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TUTORA PRÁCTICA:
MARIA FERNANDA DOMINGUEZ
BIOLOGIA AMBIENTAL
GRUPO: 358006_64
INTRODUCCIÓN
En el laboratorio el estudiante debe cumplir con normas básicas e utensilios que le permiten
desarrollar adecuadamente cada práctica de laboratorio, entre algunas recomendaciones que
debe seguir el estudiante están:
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
MARCO TEÓRICO
Métodos de siembra:
El método de siembra a emplear dependerá de los objetivos que se pretendan alcanzar con el
cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo del microorganismo se produzca de
forma masiva, mientras que en otras resulta indispensables que las colonias queden aisladas o
que las manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de
oxígeno, los métodos de siembra más empleados son los siguientes:
Siempre que se utilicen instrumentos de siembra de platino o nicrón, deben ser calentados en la
llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y después de realizar la siembra, con el objetivo de
destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie del instrumento. Con
independencia del tipo de medio y el método de siembra a emplear ésta debe realizarse en las
proximidades de la llama del mechero y a que el calor emanado reduce el número de
microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un recurso a favor
del proceder aséptico.
Este método de siembra se realiza sobre la superficie de los medios de cultivo sólidos distribuidos
en placas de "Petry" o en tubos de ensayo solidificados en forma de cuña. Para la siembra por
estría se utiliza el asa de platino o el hisopo. En algunas ocasiones, como explicaremos más
adelante, se utilizan ambos instrumentos en la misma siembra.
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Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será la aguja de platino y el medio de cultivo
sólido, generalmente, en tubo de ensayo. Las manipulaciones y la observancia de las
precauciones de asepsia, son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene
este método, es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de
cultivo.
Siembra volumétrica:
Este método de siembra consiste en sembrar una muestra liquida cuyo volumen no puede ser
predeterminado, en medio de cultivo sólidos o líquidos. Por ejemplo: En las muestras de exudado
vaginal tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determinarse el volumen, ya que este tipo de
pipeta carece de escala de graduación, sin embargo, la orina empleadas en el urocultivo o la
sangre para el hemocultivo se puede determinar con pipeta o jeringuilla respectivamente el
volumen que será sembrado.
Siembra masiva:
Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski. En este
caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de
cultivo sólido imprimiendo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede
realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo líquido, procediendo a su deslizamiento
sobre toda la superficie de una placa de agar.
Muerte de un microorganismo:
Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiológico y
continuar desarrollando una actividad metabólica que se traduzca, por ejemplo, en liberación de
toxinas. Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento) de
un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones
físicas o químicas del entorno. En estos casos, podríamos considerar como muertos
microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo
favorables
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TECNICAS DE TINCIÓN
Tinción de Gram:
Las diferencias estructurales y químicas de los dos tipos de pared bacteriana son evidenciables
a través de la siguiente figura.
Gram (+):
Son aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el
nombre de "Gram-positivas" o también "grampositivas". Esta característica está íntimamente
ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se
utiliza también el nombre de Posibacteria. Las restantes son las bacterias Gram negativas.
Gram (-):
Son aquellas bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de ahí el
nombre de "Gram-negativas" o también "Gram negativas". Esta característica está íntimamente
ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias y cuando se tratan como taxón se
utiliza también el nombre de Negibacteria. Las bacterias Gram-negativas presentan dos
membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras
que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de
peptiglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción
de Gram. Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos
Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), meningitis (Neisseria meningitidis)
y síntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos Gram-negativos incluyen
un gran número de especies. Algunos de ellos causan principalmente enfermedades
respiratorias (Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila,
Pseudomonas aeruginosa), enfermedades urinarias (Escherichia coli, Proteus mirabilis,
Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter
pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros están asociadas a infecciones
nosocomiales (Acinetobacter baumanii).
Azul De Lactofenol:
Tiene tres funciones importantes a la hora de observar hongos del tipo mohos obtenidos por
aislamiento de medios inoculados. El fenol destruye la flora acompañante. El ácido láctico
conserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al
interior del fúngico generando una película por así llamarlo protectora. Es útil para realizar el
examen directo de cultivos, ya que es una técnica rápida que permite visualizar perfectamente
las estructuras fúngicas. El colorante es fuertemente ácido y se usa para la tinción directa de
micelio micólico, el cual toma un delicado color azul claro
Desde su hábitat o entorno la bacteria incorpora las sustancias necesarias para vivir, proceso
llamado nutrición. Una vez incorporados estos nutrientes, a través del metabolismo bacteriano,
la célula será capaz de reproducirse y transmitir su material genético a la progenie.
