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OBJETIVO:
Introducción
En Microbiología la esterilización se define como “el proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo
formas de resistencia) de un objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de microorganismos en el material y
medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos métodos de esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para
sustancias termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de oxido de etileno (para jeringas y cajas de plástico)No existe un
procedimiento de esterilización y desinfección aplicable a todos los casos.
El método de esterilización será seleccionado para cada caso teniendo en cuenta la naturaleza física del objeto y la naturaleza
biológica del contaminante. Como rara vez se conoce la población de microorganismos sobre un objeto que debe ser tratado,
debemos presuponer que se encuentran presentes las formas microbianas más resistentes: las endosporas.
ESTERILIZACIÓN
La esterilización es la muerte y/ o eliminación de todo microorganismo. No existen grados de esterilidad, un objeto es estéril o no
lo es. La dinámica de la esterilización dice que la proporción de microorganismos muertos en iguales periodos de tiempo es
constante. A mayor temperatura, mayor acción y menos tiempo necesario para esterilizar. Esto es válido para cualquier
procedimiento químico o físico excepto filtración.
En el autoclave la esterilización se produce mediante vapor de agua a presión superior a la normal (1 atmósfera). Así, la
temperatura del vapor de agua asciende a 121ºC. El vapor saturado penetra en los recipientes tomando contacto con los
microorganismos a destruir, allí se condensa liberando calor. El calentamiento es rápido por la gran cantidad de calor latente del
vapor de agua, que libera al condensarse sobre la superficie del objeto.
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B) RADIACIONES
• Rayos gamma -. Radiaciones ionizantes.
• Rayos Ultravioleta – de escasa penetración y de utilidad para eliminación de microorganismos de
superficies.
Luz ultravioleta: solamente para aire o para superficie o capas muy delgadas de líquidos pues no penetra. Se usa para
consultorios, salas, laboratorios, cámaras, quirófanos. No atraviesan el vidrio. Las ondas UV tienen suficiente energía para causar
roturas en el ADN, produciendo la muerte del organismo expuesto. Las cámaras de siembra vienen equipadas con una lámpara de
luz UV para mantener el área estéril, la cual se debe apagar cuando se ingresa a la cabina por la peligrosidad a la exposición de
las radiaciones (quemaduras, eritemas, cáncer de piel).
C) MECÁNICOS:
• Filtración: permite la eliminación de los microorganismos de un medio líquido, sin la destrucción de
estos. Para ello se hace pasar la muestra líquida a través de un filtro de membrana con tamaño de poro
inferior al tamaño de los microorganismos (0,2-0,45 micras). Los microorganismos quedarán retenidos
en el filtro y el fluido obtenido tras la filtración estará estéril. En la mayoría de los filtros hay tres factores
principales que intervienen en la retención de partículas (bacterias, virus, proteínas, etc.):
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2- QUÍMICOS:
• Desinfectantes: son agentes antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos
(infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre
tejidos vivos, por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes.
• Esterilización por gas plasma: Es una de las tecnologías posibles para esterilizar material
termosensible. Consiste en crear un plasma (estado entre líquido y gas), aplicando una radiofrecuencia
a Peroxido de Hidrógeno que ejerce la acción biocida. El plasma es considerado como el cuarto estado
de la materia consistente en un conjunto de iones, electrones y partículas atómicas neutras. Tiene la
ventaja de no dejar ningún residuo tóxico ya que se convierte en agua y oxígeno al final del proceso. El
material no precisa aireación. El ciclo de esterilización es corto, dura entre 54 y 75 minutos.
• Esterilización con óxido de etileno: este método se aplica a materiales termosensibles, sondas,
instrumental vario. Este gas se administra mediante un autoclave especial. Para ejercer su efecto
necesita humedad y una temperatura moderada (60ºC). La desventaja es que genera residuos
contaminantes que deben recibir tratamiento antes de ser desechados. El material tratado debe ser
sometido a aireación forzada para eliminar los residuos tóxicos. El personal debe protegerse
adecuadamente.
METODOLOGIA
Material:
Mechero bunsen o similar
Asa de siembra
Medios de Cultivo
Autoclave
Material de vidrio
Algodón
Papel Madera
Estufa de esterilización
El proceso de esterilización requiere mayor temperatura y tiempo que en el caso del vapor saturado, ya que tiene una menor
capacidad de tomar, transportar y ceder el calor. La temperatura de esterilización puede variar entre los 160 °C, 2 horas a 180 °C
1 hora.
