

que no reúnen las características para ser considerados como residuos peligrosos
y sólidos urbanos, son producidos en cualquier actividad relacionada con la
extracción, transformación, utilización de materiales para brindar servicios y bienes
como servicios de salud, actividades pesqueras, agrícolas, silvícolas, forestales,
servicios de transporte entre otros que se puntualizan en (LGPGIR, 2015)
- 10 -
Los residuos sólidos urbanos (RSU) son los generados en las casas habitación
que se derivan de la eliminación de residuos utilizados en las actividades
domésticas, provenientes de envases o embalajes principalmente de productos de
consumo. Los procedentes de alguna actividad en la vía pública o algún
establecimiento que genere residuos con características domiciliarias,
(SEMARNAT, 2012).
Un estudio de fraccionamiento de RSU estableció dos fracciones principales: una

parte orgánica y otra inorgánica; dentro de cada una se pueden distinguir
diferentes elementos:
 Residuos orgánicos: alimentos putrescibles, papel y cartón, plásticos, ropas
y telas: productos textiles, residuos de jardín: restos de poda y follaje,
madera: fragmentos, serrín, etc., otros restos orgánicos: huesos, cueros,
etc.
 Residuos inorgánicos: vidrio, metales, tierra, cenizas, otros no clasificados
(Kiely G., 1997); en la figura 1 se observa la composición de los RSU
generados a nivel nacional en México; mostrando que la fracción orgánica
de los residuos sólidos urbanos (FORSU) con todos los residuos de comida
jardines y materiales orgánicos.
Metales,Aluminio, Textiles, 1.43% Metales Ferrosos , Metales
1.70% 1.08% no
Vidrio, 5.88% Ferrosos
, 0.62%
Plásticos, 10.89%
Residuos de
comida, jardines y
Otros ( pañales materiales
desechables, orgánicos
residuos finos, etc.) similares., 52.44%
, 12.11%
Papel, cartón y
prodcutos del
papel, 13.83%
Figura 1.Composición por tipo de residuo de los RSU (SEMARNAT, 2012)
- 11 -
De esta manera la clasificación de los residuos sirve para evaluar el tipo de
tratamiento al que pueden ser susceptibles y dimensionar de esta forma la
infraestructura requerida; así como clasificar los RSU por categoría en fracción
susceptible de aprovechamiento, fracción orgánica y otros, Figura 2, para evaluar
el tipo de manejo que se puede emplear en el tratamiento de los residuos y limitar
así el volumen de residuos que se envía a disposición final. De este modo deben
ser evaluadas las alternativas de Reducción, Reúso y Reciclaje (3R´s) o
recuperación del poder calorífico de manera ambientalmente adecuada(DGGMAR,
2013).
60.00%
50.00%
40.00%
30.00%
52.44%
20.00% 35.43%
10.00%
12.11%
0.00%
Fracción orgánica Residuo suceptible de Otros
aprovechamiento
Porcentaje
Figura 2. Categoría de residuos para su valorización (DGGMAR, 2013) (SEMARNAT,

2012).
5.1.2 Tratamiento de los Residuos Sólidos Urbanos (FORSU).

La Ley General Para la Prevención y Gestión Integral de los Residuos (LGPGIR),
tiene un sistema de manejo integral el cual consta de Reducción/ Minimización,
Generación, Separación, Almacenamiento, Recolección y trasporte, Transferencia,
Tratamiento, Disposición final, realizado bajo criterios de (PNPGIR). Los
tratamientos se dividen en físicos, químicos, biológicos, así los describe, teniendo
en cuenta que los biológicos se dividen en aerobios y anaerobios como se
muestra en la Figura 3 se puede apreciar las características y el objetivo del
proceso.
- 12 -
Tratamiento Características Objetivo
Aerobio Conversión con presencia Composta (material

de aire (oxígeno libre) húmico utilizado como
acondicionador del suelo)
Anaerobio Conversión sin presencia Formación de biogás

de aire metano, dióxido de
carbono, composta
Figura 3. Procesos biológicos para el tratamiento de los residuos sólidos orgánicos.
5.1.2.1 Tratamiento Anaerobio.

En los tratamientos biológicos anaerobios, la materia orgánica es utilizada como
alimento por los microorganismos presentes en tanques y reactores. De esta
forma pueden obtener energía necesaria para reproducirse y llevar a cabo sus
funciones vitales. Como esto, los compuestos son transformados en nuevas
células y otros productos que pueden ser más fácilmente separados del
agua(Albar Cabeza de Vaca Inclán, 2008).
5.1.2.1.1 Reactores anaerobios.

Los reactores biológicos utilizados pueden dividirse en dos grupos con base en el
tipo de crecimiento microbiano:
 lecho fijo, formando biopelículas: la biomasa está constituida por bacterias
formando una película sobre un soporte inerte, En ellos la biomasa se
encuentra inmovilizada en, o alrededor de, partículas o superficies inertes
formando biopelículas.
- 13 -
 crecimiento libre o suspendido: dependen de que los microorganismos
formen gránulos o flóculos en el reactor. Las bacterias que crecen en
suspensión deben de formar estructuras que las permitan permanecer en el
reactor y no ser lavadas con el efluente, y la eficiencia del proceso depende
en buena parte de la capacidad del inóculo (lodos/residuos) para
formarlasen la figura 4 se puede apreciar los diferentes tipos de reactores.
(Márquez Vázquez & Martínez González, 2011)
Reactor anaerobio de flujo ascendente

con lecho/manto de lodos (UASB)
Reactor de mezcla completa (CSTR)

Reactores con la
biomasa no unida a
soporte ( lecho
suspendido)
Reactor de contacto (ACP).
Reactores Reactor anaerobio por lotes en serie

biológicos (ASBR)
Reactores con la Reactor anaerobio con deflectores

biomasa unida a un (ABR)
soporte. (lecho fijo)
Filtros anaerobios (AF).
Reactores de contacto con soporte

(CASBER).
Reactores de lecho fluido y lecho

expandido (FB/EB).
Figura 4. Tipos de reactores biológicos (Márquez Vázquez & Martínez González, 2011).
5.2 Reactor UASB

El Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) o Reactor Anaerobio de Manto de
Lodos de Flujo Ascendente(RAFA); se desarrolló entre los años 1976-1980, por el
Profesor Gatze Lettinga de la Universidad de Wageningen en Holanda(Iñiguez
Covarrubias & Camacho López, 2010).Se aplica de forma extensiva debido a su
efectividad en aguas residuales con una alta carga orgánica y a sus ventajas
económicas El funcionamiento del reactor UASB depende tanto de parámetros
- 14 -
físicos como de los procesos biológicos, los cuales determinan la eficiencia de
remoción y la conversión de los compuestos orgánicos(Caicedo Messa, 2006).
5.2.1 Funcionamiento de Reactor UASB.

