UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA

UNIDAD ACADÉMICA DE SALUD Y BIENESTAR

CARRERA DE MEDICINA

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN DE BIOLOGÍA

MOLECULAR

PCR – REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

AUTOR:
JHOANNA ABAD
ARIANA CALLE
CARLOS GARCÍA
JHONATHAN GUAMÁN

CATEDRÁTICA: DRA. ADRIANA ULLOA

Azogues-Ecuador

2017 - 2018
 ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 1
OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 2
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................... 2
OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................................................ 2
MARCO TEÓRICO ........................................................................................................................... 3
¿QUÉ ES LA PCR? ....................................................................................................................... 3
¿QUÉ ELEMENTOS QUÍMICOS SE NECESITAN? ......................................................................... 3
¿CÓMO FUNCIONA LA REACCIÓN? ........................................................................................... 4
Hibridación. ........................................................................................................................... 4
Extensión. .............................................................................................................................. 4
¿COMO SE REALIZA EL PRODUCTO DE AMPLIFICACION? ......................................................... 4
PCR EN TIEMPO REAL ................................................................................................................ 6
AGENTES INTERCALANTES ........................................................................................................ 6
SONDAS DE HIBRIDACIÓN ESPECÍFICAS .................................................................................... 7
VENTAJAS DE LA PCR A TIEMPO REAL ....................................................................................... 8
¿CUALES SON LOS MÉTODOS PARA DETECTAR LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS? ................ 8
¿CÓMO SE CAPTURA LA SEÑAL DE FLUORESCENCIA? ............................................................ 10
COMO SE ANALIZA LOS RESULTADOS ..................................................................................... 10
Absoluta. ............................................................................................................................. 11
Relativa. ............................................................................................................................... 11
DIAGNOSTICO MEDICO POR PCR ............................................................................................ 11
CONCLUSIÓN ............................................................................................................................... 13
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 14
 INTRODUCCIÓN

Desde las primeras observaciones de Gregorio Mendel hasta la actualidad, se tiene la

noción de que parte de la explicación de los diferentes fenómenos biológicos se encuentra
escondida en lo más recóndito del genoma celular y que una de las claves para entender
dichos fenómenos es el estudio de los genes.

Es así como han ido apareciendo diferentes tecnologías cuyos protocolos están dirigidos
al estudio del ADN, la más importante sea la reacción en cadena de la polimerasa.

Actualmente sabemos que la misión de la PCR es copiar millones de veces una secuencia
específica de ADN blanco mediante una poderosa catálisis llevada a cabo por una enzima
conocida como ADN polimerasa, de tal manera que cantidades pequeñas de ADN pueden
ser sintetizadas y copiadas fielmente para analizarse con diferentes fines.

En esta revisión se hace una descripción de los fundamentos de la PCR convencional o

también conocida como punto final; además se explica qué se necesita para que la
reacción sea exitosa, cómo se lleva a cabo y cómo se analizan los resultados.

1
 OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Conocer generalmente sobre la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Describir el proceso de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.

 Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una PCR.
 Conocer cómo se utiliza el PCR en la medicina a través de un diagnóstico.

2
 MARCO TEÓRICO

¿QUÉ ES LA PCR?

Esta reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica
millones de veces cada una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos
en los que la secuencia blanca es copiada fiel mente. La reacción aprovecha esta actividad
de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN
en las células. En la reacción, si usamos como sustrato ADN genómico, entonces
típicamente hablamos de una PCR, pero si se usa ADN complementario (ADNc) este
proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR
(Reverse Transcripción-PCR, por sus siglas en inglés). Esta conversión se logra mediante
una reacción conocida como transcripción reversa y está controlada por la enzima
transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molécula de ADNc. Este
método fue copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su
genoma de ARN en ADN duplicarse en millones de partículas virales. El ADNc se utiliza
cuando analizamos la expresión del ARNm de algún gen de interés. Los elementos
importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los
oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina,
timina, citosina y guanina), el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora o buffer
y H2O. (1)

Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se compone la
PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. (1)

¿QUÉ ELEMENTOS QUÍMICOS SE NECESITAN?