El papel y el algodón no deben esterilizarse a más de 170 °C, ya que se carbonizan.
Normas de uso generales de la estufa
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Los materiales no deben colocarse superpuestos ni tocando las paredes, de manera que no obstruya la circulación del aire.
1) Cargar la estufa de forma tal de no impedir la convección del aire y que el material no toque las paredes.
2) Controlar la posición del termómetro: su tubo no debe tocar la carcaza metálica ni la puerta, pues se podrían registrar
temperaturas falsas (mayores a las reales).
3) Encender la fuente de energía
.4) Cuando se alcanza la temperatura deseada comenzar a contar el tiempo de esterilización.
5) Dejar enfriar antes de retirar el material.
D) Descontaminación
1. Será necesaria cuando el material y/ o equipos hayan sido utilizados con material infeccioso o presunto infeccioso, por ejemplo
placas de Petri inoculadas, tubos conteniendo cultivos de microorganismos, frascos empleados en el cepario, etc.
Serán esterilizados en autoclave a 1 atm. de presión durante 15 – 30 minutos.
F) Comprobación de esterilidad.
1. Tomar una de las cajas restantes que se vaciaron y ya se encuentran solidificadas y frias y marcar sobre el reverso
de la caja una línea que la divida en dos partes iguales.
2. Etiquetar cada una de las partes con los siguientes datos.
3. A partir del tubo de caldo BHI con indicador de pH_ que fue inoculado antes de la esterilización con una asada de la
suspensión de esporas de Geobacillus stearothermophylus, inocular mediante una estría recta la región que
corresponde a “Bioindicador esterilizado”. Etiquetar de la misma manera el tubo correspondiente.
4. Inocular en condiciones de asepsia el tubo de caldo BHI con indicador de pH sin inocular con indicador biológico con
una asada de la suspensión de esporas de Geobacillus stearothermophylus. Resuspender y tomar una asada a partir
del tubo e inocular mediante una estría recta la región que corresponde a “Bioindicador No esterilizado”. Etiquetar de
la misma manera el tubo correspondiente.
5. Sellar con las cajas dos tiras de masking tape, y colocar los tubos en un bote de metal o plástico. Incubar los dos
tubos y las cajas invertidas a 55º C durante 48 horas.
H) Filtración
1. Etiquetar la caja con agar ENDO.
2. Colocar dos mecheros encendidos y crear entre ellos un área estéril. En condiciones de asepsia instalar el equipo
Millipore estéril. Antes de instalar el vaso y las pinzas de pato, colocar una membrana de 0.45mm estéril sobre la base del
filtro conector. Las pinzas de punta roma se esterilizan con alcohol y a la flama antes de tomar la membrana.
3. Retirar la tapa de aluminio del vaso y transferir el contenido del matraz con caldo BHI inoculado con E. coli.
4. Abrir la llave de vacío y filtrar el medio a través de la membrana. Una vez que hubo pasado todo el medio cerrar el vacío.
5. Retirar las pinzas de pato y el vaso, este último deberá ser envuelto inmediatamente con mucho cuidado y colocado en
un bote de metal para su esterilización en autoclave.
6. Con ayuda de las pinzas de punta roma, retirar la membrana y colocarla en la caja de Petri con agar ENDO. Presionar
ligeramente la superficie para favorecer la adherencia de la membrana.
7. Sellar con dos tiras de masking tape la caja de Petri recién inoculada e incubar a 37ªC durante 24 horas.
8. Transcurrido el tiempo de incubación revisar los resultados y guardar en refrigeración.
Resultados esperados.
9. Transvasar el contenido (caldo BHI estéril) del matraz Millipore a un matraz estéril preparado previamente.
10. Etiquetar el matraz con el filtrado
11. Incubar el matraz a 37ªC durante 24 horas.
12. Al finalizar la incubación revisar y guardar.
13. Lavar el matraz Millipore y el filtro conector, y entregar inmediatamente.
Registro de resultados
Durante el desarrollo de la práctica y después de las incubaciones registrar en la siguiente tabla las observaciones realizadas.
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Resultados
+ = Desarrollo microbiano
- = Ausencia de desarrollo