Consistiendo en introducir por el fondo del reactor el líquido que va a ser tratado,
desde donde fluye hacia arriba a través del manto de lodos compuesto de
partículas o gránulos biológicos densamente formados. Los gránulos de lodo
varían de tamaño, desde 1 a 3 mm. Los gases que se producen bajo condiciones
anaerobias sirven para mezclar los contenidos del reactor a medida que ascienden
hacia la superficie. El gas que asciende ayuda a formar y mantener los gránulos,
mientras que el material, que se mantiene a flote gracias a los gases, se estrella
contra los separadores de gases y se deposita de nuevo sobre la zona en reposo
de sedimentación arriba del manto de lodos mostrándose en la Figura. El gas es
atrapado en un domo colector de gases localizado en la parte superior del reactor.
Para mantener el manto de lodos en suspensión, es necesario que la velocidad de
flujo ascendente tenga un valor entre 0.8 y 1.0 m/h.5 (García Castillo,
2012)(Palomares Rodríguez, 2013).
Figura 5. Estructura de un reactor UASB típico.
- 15 -
El lodo formado en el reactor puede considerarse dividido en dos zonas: la zona
denomina “lecho o cama de lodos”, ubicada en el fondo del reactor; y la zona
denominada “manto de lodos”, que se encuentra sobre la primera. La diferencia
entre estas dos zonas es la compactación del lodo, esto porque en la “cama de
lodos” el lodo es mucho más compacto que en la “manto de lodos” en la figura 6
se puede apreciar las zonas. Los separadores sólido-líquido ubicados en la parte
superior del reactor sirven para sedimentar los sólidos y colectar el gas. Esta
separación crea una zona de bajo nivel de turbulencia en donde un 99% del lodo
en suspensión se sedimenta y es retornado al reactor.
Figura 6. Representación esquemática de un reactor UASB y la variación de la

concentración de lodo con altura.
- 16 -
(López, 1998) estableció que operación y funcionamiento de los reactores UASB
se basa en la digestión anaerobia la cual es dada por la actividad autorregulada
de los diferentes grupos de bacterias que degradan la materia orgánica y se
desarrollan en forma interactiva, formando un lodo biológicamente activo en el
reactor. Dichos grupos bacterianos establecen entre sí relaciones simbióticas de
alta eficiencia metabólica bajo la forma de gránulos cuya densidad les permite
sedimentar en el digestor. La biomasa permanece en el reactor sin necesidad de
soporte adicional.
5.3 Digestión Anaerobia

Se denomina digestión anaerobia al proceso en virtud del cual la materia orgánica
se degrada empleando como aceptor de electrones en su metabolismo nitrato,
sulfato o algún compuesto orgánico; obteniendo como principal producto el biogás
el cual está compuesto principalmente de un 65% metano, 35% dióxido de
carbono aproximadamente, en ausencia de oxígeno y a causa de la acción
combinada de diferentes poblaciones bacterianas; junto con una baja producción
de biomasa.(Díaz Báez, Espitia Vargas, & Molina Pérez, 2002)(García Castillo,
2012)(Palomares Rodríguez, 2013).
Dicho proceso se caracteriza por un conjunto de reacciones asociadas al
metabolismo de numerosas especies de microorganismos; siendo bacterias
anaerobias facultativas quienes desarrollan un metabolismo respiratorio
aprovechando el oxígeno; como fermentativo en ausencia de oxígeno y las
bacterias anaerobias estrictas las cuales dan origen al biogás; utilizan en forma
secuencial los productos metabólicos generados por cada grupo(Caicedo Messa,
2006); ocurriendo en cuatro etapas (hidrólisis, acidogénesis, acetogénesis y
metanogénesis)(Quintero Silva, 2010).
- 17 -
5.3.1 Etapas de la digestión anaeróbica.
5.3.1.1 Hidrólisis o licuefacción

En esta fase las moléculas orgánicas complejas y no disueltas se rompen en
compuestos más simples, mediante la acción de enzimas extracelulares,
secretadas por las bacterias Hidrolíticas (GRUPO I) como se puede ver en la
Figura 7y supone la ruptura de las macromoléculas orgánicas hasta subunidades
pequeñas que puedan atravesar la pared celular(Alcántar González, 2014).
Así las proteínas son degradadas a aminoácidos, los polisacáridos a monómeros

de azúcares y las grasas a polioles y ácidos grasos de cadena larga. La
degradación de los polímeros depende de la naturaleza del inóculo empleado,
pues las diferentes cepas de microorganismos hidrolíticos poseen determinadas
enzimas o pueden llegar a inducirlas(Quintero Silva, 2010).
La etapa de la hidrolisis puede ser una limitante de la biodegradabilidad de la

FORSU, puesconjuntamente con la materia orgánica más asequible a la acción de
las exoenzimas, existe una fracción de materia orgánica muy refractaria,
constituida por las celulosas, hemicelulosas y ligninas que proceden de los restos
vegetales y el papel que acompaña al RSU. Recientemente, han identificado los
microorganismos responsables de la actividad celulosa en los géneros
clostridiumy firmicutes que colonizan la superficie de los sustratos
celulósicos.(Férnandez, 2010), Por otra parte, la hidrolisis está condicionada por la
granulometría y grado de trituración de la FORSU, que resultan determinantes de
la velocidad del proceso.(Palmowski & Müller , 2000).
5.3.1.2 Acidogénesis o Fermentación
En esta etapa de fermentación o acidogénesis por bacterias acidogénicas

(GRUPO I)se metabolizan los productos solubles de la hidrólisis en el interior
- 18 -
celular y se obtienen compuestos de peso molecular intermedio siendo ácidos
grasos de cadena corta como el ácido acético, fórmico, propiónico, butírico,
butirato, láctico, valérico conocidos más como Ácidos Grasos Volátiles (AGV´S)y
alcoholes, además de otros subproductos importantes para etapas posteriores
(amoniaco, hidrógeno, dióxido de carbono, etc.)(García Castillo, 2012).En esta
etapa se encuentran activos más organismos en comparación con el resto de las
etapas aproximadamente un 90% del total de los microorganismos involucrados
en el proceso de digestión anaerobia son acidogénicos.(Alcántar González, 2014).
5.3.1.3 Acetogénesis
En la tercera etapa, conocida como acetogénesis, el resto de los productos

acidogénesis, es decir, el ácido propiónico, ácido butírico y alcoholes son
transformadas por las bacterias acetogénicas (GRUPO II) en dióxido de carbono e
hidrógeno, y ácido acético.( Rosenkranz Fernández, 2013). Esta etapa puede
desarrollarse a partir de dos rutas diferentes.
1.-Deshidrogenación acetogénica, que genera acetato a partir de otros ácidos
grasos y algunos alcoholes. Como se indicó anteriormente, la formación de
acetato depende de la concentración de H2 existente, pero además, la
degradación del propionato a acetato se paraliza cuando existen concentraciones
de H2 del orden de 500-50.000 ppm en el biogás.
2.- Hidrogenación acetogénica, algunos autores admiten la existencia de otras

bacterias denominadas homoacetogénicas (GRUPO III), que pueden crecer
autotróficamente con dióxido de carbono e hidrógeno para producir acetato
(reacciones de hidrogenación acetogénica) cuando las metanogénicas utilizadoras
de H2 están inhibidas debido a un pH bajo. Así, se considera que el intercambio de
hidrógeno es tan rápido en el digestor que originan diferentes microambientes con
diferentes presiones de hidrógeno, donde ambas reacciones (acetogénicas y
homoacetogénicas) se dan conjuntamente.(Alcántar González, 2014).
- 19 -
5.3.1.4 Metanogénesis
Etapa final del proceso de digestión anaerobia de la materia orgánica; donde la
mayor parte de la energía química contenida en el sustrato es convertida en
metano; a través de dos vías principales: metanogénesis hidrogenofílica y
metanogénesis acetoclástica.(Alcántar González, 2014)(Férnandez, 2010). El
desarrollo del proceso de producción de biogás depende del sustrato que se
encuentre en mayor concentración en el medio proceso de tratamiento anaerobio.
1.- La metanogénesis hidrogenofílica es realizada por bacterias metanogénicas

hidrogenofílicas (GRUPO IV). Estas bacterias utilizan el hidrógeno como donador
de electrones y el CO2 como aceptor para producir metano.(Metcalf y Eddy ,
2003)Esta vía contribuye con la generación de un 28% del metano de un proceso
de tratamiento anaerobio.(Caicedo Messa, 2006)(Quintero Silva, 2010).
2.-La metanogénesis acetoclástica es un proceso catabólico que contribuye en la

generación del 72% del total del metano producido. En esta vía el acetato es
convertido en metano. Los grupos de microorganismos implicados en la
generación de metano a partir de acetato se conocen como bacterias
metanogénicas acetoclásticas (GRUPO V).(Quintero Silva, 2010).
- 20 -
Figura 7. Digestión anaerobia: Etapas y grupos microbianos implicados
5.4 Grupos microbianos