El principal elemento en la PCR es el ADN, la naturaleza química ofrece ventajas para su

manipulación. En la PCR, el templado son las cadenas de ADN que se separan y estas
funcionan como molde para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la
secuencia blanco de interés. El ADN polimerasa se encarga de la catálisis de la reacción,
sintetizando las nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanca. (2)

3
¿CÓMO FUNCIONA LA REACCIÓN?

La PCR se lleva tres etapas principales: desnaturalización, hibridación y extensión.

Desnaturalización.

Esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y también separadas a una temperatura de
unos 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo de esto depende de la secuencia del
templado, es decir, la cantidad de G-C es alta, será necesario más tiempo para poder
romper sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases está formado por tres
enlaces, uno más que las bases de A-T. Además, también depende de la velocidad en la
que el termociclador aumenta la temperatura, esto varía de acuerdo al modelo del equipo.
Al final de esta etapa tendremos las cadenas separadas que servirán como templado para
el siguiente paso. (1)

Hibridación.
En esta etapa podemos decir que los primers se alinean al extremo 3’ del templado
previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se puedan
formar el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de esta
hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta por generalmente oscila entre
50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y también la temperatura es la
adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente. (1)

Extensión.
En esta etapa se puede decir que la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-
primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s
complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las cadenas
es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima de la
reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al final de este
ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de
pares de bases (pb). (1)

¿COMO SE REALIZA EL PRODUCTO DE AMPLIFICACION?

Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los amplicones

son visualizados a través de una electroforesis en geles de polímeros como la agarosa.

4
La electroforesis se usa para la migración de una partícula o moléculas como ácidos
nucleicos cargada bajo la influencia de un campo eléctrico pasando atreves de una matriz
que funciona para su debida separación.

Las Especies poseen grupos ionizables cargadas bien como aniones o cationes y se
separan en función de su carga eléctrica o tamaño.

En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato les proporciona la carga negativa, por
lo que durante la electroforesis se dirigen hacia el polo positivo.

Las moléculas recorren una distancia por cada fragmento de ADN inversamente
proporcional a su peso molecular. (3)

Para ello se utiliza un gel disolviendo una cantidad de agarosa en el buffer, se calienta
hasta que la agarosa hierva lo suficiente y posteriormente se vacía a un recipiente que
sirve de base para que solidifique. Generalmente el porcentaje al que se prepara el gel es
al 1.2% aunque, dependiendo del tamaño de las moléculas, puede ser de hasta el 2%.

Otro ingrediente que se usa para los geles de agarosa, se le añade Bromuro de etidio,
sustancia que se intercala entre las bases de ADN y es fluorescente cuando se ilumina con
luz ultravioleta en el cual se observa las bandas y marcadores correspondientes de peso
molecular se debe manipular con mucho cuidado este compuesto porque se sabe que es
mutagénico y teratógeno.

El ADN se analiza por este proceso plasmidico. Los plásmidos son moléculas de ADN
extracrosomico, circular y pequeño presentes en especies bacterianas que se replican de
manera independiente

Cuando los amplicones son corridos en el gel, éstos deben ser cargados junto con un
marcador molecular que contenga un número determinado de segmentos de ADN
conocidos, facilitando la identificación de los amplicones y si su tamaño con el esperado.

El tamaño está dado por el número de pares de pases del amplicón.

La visualización de los amplicones se lleva a cabo tomando una foto digital al gel de
agarosa expuesto a luz UV; adicionalmente un procesador de imágenes se encarga de
analizar las bandas observadas.

Los cambios que ha sufrido la PCR de los ácidos nucleicos han ido cambiando. (4)

5
PCR EN TIEMPO REAL

Es el monitoreo continuo de la acumulación del producto amplificado durante una PCR.

Se basa en la detección y cuantificación de la fluorescencia de una molécula

Mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad

de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en
la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.

Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de

amplificación.

Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan fluorescencia y
están proyectados para poder medir ya que la fluorescencia emitida en cada uno de los
viales donde se realice la amplificación.

Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden
ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas específicas marcadas con fluorocromos.
(5)

AGENTES INTERCALANTES

Son fluorocromos que aumentan la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de

doble hélice. El más empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Green I, aumentando su
fluorescencia en cada ciclo.

