PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE
POLLO
Equipo 7. Avila Vázquez Rodrigo, Avila Sánchez Talia Fernanda, Leon moreno Liz Berenice, Rodríguez Juárez
Abraham
Resumen
Se logrará extraer la proteína LDH del
musculo de pollo y por medio de la
precipitación por salado se eliminará gran
cantidad de contaminantes del
homogenizado resultante, así mismo dicha
proteína se obtendrá purificada después
de utilizar las técnica cromatograficas:
exclusión molecular donde la proteína será
separada de partículas de menor tamaño
debido a la unión de estas a los poros de la
matriz y eluirá primero al agregar la solución
de elución; en afinidad se basa en la
interacción especifica y reversible entre la
proteína y un ligando especifico unido a la
matriz cromatografíca y se eluíra con una
solución de NADH.. Se determinará la
concentración de la proteína en los
diferentes fracciones separadas en cada
etapa de la purificación haciendo uso de las
técnicas de A 280nm y el método de
Bradford, donde el segundo método será
más sensible. A través de la electroforesis
SDS-PAGE se verificará el progreso y el éxito
de la purificación de la proteína LDH, se
obtendrá el peso molecular de la misma al
interpolar con los datos de marcadores
moleculares conocidos y se observará una
mejor purificación en la fracción de
cromatografía por intercambio iónico o por
afinidad.
Introducción
La lactato deshidrogenasa (LDH) es
una enzima que ayuda a producir energía. Es
una enzima catalizadora que se encuentra en
muchos tejidos del cuerpo, pero su presencia
es mayor en
el corazón, hígado, riñones, músculos, glóbul
os rojos, cerebro y pulmones.
Corresponde a la categoría de
las oxidorreductasas, dado que cataliza una
reacción redox, en la que el piruvato es
reducido a lactato gracias a la oxidación
1. Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry
2. TAMAO ONO AND ROCKY S. TUAN.
de NADH a NAD+ 1. Dado que la enzima
también puede catalizar la oxidación
del hidroxibutirato, ocasionalmente es
conocida como Hidroxibutirato
Deshidrogenasa (HBD). Participa en
el metabolismo energético anaerobio,
reduciendo el piruvato (procedente de
la glucólisis) para regenerar el NAD+, que en
presencia de glucosa es el sustrato limitante
de la vía glucolítica.
La Purificación es el proceso que cuenta con
varias etapas cuyo objetivo es lograr la
concentración diferencial de la proteína o
molécula de interés. El primer paso en el
aislamiento de una proteína es la rotura
celular, para posteriormente poder extraer la
proteína con un tampón adecuado.2 El
método de rotura a elegir depende de las
características mecánicas del tejido o células
de donde se va a aislar la proteína, así como
de su localización. Entre los distintos
métodos ellos están:
* Lisis celular. Válido para células sin pared
celular (ej. células de tejidos animales),
consiste en suspender las células en una
solución hipotónica.
* Destrucción mecánica. Entre estos
métodos se encuentran la homogenización
(hacer pasar las células entre un tubo y un
pistón de vidrio que ajustan casi totalmente).
* Congelación-descongelación. La rotura se
produce al someter las células a un cambio
brusco de temperatura, congelando primero
a -196 °C y a temperatura ambiente 25 °C.
* Proteína de asociación subcelular:
Separación del resto del material celular a
través de centrifugación diferencial
Una vez que la proteína se ha extraído de su
entorno natural está expuesta a muchos
agentes que pueden dañarla como: Cambios
bruscos de pH, ácidos y bases fuertes,
Temperaturas extremas, Acción de las
proteasas.
La cromatografía es una técnica utilizada subunidades y todas las cadenas
para separar y purificar proteínas según sus polipeptídicas adquieran una carga negativa,
propiedades. por lo cual su migración solo depende de la
En la Cromatografía de exclusión molecular masa.5
(filtración en gel), en esta técnica las
moléculas se separan según su forma y
tamaño. La fase estacionaria está compuesta
por microesferas de material hidratado
esponjoso que contiene poros con un rango
relativamente estrecho de diámetros. Si en
una columna esos “tamices moleculares” se
pasa una solución acuosa con moléculas de Bibliografía:
distintos tamaños, las que son demasiado * Switzer, R. y L. Garrity. Experimental
grandes para ingresar en los poros se Biochemistry: Theory and exercises in
excluyen del volumen de solvente ubicado fundamental methods. 3rd edition, Freeman
en el interior de las microesferas.3 Por lo and Company, New York 1999
tanto, estas moléculas grandes atraviesan la *http://www.icp.ucr.ac.cr/nuevo/pdf/electro
columna con más rapidez, esto es, un foresis.pdf
volumen menor de eluyente, que las * TAMAO ONO AND ROCKY S. TUAN. Effect
moléculas que logran ingresar en los poros. of experimentally induced calcium deficiency
on development, metabolism and liver
En la Cromatografía de afinidad se basa en la morphogenesis of the chick embryo. /.
interacción especifica y reversible entre la Embryol. exp. Morph. 92, 207-222 pp.
proteína y un ligando especifico unido a la
matriz cromatografíca. Se utiliza un
colorante Cibacron Blue, la proteína se une a
la columna y se eluía con una solución de
NADH.
Electroforesis, es una técnica para la
separación de moléculas según la movilidad
de estas en un campo eléctrico a través de
una matriz porosa, la cual finalmente las
separa por tamaños moleculares y carga
eléctrica.
Electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecil sulfato de sodio (SDS), la separación
electroforética de proteínas con relación
carga: masa casi idéntica se suele efectuar en
geles de poliacrilamida. Cuando la mezcla de
proteínas se aplica a un gel y se le pasa una
corriente eléctrica, las proteínas más
pequeñas migran más rápido a través del gel
que las proteínas más grandes. La velocidad
a la cual una proteína se mueve a través del
gel depende del tamaño del poro del gel y de
la fuerza del campo eléctrico. El SDS
desnaturaliza las proteínas, haciendo que las
proteínas multimericas se disocien en

3. Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry

4. http://www.icp.ucr.ac.cr/nuevo/pdf/electroforesis.pdf