Anteriormente se consideraba que sólo existían tres grandes grupos tróficos; pero
actualmente esta teoría está en desuso y se acepta una descripción más detallada
que considera hasta cuatro etapas; con la salvedad de que la homoacetogénesis
sólo es aceptada por algunos autores(Férnandez, 2010)(IDAE, 2007).
5.4.1 Bacterias hidrolíticas y fermentativas (GRUPO I)

Este grupo de bacterias es el responsable de las primeras etapas de la digestión
anaeróbica (hidrólisis y acidogénesis). Este grupo de bacterias es el responsable
- 21 -
de las primeras etapas de la digestión anaeróbica (hidrólisis y acidogénesis). Las
especies anaerobias pertenecientes a la familia de la Streptococcaceae y
enterobacterias y los géneros de Bacteroides, Clostridium, Butyrivibrio,
Eubacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus, son los microorganismos más
comúnmente involucrados en este proceso. Los productos de la hidrólisis de
proteínas, por ejemplo, los péptidos y los aminoácidos, se fermentan a AGV, CO 2,
H2, NH4+, y S2 por acción de bacterias fermentativas como los clostridios.(Alcántar
González, 2014)(Quintero Silva, 2010).
5.4.2 Bacterias acetogénicas (GRUPO II)

Este grupo de bacterias metaboliza ácidos orgánicos de tres carbonos o más
(propionato, butirato, etc), etanol, y algunos compuestos aromáticos como
benzoato convirtiéndolos en acetato, H2 y CO2. Sin embargo para que los
microorganismos pertenecientes a este grupo realicen sus funciones metabólicas
adecuadamente, debe existir una relación simbiótica con bacterias metanogénicas
hidrogenofílicas. Esto se debe a que el consumo de hidrógeno por parte de las
bacterias metanogénicas, mantiene bajo el nivel de la presión parcial del
hidrógeno, proporcionando un ambiente favorable para que las bacterias
acetogénicas degraden los compuestos orgánicos mencionados en acetato, H2 y
CO2. (Férnandez, 2010).
El proceso anterior es comúnmente conocido como transferencia entre especies

de hidrógeno y su importancia radica en la asociación que tiene con la oxidación
del propionato. La acumulación de este acido orgánico puede generar inhibición
de la metanogénesis. Es por esto que la configuración del reactor, los
suplementos de nutrientes, y las características del sustrato, son importantes para
mejorar el metabolismo del ácido propiónico.(Quintero Silva, 2010)(Díaz Báez,
Espitia Vargas, & Molina Pérez, 2002)
- 22 -
5.4.3Bacterias homoacetógenas (GRUPO III)
Las bacterias homoacetógenas se denominan así porque realizan la síntesis de
acetato como producto principal de su metabolismo a partir de fuentes diferentes a
los ácidos orgánicos como CO2 y metanol. Estas bacterias pueden ser autótrofas o
heterótrofas. Las bacterias homoacetógenas autótrofas utilizan una mezcla de
hidrógeno y dióxido de carbono (el CO2 actúa como fuente de carbono) para
realizar los procesos de síntesis de la célula. Algunos homoacetógenos pueden
utilizar monóxido de carbono como fuente de carbono. Las bacterias
homoacetógenas heterótrofas utilizan sustratos orgánicos tales como formato y
metanol como fuente de carbono, para la generación de acetato como producto
final.(Férnandez, 2010)(Quintero Silva, 2010)
1.- Bacterias homoacetógenas autótrofas
CO2+H2 CH3COOH+2H2O
4CO+2H2O CH3COOH + 2CO2
2. - Bacterias homoacetógenas heterótrofas
4HCOOH CH3COOH+ 2CO2+ 2H2O

4CH3OH + 2CO2 3CH3COOH+ 2CO2
5.4.4 Bacterias metanogénicas (GRUPO IV Y V)
Bacterias metanogénicas (grupo 4 y 5): Los microorganismos Metanógenos en la

actualidad se encuentran clasificación taxonómicamente en el dominio Archaea
(antes estaban clasificados dominio Bacteria), teniendo en cuenta sus
características físicas genéticas y filogenéticas. Este grupo es exclusivo de los
microorganismos se diferencian de la bacterias verdaderas por la ausencia de
lípidos de membrana (por ejemplo, peptidoglicano), además de la ausencia de
RNA ribosomal. Los Metanógenos son microorganismos anaerobios obligados,
- 23 -
abundantes en la naturaleza, se encuentran en ambientes anaeróbicos ricos en
materia orgánica, tales como pantanos, ciénagas, lagunas, sedimentos lacustres y
marinos, y el rumen de los animales.(Alcántar González, 2014)(Quintero Silva,
2010).
1.- Bacterias metanogénicas hidrogenofílicas: Los géneros de metanobacterias

hidrogenofílicas más frecuentes en reactores anaerobios son Methanobacterium,
Methanospirillum, y Methanobrevibacter. Estos microorganismos utilizan H2/CO2
como sustratos para realizar la producción de metano.(Quintero Silva, 2010)
2.- Bacterias metanogénicas acetoclásticas: Los dos géneros más importantes de

este grupo son Methanosaeta y Methanosarcina (anteriormente conocidos como
Methanothrix). Methanosarcina, presenta una morfología esférica (coco) formando
racimos grandes, puede utilizar varios sustratos además del acetato para la
producción de metano como el metanol, las metilaminas y a veces H2/CO2. Por
otra parte Methanosaeta, se caracteriza morfológicamente por ser bacilo y crece
sólo en presencia de acetato.(Quintero Silva, 2010)
Estos grupos microbianos no se encuentran libremente en la naturaleza,

demanera contraria, se encuentran asociados en consorcios bacterianos, dentro
de los cuales pueden establecer las diferentes relaciones metabólicas para su
desarrollo y crecimiento. Algunos de los diferentes consorcios microbianos
metanogénicos se describen en el siguiente numeral.(Alcántar González,
2014)(Férnandez, 2010)
- 24 -
6. Metodología
6.1 Localización y condiciones de muestreo

El muestreo microbiológico se realizó a partir del lodo anaerobio de un reactor
UASB alimentado con la FORSU con una carga de 15,000mgDQO / l. Tomando la
muestra cada 30 días preservándola a 4°C; las muestras fueron tomadas en cada
fase del reactor siendo en la etapa de inoculación, de arranque, estabilización y en
la generación de biogás.
6.2 Aislamiento e Identificación de microorganismos cualitativamente

Se realizaron diluciones del lodo, así como una siembra y una resiembra en
medio sólido, para después hacer un último aislamiento en medio líquido y realizar
tinciones de Gram.
6.2.1 Aislamiento primario (siembra)