Este sistema de detección tiene la ventaja de que la reacción es muy fácil, pero con un
inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad, debido a que se unen
de manera indistinta a productos generados inespecíficamente o a dímeros de cebadores.

Para mejorar la especificidad se deben usar condiciones de reacción óptimas y una

selección de cebadores para disminuir el riesgo de formación de dímeros.

Al iniciar la reacción de síntesis de ADN a temperaturas elevadas para asi disminuir de

forma notable el riesgo de amplificaciones inespecífica usando polimerasas
recombinantes modificadas que sólo funcionan después de ser activadas a temperaturas
elevadas o anticuerpos que bloquean el centro activo de la polimerasa hasta que la

6
reacción alcanza temperaturas altas en las que el anticuerpo se desnaturaliza liberando la
polimerasa y permitiendo su actividad.

La mayoría de los equipos para PCR a tiempo real tienen la posibilidad de determinar la
temperatura de fusión de los fragmentos.

Los programas de los equipos de PCR a tiempo real tienen diversas opciones:

1. Amplificación y detección de ADN o ARN diana en la muestra.

2. PCR múltiple.

3. Cuantificación del ADN o ARN diana en la muestra

4. Análisis de curvas de disociación

Cada fragmento amplificado tiene un Tm característico, que depende sobre todo de su

longitud y de la composición de sus bases.

Los agentes intercalantes no permiten la identificación de polimorfismos en la secuencia

diana. (5)

SONDAS DE HIBRIDACIÓN ESPECÍFICAS

Es la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia entre las dos moléculas.

1. Sondas de hidrólisis. Son oligonucleótidos con un fluorocromo donador en el

extremo 5’ que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3’
que absorbe la fluorescencia liberada por el donador.

2. Molecular beacons. Tienen una molécula donadora en el extremo 5’ y una

aceptora en el extremo 3’ pero, además, presentan una estructura secundaria en
forma de asa, en la que reside la secuencia de unión específica con el ADN diana,
esta al ser excitado, el donador transfiere su energía al aceptor que, a su vez, emite
la fluorescencia.

3. Sondas FRET. El sistema se compone de dos sondas que se unen a secuencias

adyacentes del ADN diana. Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3’
y la otra un aceptor en el extremo 5’.

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VENTAJAS DE LA PCR A TIEMPO REAL

 Rapidez, ya que no necesita ningún proceso adicional de detección. Si el equipo

empleado es el Light Cycler o equivalente, se puede completar el proceso de
amplificación y detección en 30-40 min.

 Utilizar sistemas cerrados, el riesgo de contaminación disminuye.

 Los equipos para PCR a tiempo real tienen una capacidad muy elevada ya que en
el mismo instrumento se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos, cuantitativos,
determinación de mutaciones, PCR múltiple. (5)

¿CUALES SON LOS MÉTODOS PARA DETECTAR LOS PRODUCTOS

AMPLIFICADOS?

El monitoreo de los productos amplificados conforme transcurre la reacción es un paso

importante en la PCR en tiempo real, para ello la estrategia tecnológica que ha dado
buenos resultados es los sistemas basados en reporteros fluorescentes. En general, estos
sistemas pueden ser clasificados en dos métodos diferentes: específicos y no específicos.

Los métodos no específicos se basan en el uso de moléculas intercalantes que tienen

afinidad por el ADN de doble cadena y que al ser oxidados generan una señal
fluorescente. La fluorescencia emitida es capturada en la etapa de extensión de cada ciclo
y es proporcional al número de copias de ADN de doble cadena obtenidas en cada ciclo
de la PCR. El reportero más usado para estos fines se llama SYBR Green, la cual es una
molécula cargada positivamente que, mientras esté en solución sin unirse al ADN de
doble cadena, prácticamente no emite fluorescencia; sin embargo, cuando se une al surco
menor del ADN incrementa hasta 1,000 veces su fluorescencia. Aunque el SBYR Green
es uno de los reporteros fluorescentes más utilizados por los investigadores debido a su
bajo costo, la principal desventaja es que puede unirse a cualquier molécula de ADN de
doble cadena, incluyendo dímeros de primers. Muchos laboratorios, para evitar esta
situación, optimizan sus reacciones realizando una «curva melting» o «curva de
disociación» al final de la reacción, cuya función es la de evaluar si se formó un producto
único o si hay presencia de dímeros de primers. Hoy en día la mayoría del software de
los termocicladores ofrecen esta función que es fácil de aplicar y analizar. (1)