Las bacterias necesitan de un aporte energético para desarrollarse. Se distinguen distintos tipos
nutricionales según la fuente de energía utilizada: las bacterias que utilizan la luz son fotótrofas
y las que utilizan los procesos de oxirreducción son quimiótrofas. Las bacterias pueden utilizar
un sustrato mineral (litótrofas) u orgánico (organótrofas). Las bacterias patógenas que viven a
expensas de la materia orgánica son quimioorganótrofas. Los gases principales que afectan al
desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una
respuesta amplia y variable al oxígeno libre clasificándose en cuatro grupos:
Los organismos fotosintéticos deberán ser expuestos a una fuente de iluminación ya que la luz
es su fuente de energía. Esta fuente de iluminación no debe plantear problemas de variación de
temperatura, por lo que suelen usarse lámparas fluorescentes con un desprendimiento mínimo
de calor. El desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas, y la velocidad con que
se efectúan estas reacciones está influida por la temperatura, por lo que la temperatura puede
en parte determinar la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Cada especie
microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según esto en los
siguientes grupos:
Los hongos por sus características morfológicas, fisiológicas y ecológicas forman un reino
llamado FUNGI, caracterizado por poseer una estructura celular eucariota, carecen de clorofila,
unicelulares (levaduras) o pluricelulares (hongos filamentosos), típicamente inmóviles, de
nutrición heterótrofa y de reproducción sexuada y/o asexuada.
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1. Hongos levaduriformes
2. Hongos filamentados o miceliados o mohos
Hongos Levaduriformes:
Son hongos formados por una serie de ramas tubulares llamadas hifas, el conjunto de las cuales
forman el micelio. Se reproducen por la formación de esporas, las cuales pueden ser
pigmentadas y le dan el color al hongo. Al centro de la colonia se ubican las hifas fértiles que
dan origen a las esporas, razón por la cual los hongos son más coloreados en esa zona. Se
caracterizan por presentar crecimiento rápido, tener reservorios naturales en el suelo, plantas,
animales y vegetales muertos, crecen a temperaturas de 25 – 30°C y sus esporas o conidios son
transportados por el aire, son normalmente inhalados y presentan gran resistencia en el medio
ambiente. La mayoría de los hongos filamentosos de interés clínico y vegetal, tienen una fase de
reproducción sexuada (telomorfa), pero es su forma asexual (anamórfica) la que casi siempre
produce las enfermedades y es observada en las muestras.
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Equipo/usos Boceto
Asa Redonda
Asas Rectas
es un instrumento utilizado en
laboratorios para calentar muestras
y sustancias químicas
Incubadora
Microscopio
Autoclave
Vinipel
Agar Nutritivo
Papa de Dextrosa
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Las cajas son cubiertas Se introduce en la autoclave por 15 minutos a una presión de
con papel de azúcar 120 atm y temperatura de 150 ºC, se deja enfriar y está listo
para su utilización
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Se esteriliza el asa redonda, se somete a la flama del mechero por 1 minuto hasta que
se tenga un rojo incandescente, se retira por unos pocos segundos y se introduce en la
muestra clínica para tomar una cepa de bacterias y se llevan al agar nutritivo utilizando
el método de estría.
Una vez realizada la siembra tapar inmediatamente la caja de Petri y se esteriliza
nuevamente el asa.
Cubrir con papel vinipel e incubar a 37 ºC, durante 24 horas invirtiendo la caja Petri antes
de su almacenamiento.
Al finalizar la siembra esterilizar el área de trabajo con limpiones, mantener durante todo
el proceso el mechero encendido.
Siembra de Hongos: para realizar la siembra de bacterias se prepara el agar PDA, tomando 7,8
gramos de agar y llevándolos a un volumen de 200 mL de agua destilada.
Las cajas son cubiertas con papel de Se introduce en la autoclave por 15 minutos a
azúcar una presión de 120 atm y temperatura de 150 ºC,
se deja enfriar y está listo para su utilización
Se esteriliza el asa de aguja, se somete a la flama del mechero por 1 minuto hasta que
se tenga un rojo incandescente, se retira por unos pocos segundos y se introduce en la
muestra de hongo filamentoso para tomar un pedazo del hongo y se llevan al agar PDA
utilizando el método de punción, el cual se realiza con tres puntos en forma de triángulo.
Una vez realizada la siembra tapar inmediatamente la caja de Petri y se esteriliza
nuevamente el asa.