Se usaron medios específicos sólidos para los grupos bacterianos hidrolíticos,
fermentativos y acidogénicos (Anexo uno).
1.-preparación de los medios de cultivo siendo los siguientes (anexo dos):
Para el Grupo Hidrolítico
I. Medio Plate Count adicionado con 1% v/v leche descremada. Para

identificación de bacterias Proteolíticas (BAP) en el reactor UASB; se usa
para la enumeración de bacterias aerobias de aguas, aguas residuales y
alimentos; la Triptona y el Extracto de Levadura suministran las fuentes de
nitrógeno y de vitaminas, que requieren para el crecimiento una vasta
variedad de microorganismos, la glucosa actúa como fuente de energía.
(DIFCO, 2009).
II. Agar Tributirina se uso para la identificación del grupo bacteriano hidrólitico
que contiene las bacterias lipolíticas (BAL) (Flores Fernández, Zavaleta, &
Chávez-Hidalgo, 2010), ya que muchos alimentos contienen una cantidad
significativa de grasas que pueden ser susceptibles a la hidrólisis. Los
ácidos grasos libres (AGL) liberados; las actividades enzimáticas lipolíticas
- 25 -
de los microorganismos son una de las causas más importantes del
deterioro de los alimentos y un estante limitado
vida. Fue originalmente formulado por Anderson para la detección y
enumeración de microorganismos lipolíticos tales como staphylococcus,
clostridia, marine Flavobacteria y Pseudomonas en productos alimenticios y
otros materiales.(HiMedia, 2015)
I. Medio Mineral adicionado con 1% p/v de almidón soluble (Para bacterias
Amiloliticas) (BAA).
Posteriormente para el Grupo Fermentativo
I. Medio OF basal adicionado con 1% p/v de glucosa.
Finalmente para el Grupo Acidogénico
II. Medio TSIA adicionado con un 1% p/v de sacarosa.
2.- preparación de las cajas de Petri, así como preparación de las diluciones con el
material ya esterilizado.
3.- siembra por estriado e incubación de las cajas de Petri a 35°C por 48 a 72
horas.
6.2.2 Aislamiento secundario (resiembra).

A partir de las colonias encontradas en la siembra se seleccionaron cuatro de
ellas, llevando nuevamente a los medios específicos y de igual manera a las
condiciones de incubación y tiempo que el aislamiento primario.
6.2.3 Tinción de GRAM

Se llevó a cabo por un kit con el código 82000 por materiales y abastos
especializados.
6.2.3.1 Aislamiento de una cepa en caldo nutritivo.

Se realizó utilizando la metodología igual que la del cultivo sólido pero esta vez no
se agregó agar.
- 26 -
7. Resultados y problemas resueltos
Durante los meses de agosto, septiembre octubre y noviembre del 2017 se realizó
el estudio microbiológico de un reactor UASB alimentado con la FORSU
(Desperdicios de un restaurante de mariscos) de esta forma para alcanzar los
objetivos planteados en esta investigación.
7.1 Localización y condiciones de muestreo

En el arranque y monitoreo del reactor UASB alimentado con la FORSU, se realizó
el estudio microbiológico con las observaciones en la variaciones de las
poblaciones microbianas presentes, de igual manera la implementación de las
técnicas microbiológicas de aislamiento e identificación; así mismo se comenzó
con el aislamiento primario, llevándose a cabo en medios de cultivo específicos en
forma sólida; utilizando la técnica de siembra por estría cruzada en cajas de Petri,
incubadas por 24 a 72 horas (Anexo tres).
Posteriormente se llevó a cabo el aislamiento secundario; con la técnica de

siembra de estría cuadrante; (Anexo cuatro) con el objeto de aislar las colonias
significativas; de igual manera en medio líquido en este caso solo para el
aislamiento de una colonia (Anexo cinco); con la finalidad de realizar la
identificación de las bacterias por medio de la tinción de GRAM (Anexo seis).
7.2. Aislamiento primario, secundario y Tinción de Gram del Grupo de

Bacterias Hidrolíticas del reactor anaerobio UASB.
7.2.1. Aislamiento primario de Bacterias Proteolíticas
En el aislamiento primario, el crecimiento de las bacterias proteolíticas del lodo

anaerobio del reactor UASB, se desarrolló por diferentes colonias; con
morfologías singulares, en las cuatro muestras, no existió un cambio tan
significativo ya que en estas se observó la forma de las colonias encontrándose
circulares (Staphylococcus), filamentosas e irregulares (Bacillus), los bordes
encontrados fueron enteros, ondulados (característicos de los bacilos largos como
Bacillus anthracis), filamentosos y lisos (por ejemplo Proteus Vulgaris o
- 27 -
Escherichia coli), la elevación de cada colonia fue plana y convexa, así como la
superficie lisa y plegada, la consistencia era cremosa y membranosa lo anterior se
muestra en la figura 8, estos resultados obtenidos se encuentran dentro de la
morfología de colonias bacterianas manejadas en la literatura (M. Pírez, M. Mota,
2015) (Vargas Flores & Kuno Vargas, 2014).
Sin embargo después de inocular el reactor UASB y comenzar la operación; el

crecimiento de las colonias fue de manera similar; sin embargo se desarrollaron
también colonias de forma puntiforme, pero predominando las filamentosas e
irregulares, después de un mes de monitoreo y operación manteniéndose el
reactor estable, las colonias filamentosas e irregulares predominando así
circulares finalmente en la generación de biogás en el reactor, las colonias que se
desarrollaron; su forma fue circular, puntiforme, filamentosas e irregulares, de igual
manera los bordes fueron enteros, ondulados, filamentosos y lisos, así como la
elevación y consistencia mostrando la misma morfología de las muestras pasadas.
A) Muestra uno.- lodo anaerobio B) Muestra dos.- Arranque del reactor

UASB
- 28 -
C) Muestra Tres.- Estabilización del D) Muestra Cuatro.- Genaración de
reactor UASB biogás
Figura 8. Aislamiento primario de las colonias bacterias proteolíticas en cuatro etapas del reactor UASB, A)
lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C) estabilización, D) generación de biogás.
Posteriormente se realizó el aislamiento secundario, como se muestra en el anexo

cuatro usando la técnica de estriado cuadrante. Así como despues se tomo una
colonia para llevarla aislamiento en caldo nutritivo o enriquecido; mostrando en el
anexo cinco; para llevar a cabo la tinción de Gram para la identificación de las
bacterias existentes como se puede ver en la figura 9; donde las bacterias fueron
Staphylococcus siendo Gram positivos y los Bacillus siendo Gram negativos
concordando con (Villa Gómez & Ramos Alvarez , 2000).
- 29 -
A) Staphylococcus y Bacillus B) Staphylococcus
Figura 9.Bacterias proteolíticas A) Staphylococcus y Bacillus; Gram positivos y Gram negativos

respectivamente.
7.2.2 Bacterias Lipolíticas
Se desarrollaron colonias con diferente morfología en la figura 10; la muestra uno

el en la cual se puedeobservar colonias con forma circular, puntiforme, irregular;
con bordes ondulados, enteros y lobulados,con una elevación plana y convexa,
presentando una consistencia cremosa coincidiendo con la morfologia de las
colonias bacterinas que estan dentro de la literatura. (M. Pírez, M. Mota, 2015)
(Vargas Flores & Kuno Vargas, 2014), en la muestra dos la morfologíase mantuvo
de manera homogenea en su mayoria, ya que sólo existio crecimiento de colonias
de forma rizoide y con borde filamentoso.
En el reactor después de un mes de monitoreo y operación las colonias

nuevamente muestran homogenidad y similitud a la muestra uno como se puede
apreciar, en la muestra cuatro ya con la obtencion de biogás las colonias
permanecieron de igual manera que en las otras muestras pero siendo
representativa las de forma circular.
Posteriormente se realizo el aislamiento secundario con la técnica de estriado por

cuadrante para el aislamiento de cuatro colonias, encontrandose en el (Anexo
- 30 -
cuatro) y asi estas llevarlas a un crecimiento en caldo nutritivo (Anexo cinco), para
la Tinción de Gram (Anexo seis).

UASB
C) Muestra Tres.- Estabilización del D) Muestra Cuatro.- Genaración de

reactor UASB biogás
Figura 10.Aislamiento primario de las colonias bacterias proteolíticas en cuatro etapas del reactor
UASB, A) lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C) estabilización, D) generación de
biogás.
Las bacterias que se identificaron fueron Bacillus en el género Clostridium

posiblemente las especies que podrían ser son Clostridium erfringens, Clostridium
- 31 -
sporogenes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, así como Staphylococcus aureus
las cuales están dentro las bacterias que deben crecer en el medio Tributirina
como se encuentra en la literatura (HiMedia, 2015) (Flores Fernández, Zavaleta, &
Chávez-Hidalgo, 2010). Las bacterias identificadas en cada muestra fueron
diferentes. En la muestra uno en el lodo anaerobio un género de Bacillus Gram
positivos, en la muestra dos siendo en la etapa de arranque las bacterias que
crecieron Bacillus corto Gram negativos, ya en la muestra tres en la estabilización
del reactor se logran ver Staphylococcus (aureus) Gram positivos, en la
generación de biogás se desarrollaron bacterias Staphylococcus aureus Gram
positivos, Bacillus Gram negativos; como se pueden apreciar en la figura 11.
A) Muestra uno.- Bacillus corto Gram positivos. B) Muestra dos.- Bacillus cortos Gram
negativos
- 32 -
C) Muestra tres.- Staphylococcus Gram D) Muestra cuatro.-Staphylococcus Gram
positivos. positivos, Bacillus Gram negativos.
Figura 11. Bacterias Lipolíticas del reactor anaerobio UASB.
7.2.3 Bacterias Amilolíticas

La morfología de las colonias de las bacterias Amilolíticas en el medio mineral
enriquecido con almidón; en las cuatro muestras tomadas; las colonias
presentaron una homogeneidad, sin embargo sólo en la muestra dos en la cual se
llevó a cabo el inicio del monitoreo del reactor existió el crecimiento de colonias en
forma circular siendo cocos, y en general su forma fue puntiforme, los bordes de
las colonias fueron enteros (por ejemplo las bacterias características pueden ser
Proteus Vulgaris o Escherichia coli), con una elevación convexa (S. pneumoniae),
su consistencia se mostró cremosa y mucoide (Klebsiella pneumoniae,
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, como en la literatura de la
morfología de colonias bacterianas (M. Pírez, M. Mota, 2015)(Velasco Lezama &
Tapia Aguilar , 2014).
- 33 -
B) Muestra dos.- Arranque del reactor UASB
A) Muestra uno.- lodo anaerobio
C) Muestra Tres.- Estabilización del reactor D) Muestra Cuatro.- Genaración de biogás

UASB
Figura 11.Aislamiento primario de las colonias de bacterias Amilolíticas en cuatro etapas del
reactor UASB,A) lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C) estabilización D)
generación de biogás.
De igual manera se realizó el aislamiento secundario mostrado en el anexo

cuatro, así como el medio líquido enriquecido en el anexo cinco para la tinción de
Gram. Donde las bacterias identificadas fueron cocos Gram Negativos y
Estreptococos Gram positivos.
- 34 -
B) Estreptococos Gram positivos
A) Cocos Gram Negativos
Figura 12. Bacterias Amilolíticas Cocos Gram Negativos y Estreptococos.

Bacterias Fermentativas del reactor anaerobio UASB.
7.3.1 Bacterias Glucolíticas

El medio OF BASAL el cual se enriqueció con glucosa para el grupo bacteriano
fermentativo, en el Anexo 2 se muestra los reactivos usados donde, se agregó el
hidrato de carbono al 1%, permite que los microorganismos lo usarán para su
desarrollo dicha sustancia, evitando que bacterias aeróbicas metabolicen la
tripteína presente con la consecuente producción de reacción alcalina, la que se
neutraliza por la ligera acidez producida por un microoganismo oxidativo. El fosfato
dipotásico agrega capacidad reguladora, el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH que vira al color amarillo
en medio ácido luego de la oxidación o fermentación del hidrato de carbono.
Donde las muestras mostraron cambios significativos en las colonias que

crecieron, en la muestra uno el lodo anaerobio, se puede ver que las colonias
fueron de diferentes formas como circular (Staphylococcus), puntiforme e
irregular(Bacillus); con bordes enteros, ondulados, lobulado, filamentoso; las
- 35 -
elevaciones fueron planas, convexas y elevadas(Staphylococcus); la superficie se
encontraron lisas, rugosas y en su consistencia cremosa, mucoide (Klebsiella
pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilusinfluenzae) membranosa,
mostrándose en la figura 14 A). (M. Pírez, M. Mota, 2015)(Velasco Lezama &
Tapia Aguilar , 2014).
Después de la inoculación, las colonias del grupo bacteriano fermentativas en la

muestra dos B); las colonias puntiforme e irregulares (Bacillus); con bordes
enteros y ondulado (característicos de los bacilos largos como Bacillus anthracis)
(M. Pírez, M. Mota, 2015). Teniendo de igual manera las elevaciones y
consistencias y superficie que en la muestra uno. En el inciso C) se aprecia el
crecimiento de las colonias de la muestra tres después de un mes de operación
del reactor las colonias predominaron las puntiformes e irregulares; las
elevaciones fueron planas, convexas y elevadas; así como su superficie lisas; en
la consistencia cremosa, mucoide, membranosa.
En la muestra cuatro D) ya existía generación de biogás las bacterias provocaron

una oxidación o fermentación del hidrato de sodio ya que el azul de bromotimol
viro a amarillo el medio; las colonias presentes en su forma fueron circulares e
irregulares, sus bordes enteros, lobulados y ondulados; su elevación fueron
planas, convexas y elevadas; la superficie de estas se encontraron lisas así como
rugosas.
- 36 -
UASB
C) Muestra tres.- Estabilización del reactor

D) Muestra cuatro.- Generación de
UASB
biogás
Figura 13. Aislamiento primario de las colonias de bacterias Glucolíticas en cuatro etapas del
reactor UASB,A) lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C) estabilización D)
Las bacterias identificadas por la técnica de tinción de Gram, después de la

realizar el aislamiento secundario mostrado en el anexo cuatro, así como el
aislamiento en medio líquido fueron Staphylococcus Gram positivos, Bacillus
largos Gram positivos, Bacillus cortos Gram negativos, Streptococcus Gram
negativos.
- 37 -
A) Muestra uno.-Staphylococcus Gram positivos B) Muestra dos.- Bacillus Largos Gram positivos
C) Muestra tres.- Bacillus cortos Gram negativos. D) Muestra cuatro.-Streptococcus Gram negativos.
Figura 14. Bacterias Glucolíticas del reactor UASB.