Cubrir con papel vinipel y trasladar hacia un sitio oscuro y a temperatura ambiente,
durante 8 días.
Al finalizar la siembra esterilizar el área de trabajo con limpiones, mantener durante todo
el proceso el mechero encendido.
La segunda parte de la práctica consiste en la lectura del crecimiento bacteriano y de los hongos,
lastimosamente las bacterias no se desarrollaron y los hongos si se formaron adecuadamente.
Para realizar la tinción de Gram se utiliza nuevamente las muestras clínicas debido a que las
muestras que se sembraron en el laboratorio no crecieron. Para realizar las tinciones y
observación de en el microscopio se realiza el frotis, el cual consiste en fijar el microorganismo
a la lámina porta objetos. Para desarrollar el frotis del microorganismo y la tinción se desarrollan
los siguientes pasos:
Esterilizar el asa redonda para las bacterias y se toma una muestra de las bacterias de
carácter clínico, se extiende sobre la lámina portaobjetos en toda la mitad.
Colocar la lámina encima de la flama del mechero y hacer 3 pasadas rápidas para que el
microorganismo quede fijo sobre la lámina.
Dejar secar al ambiente el residuo resultante de la lámina durante 15 minutos.
Realizar la coloración compuesta, colocar sobre la lámina portaobjetos con la bacteria
fijada una gota de cristal violeta y esperar 1 minuto (lavar el exceso con agua destilada);
adicionar una gota de lugol y esperar 1 minuto (lavar el exceso con alcohol acetona);
adicionar unas gotas de alcohol acetona durante 25 segundos, por ultimo adicionar
fuscina o safranina durante 30 segundos y lavar el exceso con agua destilada.
Dejar reposar la muestra al ambiente por 15 minutos antes de realizar las observaciones
en el microscopio.
Realizar el montaje de la muestra en el microscopio y observar a los diferentes aumentos.
Nota: Para la tinción de los hongos se coloca una parte de la muestra en el centro de una lámina
portaobjetos y se adiciona una gota de azul de lactofenol, la muestra se analiza directamente y
no se realiza la fijación.
Tabla 1.
Resultados de la práctica de laboratorio realizada durante la tinción de microorganismos
y observación en el microscopio óptico compuesto.
Tinción de Gram – montaje de Bacterias
4X 10 X Descripción observación
En el objetivo de 4X se evidencian
pequeñas manchas de color rosa,
las cuales se presumen son
bacterias Gran negativas.
En el objetivo de 10X se puede
penetrar más la característica de las
manchas, pero todavía no se
evidencia claramente la forma de las
bacterias.
40 X 40 X Durante la observación de la
muestra en el aumento de 40 X, se
logra evidenciar la forma de las
bacterias las cuales poseen forma
de bacilos y solo se logra diferenciar
la membrana celular,
lastimosamente no se pudro realizar
las observaciones en el aumento de
100 debido a que no se contaba con
el aceite de inmersión.
Tinción con azul de Lactofenol – montaje para Hongos
4X 10 X
Se evidencia la presencia de un
hongo de carácter filamentoso, en el
aumento de 4 X y 10 X, se logra
observar pequeños segmentos que
componen el hongo o micelio, dado
su grado de filamentoso. El hongo
posee una coloración parda en el
centro pero no se logra evidenciar
claramente los componentes que
posee.
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40 X 100 X
En los aumentos de 40 X y de 100 X
se logra adentrar más a la
constitución de este hongo,
utilizando suavemente el tornillo
micrométrico se logró penetrar más
en la imagen, y se evidencia la
presencia de micelio, que conformo
el hongo de carácter filamentoso y
en el aumento mayor se observan
las hifas y los conidios pequeñas
esferitas con un punto oscuro o
pardo en el centro de tales esferas,
las cuales están conectadas a las
hifas las cuales están segmentadas.
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Cedeño, K., Lau, L., Gracias, L., Bernal, K., González, F. M., & Echeto, Y. (19 de Diciembre de
2011). Laboratorio de Microbiología. Recuperado el 17 de Noviembre de 2016, de
http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com.co/p/tincion-de-gram_20.html
López, L., Hernández, M., Adriana, C., Ortega, S., Cerón, G., & Franco, R. (2014). Las
tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en Discapacidad,
CENIAQ. (1), 10-18. Recuperado de http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-
2014/ir141b.pdf
Universidad Nacional de San Juan. (s/f). Microscopía Óptica, trabajo práctico Nº 1. Recuperado
de http://dea.unsj.edu.ar/biologia1/micro.pdf