Bacterias Acidogénicas del reactor anaerobio UASB.
7.4.1 Bacterias Acidogénicas

En el medio TSIA el cual se enriqueció con sacarosa, entonces cuando los
carbohidratos se fermentan, la producción resultante de ácido es detectada por el
- 38 -
indicador rojo fenol; produciéndose cambios de color: amarillo para la producción
de ácido y rojo para la alcalinización. En el anexo 2 se muestra una tabla de
resultados de rendimiento donde se obtiene el tipo de especie encontrada
respecto a la morfología de las colonias en la caja.
La muestra uno A); siendo el lodo anaerobio antes de la inoculación del reactor se
aprecia en la Figura 16, que el color del medio se tornó a un rosa por lo cual los
carbohidratos se fermentaron pero hubo producción de alcalinización, las colonias
presentes fueron amarillas de tamaño pequeño (Enterococcusfaecalis y
Enterococusfaecium), amarillas de medianas a grandes (Escheriacoli) con
resultado positivo a la lactosa), algunas colonias amarillas de tamaño pequeño a
mediano (Staphylococcus aureus), colonias amarillas de tamaño mediano a
grande con zonas de proliferación (Proteus Vulgaris).
En la muestra dos B) y C); después de inocular el reactor UASB y ser alimentado y

llevarse al monitoreo y operación las colonias que crecieron en el medio amarillas
pequeñas (Enterococcus faecalis y Enterococusf aecium), colonias amarillas de
tamaño pequeño a mediano (Staphylococcus aureus), colonias amarillas de
tamaño pequeño a mediano (Staphylococcus aureus), colonias amarillas de
tamaño mediano a grande con zonas de proliferación (ProteusVulgaris).
- 39 -
A) Muestra uno.- Lodo anaerobio
B) Muestra dos.- Arranque del reactor UASB
C) Muestra tres.- Estabilización del

D) Muestra cuatro.- Generación de
reactor UASB
biogás
Figura 15. Aislamiento primario de las colonias de bacterias Acidogénicas en cuatro etapas del
reactor UASB, A) lodo anaerobio antes de la inoculación, B) arranque, C) estabilización D)
Las bacterias identificadas por la técnica de tinción de Gram, después de la

realizar el aislamiento secundario mostrado en el anexo cuatro, así como el
aislamiento en medio líquido fueron Proteus Vulgaris y Enterococcus faecalis
Gram positivos, Bacillus anthracis Gram positivos siendo productores de ácidos
- 40 -
lácticos y acético precursores del gas metano coincidiendo con (Villa Gómez &
Ramos Alvarez , 2000).
A) Muestra uno.-Bacillus cortos Gram positivos. B) Muestra dos.- Bacillus cortos Gram positivos
C) Muestra tres.- Bacillus cortos Gram positivos D) Muestra cuatro.- Estreptobacillus Gram positivos
- 41 -
8. Conclusiones
Al realizar las pruebas microbiológicas en el lodo anaerobio durante el monitoreo

del reactor alimentado con la FORSU (desperdicios de un restaurante de
mariscos), en el aislamiento primario con el crecimiento de colonias bacterianas,
en los medios específicos, se llegó a comprobar de que hubo presencia de los
grupos de bacterias Hidrolíticas, Glucolíticas y Acidogénicas.
En la identificación de las bacterias por medio de la tinción de Gram, en el grupo

bacteriano Hidrolítico, las bacterias proteolíticas en las muestras se identificaron
las mismas bacterias siendo Staphylococcus Gram positivos y Bacillus Gram
negativos, así como en las Lipolíticas Bacillus cortos Gram positivos, Bacillus
cortos Gram negativos, Staphylococcus Gram positivos, en las Amilolíticas Cocos
Gram Negativos, estreptococos Gram positivos, estas bacterias se encuentran en
los rendimientos reportados en la literatura lo que implica que se llevó a cabo la
etapa de hidrolisis.
Pasando al grupo bacteriano Glucolítico, existió la presencia de las bacterias

glucolíticas fueron Staphylococcus Gram positivos, Bacillus Largos Gram positivos,
Bacillus cortos Gram negativos, Streptococcus Gram negativos y en el grupo
bacteriano Acidogénico, las bacterias Acidogénicas presentes fueron Bacillus
cortos Gram positivos, Estreptobacillus Gram positivos, metabolizando los
productos solubles en el interior celular y se obtienen compuestos de peso
molecular intermedio siendo los Ácidos Grasos Volátiles (AGV´S), realizando de
esta manera la etapa de la acidogénesis o fermentación.
- 42 -
9. Recomendaciones
1.- En el proceso de esterilización del material puede considerarse un tiempo de

hasta media hora.
2.- Llevar a cabo las buenas prácticas de higiene y limpieza en el proceso del
aislamiento.
3.- En el uso del microscopio al lograr el enfoque con el objetivo de mayor

aumento debe realizar la observación moviendo constantemente el tornillo
micrométrico para variar los planos de enfoque. De igual manera, abrir o cerrar el
diafragma para regular la intensidad de la luz y mejorar el contraste. Y hacer
inmediatamente sus observaciones.
- 43 -
10. Referencias bibliográficas
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anaerobia y la producción de biogás. Consideraciones en la. REDALYC, 9-
20.
- 47 -
11. Anexos
A.1. Medios específicos para la identificación de los grupos bacterianos.
En la Tabla A.1.1 se presentan los diferentes medios de cultivo utilizados en el

desarrollo del presente estudio.
Tabla A.1.1 Medios a Preparar
Medio Enriquecido Grupo Bacteriano Tipo de Bacteria

Plate Count Proteína de Carne Hidrolíticos Proteolíticas
Tributirina - Hidrolíticos Lipolíticas
Almidón Hidrolíticos Celulolíticas
Mineral
Carboximetilcelulosa Hidrolíticos Amilolíticas
OF Basal Glucosa o Sacarosa Fermentativos Glucolíticas
TSIA Glucosa-Sacarosa Acidogénicas Acidogénicas
A.2. Metodología para el aislamiento de los Grupos de Bacterias.
A.2.1.Metodología Bacterias Hidrolíticas
A) Toma de muestra de lodo y almacenar a 4 °C.
B) Preparar diluciones de lodo:

1) Dilución 1:10.
2) Dilución 1:100.
3) Dilución 1:1000.
Utilizar agua destilada y un matraz de aforo para realizar cada dilución.
C) Preparación de medios:
- 48 -
1) Medio Plate Count adicionado con 1% v/v leche descremada. (Para
bacteriasProteolíticas)(BAP).
2) Agar Tributirina (Para bacterias Lipoliticas)(BAL).
3) Medio Mineral adicionado con 1% p/v de almidón soluble (Para
bacterias Amiloliticas)(BAA).
4) Medio Mineral adicionado con 1% p/v de carboximetilcelulasa (Para
bacterias Celulolíticas)(BAC)
Tabla A.2.1 Medio Plate Count
Medio Plate Count Concentración del Medio:
Triptona 2.5 g/Litro
Dextrosa 0.5 g/Litro
Extracto de Levadura 2.0 g/Litro
Agar Bacteriológico 15.0 g/Litro
pH final 7.0 ± 0.2
El medio se utiliza para la identificación de microorganismos proteolíticos. La

aparición de colinas en las placas indica el desarrollo de microrganismos capaces
de utilizar las proteínas como fuente de energía. La incubación es de hasta 72
horas en condiciones óptimas.
Tabla A.2. 2Medio Tributirina Agar

Medio Tributirina Agar Concentración del Medio:
Extracto de Levadura 3.0 g/Litro
Peptona 5.0 g/Litro
Triburitina 1.0 g/Litro
- 49 -
Agar 15.0 g/Litro
pH final 7.5 ± 0.2
El medio se utiliza para la identificación de microorganismos lipolíticos. La

degradación de tributirina produce halos de aclaramiento alrededor de las
colonias, en contraste con el resto del medio que permanece turbio. La incubación
es de hasta 72 horas en condiciones óptimas.
Tabla A.2.3 Medio Mineral
Medio Mineral Concentración del Medio:
Sulfato de Amonio 3.2 g/Litro
Fosfato de Potasio Monobásico 1.2 g/Litro
Sulfato de Magnesio Heptahidratado 0.5 g/Litro
Cloruro de Calcio 0.2 g/Litro
Cloruro de Sodio 0.2 g/Litro
Agar Bacteriológico 15.0 g/Litro
El medio se utiliza para la identificación de microorganismos amilolíticos y

celulolíticos. La adición de almidón o carboximetilcelulosa respectivamente
- 50 -
facilitara el desarrollo de las colonias. La incubación es de hasta 72 horas en
condiciones óptimas.
D) Esterilización de medios y material a 121 °C y 15 psi durante 15 minutos.

1) Agua destilada.
2) Puntas de micro pipeta para 1 mL y 0.1 mL.
3) Medios de cultivo
4) Matraces de Aforo
5) Probetas.
E) Dejar enfriar material y agua a temperatura ambiente y los medios hasta 55

°C.
F) Previamente se deberá limpiar todo el material que se utilizara e introducirlo

en la campana de flujo laminar durante 20 minutos con luz UV encendida, al
finalizar el periodo de desinfección encender el flujo de aire.
G) Se acomodaran las cajas en la superficie de trabaja y se verter 9 mL

aproximadamente de cada medio y se dejaran inmóviles hasta solidificar.
H) Identificar el tipo de medio de cada caja.
I) Colocar algunas cajas de cada medio en la incubadora a 37 °C durante 24

horas para asegurar la esterilidad de las mismas.
J) Comenzar con la inoculación, tomando 0.05 mL de muestra de cada una de

las diluciones preparadas y colocar en la caja con el medio a utilizar.
K) Colocar parafilm alrededor de las cajas para evitar contaminación.
L) Colocar en incubadora a 37 °C durante a las 24 y 48 horas observar si

existe la presencia de microorganismos.
- 51 -
M) En un contador observar el número de colonias existentes para cada placa
y registrar los resultados.
N) Para desechar las cajas se deberán colocar en una bolsa de plástico y se

esterilizaran a 121 °C y 15 psi durante 15 minutos.
A.2.2. Metodología Bacterias Fermentadoras de Glucosa.
A) Toma de muestra de lodo y almacenar a 4 °C.
B) Preparas diluciones de lodo:

4) Dilución 1:10.
5) Dilución 1:100.
6) Dilución 1:1000.
Utilizar agua destilada y un matraz de aforo para realizar cada dilución.
C) Preparación de medios:
Tabla A.2.3 Medio OF Basal
Medio OF Basal Concentración del Medio:
Tripteína 2.0 g/Litro
Cloruro de Sodio 4.0 g/Litro
Fosfato Dipotásico 0.3 g/Litro
Azul de Bromotimol 0.03 g/Litro
Carbohidrato 1.5 g/Litro
Agar Bateriologico 17.0 g/Litro
- 52 -
pH final 7.1 ± 0.2
En el medio de cultivo, el agregado del hidrato de carbono al 1%, permite que los
microorganismos utilicen para su desarrollo dicha sustancia, evitando que
bacterias aeróbicas metabolicen la tripteína presente con la consecuente
producción de reacción alcalina, la que se neutraliza por la ligera acidez producida
por un microoganismo oxidativo. El fosfato dipotásico agrega capacidad
reguladora, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de
bromotimol es el indicador de pH que vira al color amarillo en medio ácido luego
de la oxidación o fermentación del hidrato de carbono. El contenido de agar otorga
la propiedad de ser un medio semisólido y permite determinar la movilidad y la
distribución de los productos ácidos. También pueden agregarse otros azúcares
(lactosa, sacarosa, maltosa, manitol o xilosa) según el metabolismo del
microorganismo en estudio. Cuando un microorganismo es inoculado en 2 tubos
del medio O.F. conteniendo el mismo hidrato de carbono, y uno de los 2 tubos es
sellado con vaselina o parafina antes de la incubación, se puede diferenciar
correctamente el metabolismo oxidativo o fermentativo así como la no utilización
de un hidrato de carbono por la bacteria en estudio.
Tabla A.2.4 Medio TSIA
Medio TSIA Concentración del Medio:
Caseína 5.0 g/Litro
Cloruro sódico 5.0 g/Litro
Lactosa 1.0 g/Litro
Sacarosa 1.0 g/Litro
Glucosa 1.0 g/Litro
- 53 -
Sulfato Ferroso de Amonio 0.2 g/Litro
Tiosulfato sódico 0.2 g/Litro
Rojo fenol 0.025 g/Litro
Agar Bacteriologico 17.0 g/Litro
pH 7.3 ± 0.2
Cuando dichos carbohidratos se fermentan, la producción resultante de ácido es

detectada por el indicador rojo fenol. Se producen cambios de color: amarillo para
la producción de ácido y rojo para la alcalinización. La sacarosa añadida permite la
exclusión de determinados organismos coliformes y las especies Proteus que
pueden atacar la sacarosa, pero no la lactosa, en un período de incubación de 24
– 48 h. Con un pH neutro o alcalino, el ácido sulfhídrico (producido por el tiosulfato
sódico) reacciona con la sal de amonio ferroso, lo que produce sulfuro de hierro de
color negro. El cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico del medio. La
aplicación original de la fórmula de TSI es como medio en tubo, con una base de
tubo y un área inclinada. Permite la diferenciación de los organismos
fermentadores de glucosa, lactosa y/o sacarosa, además de la detección de la
producción de sulfuro de hidrógeno. Cuando se utiliza como medio en placa, las
reacciones observadas en la capa de agar en la placa se limitan a la formación de
productos alcalinos (producidos a partir de las peptonas del medio, si no se
fermentan la glucosa, lactosa y/o sacarosa) o los productos ácidos de la lactosa
y/o sacarosa que constituyen los azúcares más importantes del medio. Además,
se produce sulfuro de hidrógeno si no se fermenta ningún azúcar hasta formar
productos ácidos, dado que la formación de sulfuro de hidrógeno requiere un pH
de neutro a alcalino.
- 54 -
Tabla A.2.5 Resultados de crecimiento en BD Triple Sugar Iron Agar.
*Los medios pueden ser inoculados en medio inclinado o en placa.
** Este procedimiento se puede realizar en tubo, adicionando 2ml de aceite mineral para que el medio sea
anaerobio.
D) Esterilización de medios y material a 121 °C y 15 psi durante 15 minutos.

1) Agua destilada.
2) Puntas de micropipeta para 1 mL y 0.1 mL.
3) Medios de cultivo
4) Matraces de Aforo
5) Probetas.
E) Dejar enfriar material y agua a temperatura ambiente y los medios hasta 55

°C.
- 55 -
F) Previamente se deberá limpiar todo el material que se utilizara e introducirlo
en la campana de flujo laminar durante 20 minutos con luz UV encendida, al
finalizar el periodo de desinfección encender el flujo de aire.
G) Se acomodaran las cajas en la superficie de trabaja y se verter 9 mL

aproximadamente de cada medio y se dejaran inmóviles hasta solidificar.
H) Identificar el tipo de medio de cada caja.
I) Colocar algunas cajas de cada medio en la incubadora a 37 °C durante 24

horas para asegurar la esterilidad de las mismas.
J) Comenzar con la inoculación, tomando 1 mL de muestra de cada una de las

diluciones preparadas y colocar en la caja con el medio a utilizar.
K) Colocar parafilm alrededor de las cajas para evitar contaminación.
L) Colocar en incubadora a 37 °C durante a las 24 y 48 horas observar si

existe la presencia de microorganismos.
M) En un contador observar el número de colonias existentes para cada placa

y registrar los resultados.
Para desechar las cajas se deberán colocar en una bolsa de plástico y se

esterilizaran a 121 °C y 15 psi durante 15 minutos.
- 56 -
A.3. Aislamiento primario de las bacterias del lodo anaerobio del reactor
UASB.
A.3.1 Aislamiento primario
Tabla A.3.1 Colonias de las bacterias Proteolíticas.
BACTERIAS COLONIAS REPLICA

PROTEOLÍTICAS
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra dos
En el lodo
anaerobio después
de la inoculación del
reactor UASB.
- 57 -
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un mes
reactor UASB.
Muestra cuatro
Lodo anaerobio en
la producción de
biogás en el reactor
UASB.
Tabla A.3.2 Colonias de las bacterias Lipolíticas.

LÍPOLITICAS
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
- 58 -
Muestra dos
En el lodo anaerobio
después de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un mes
reactor UASB.
Muestra cuatro
Lodo anaerobio en la
producción de biogás
en el reactor UASB.
- 59 -
Tabla A.3.3 Colonias de las bacterias Amilolíticas.

AMILOLÍTICAS
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra dos
después de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un mes
reactor UASB.
- 60 -
Muestra cuatro
producción de biogás
en el reactor UASB.
Tabla A.3.4 Colonias de las bacterias Glucolíticas.

GLUCOLÍTICAS
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
- 61 -
Muestra dos
después de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un mes
reactor UASB.
Muestra cuatro
producción de
UASB.
- 62 -
Tabla A.3.5 Colonias de las bacterias Acidogénicas.

ACIDOGÉNICAS
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra dos
En el lodo
anaerobio después
de la inoculación
del reactor UASB.
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un
mes de la
inoculación del
reactor UASB.
- 63 -
Muestra cuatro
Lodo anaerobio en
la producción de
biogás en el
reactor UASB.
- 64 -
A.4. Aislamiento secundario (resiembra) de las bacterias del lodo anaerobio
del reactor UASB.
A.4.1. Aislamiento secundario (resiembra)

El aislamiento secundario o resiembra se realizó eligiendo las cuatro colonias
más predominantes para así hacer un aislamiento.
Tabla A.4.1 Aislamiento secundario (resiembra) de bacterias Proteolíticas
MUESTRA COLONIAS REPLICA
Muestra uno
Muestra dos
- 65 -
Muestra tres
Muestra cuatro
Tabla A.4.2 Aislamiento secundario (resiembra) de bacterias Lipolíticas
MUESTRA COLONIAS REPLICAS
Muestra uno
- 66 -
Muestra dos
Muestra tres
Muestra cuatro
- 67 -
Tabla A.4.3 Aislamiento secundario (resiembra) de bacterias Amilolíticas
MUESTRAS COLONIAS REPLICAS
Muestra uno
Muestra dos
Muestra tres
Muestra cuatro
- 68 -
Tabla A.4.4 Aislamiento secundario (resiembra)de bacterias Glucolíticas
MUESTRA COLONIA REPLICA
Muestra uno
Muestra dos
Muestra tres
Muestra cuatro
- 69 -
Tabla A.4.4 Aislamiento secundario (resiembra)de bacterias Acidogénicas
MUESTRA COLONIAS REPLICA
Muestra uno
Muestra dos
Muestra tres
Muestra cuatro
- 70 -
A.5. Medios de cultivos enriquecidos líquidos para la realización de la tinción
de Gram.
A.5.1.Medios enriquecidos líquidos Crecimiento de los grupos de bacterias
Hidrolíticos (bacterias proteolíticas, Lipolíticas, Celulolíticas, Amilolíticas),
Fermentativos (Glucolíticas) y Acidogénicas (Acidogénicas).
Tabla A.5.1 Crecimiento de las bacterias del grupo Hidrolítico, Fermentativo

y Acidogénico.
Medio liquido
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4
enriquecido
PLATE COUNT
MINERAL
ALMIDÓN
- 71 -
OF BASAL
TSIA
- 72 -
A.6. Identificación de bacterias por la tinción de Gram
A.6.1. Grupo bacteriano Hidrolítico
A.6.1.1. Bacterias proteolíticas
Las bacterias que se aislaron e identificaron fueron, Bacillus subtilis,

Staphylococcus (ANMAT, 2014), así como mostrando que son Gram positivas.
Tabla A.6.1 Bacterias proteolíticas
Bacterias Colonias Replica

proteolíticas
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra dos
En el lodo
anaerobio después
de la inoculación
del reactor UASB.
- 73 -
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un mes
de la inoculación
del reactor UASB.
Muestra cuatro
Lodo anaerobio en
la producción de
UASB.
- 74 -
A.6.1.2. Bacterias Lipolíticas
Las bacterias que se identificaron en la muestra uno que se puede ver en la figura
34 fueron Gram positivas y Gram negativas así como bacillus, Microccus,
estafilococos.(Microkit, 2013)(Flores Fernández, Zavaleta, & Chávez-Hidalgo,
2010).
Tabla A.6.2 Bacterias Lipolíticas

Lipolíticas
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra dos
En el lodo
anaerobio después
de la inoculación
del reactor UASB.
- 75 -
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un mes
de la inoculación
del reactor UASB.
Muestra cuatro
Lodo anaerobio en
la producción de
UASB.
- 76 -
A.6.1.3. Bacterias Amilolíticas
En la tinción GRAM se aprecia las bacterias GRAM positivas y Gram negativas,

así como las bacterias que se pueden son Staphylococcus, Bacillus.(Rodríguez,
Boucourt, Rodríguez, Albelo, Nuñez, & Herrera, 2006).
Tabla A.6.3 Bacterias Amilolíticas

Amilolíticas
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra dos
En el lodo
anaerobio después
de la inoculación
del reactor UASB.
- 77 -
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un mes
de la inoculación
del reactor UASB.
Muestra cuatro
Lodo anaerobio en
la producción de
UASB.
- 78 -
A.6.2.2.Grupo Bacteriano Fermentativo
A.6.1.1. Bacterias Glucolíticas.
Tabla A.6.4 Bacterias Glucolíticas

Glucolíticas
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra dos
En el lodo
anaerobio después
de la inoculación
del reactor UASB.
- 79 -
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un mes
de la inoculación
del reactor UASB.
Muestra cuatro
Lodo anaerobio en
la producción de
UASB.
- 80 -
A.6.2.3.Grupo Bacteriano Acidogénico
A.6.3.1. Bacterias Glucolíticas.
Tabla A.6.5 Bacterias Acidogénicas

Acidogénicas
Muestra uno
Lodo anaerobio
antes de la
inoculación del
reactor UASB.
Muestra dos
En el lodo
anaerobio después
de la inoculación
del reactor UASB.
- 81 -
Muestra tres
Lodo anaerobio
después de un mes
de la inoculación
del reactor UASB.
Muestra cuatro
Lodo anaerobio en
la producción de
UASB.
- 82 -

Informe Técnico Final 2 7 1 3 1 1 1

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5.1.2.1 Tratamiento Anaerobio.

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Reactor anaerobio de flujo ascendente

Reactor de mezcla completa (CSTR)

Reactores Reactor anaerobio por lotes en serie

Reactores con la Reactor anaerobio con deflectores

Filtros anaerobios (AF).

Reactores de contacto con soporte

Reactores de lecho fluido y lecho

5.2 Reactor UASB

5.2.1 Funcionamiento de Reactor UASB.

Figura 5. Estructura de un reactor UASB típico.

Figura 6. Representación esquemática de un reactor UASB y la variación de la

5.3 Digestión Anaerobia

5.3.1.1 Hidrólisis o licuefacción

Así las proteínas son degradadas a aminoácidos, los polisacáridos a monómeros