8
Los métodos específicos parten de principios distintos a diferencia de los no específicos
y tienen en común la señal de fluorescencia emitida para detectar los productos
amplificados. Estos métodos siguen el principio conocido como «transferencia de energía
de resonancia fluorescente» (FRET, por sus siglas en inglés) para generar la señal; este
método consiste en transferir energía desde un donador o reportero fluorescente a un
aceptor o «quencher». Para ello, existen dos métodos específicos, éstos son: pruebas
basadas en hidrólisis y por hibridación. Los primeros se basan en sondas fluorescentes de
oligonucleótidos etiquetados con un reportero fluorescente y un «quencher», ambos se
encuentran en estrecha unión mientras la sonda no hibride a su secuencia blanco. Cuando
hibrida, ocurren cambios conformacionales en el reportero y el quencher, lo cual permite
que la actividad exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa rompa esta unión, logrando que
la fluorescencia emitida por el reportero sea liberada y capturada por el equipo. Estos
métodos son muy seguros, ya que mientras no haya unión de la sonda a su blanco, no
habrá amplificación y tampoco señal de fluorescencia; es por eso que la especificidad es
muy alta. Un ejemplo de estos sistemas son las sondas comerciales conocidas como
TaqMan12, aunque existen otras en el mercado. (1)

Los métodos por hibridación consisten en una sonda unida a un reportero fluorescente
que está en estrecha proximidad con un aceptor fluorescente unido a otra sonda. Tanto el
reportero como el aceptor presentan un espectro de excitación y de emisión similar, de tal
forma que cuando las dos sondas hibriden a su templado blanco, el reportero es excitado
y la señal emitida es transferida al aceptor, generando un incremento en la cantidad de
fluorescencia. Un ejemplo de este método son las sondas moleculares Beacons13 que
también son comerciales. (1)

Los métodos específicos son más costosos que los no específicos, pero son más eficientes
al garantizar la especificidad de la reacción, evitando la formación de productos
inespecíficos. Cualquiera que sea el método que se aplique, se pueden adquirir fácilmente,
ya que la gama de sondas para desarrollar, tanto los métodos específicos como los no
específicos, es amplia. (1)

9
¿CÓMO SE CAPTURA LA SEÑAL DE FLUORESCENCIA?

Cualquiera de los métodos que se utilicen para detectar los productos amplificados en
cada ciclo de la reacción necesita de la tecnología incluida en los termocicladores de PCR
en tiempo real para:

a) excitar al reportero

b) capturar la señal de emisión del mismo

c) realizar el análisis cuantitativo.

En el mercado existen diferentes tipos de termocicladores para esta finalidad, cuyas

diferencias principales son la fuente de energía que utilizan para la excitación. En general
son tres las fuentes: las lámparas de luz, diodos de emisión de luz (LED, por sus siglas en
inglés) y láseres. Cualquiera que sea la fuente, primero el reportero es excitado y su señal
de emisión colectada a través de un filtro que permite el paso de la longitud de onda
correspondiente que llega hasta un fotodetector que captura la información proveniente
de la muestra para su análisis en el software del equipo. Otros rasgos característicos son
las velocidades para incrementar o disminuir las temperaturas en cada etapa de la
reacción, el número de muestras que puede soportar, los consumibles para la reacción y
los kits que se utilizan para la amplificación; en algunos casos sólo se usan reactivos del
proveedor del termociclador, es decir, son sistemas cerrados y en otros casos, se pueden
utilizar reactivos de diferentes proveedores, es decir, son sistemas abiertos. (1)

COMO SE ANALIZA LOS RESULTADOS

No basta con detectar la amplificación en tiempo real y capturar la fluorescencia de cada

muestra continuar con el análisis de la reacción es el paso final para determinar la
cuantificación génica. Para ello la computadora cuenta con un software capaz de generar
una serie de gráficas en donde se muestran todos los datos necesarios para conocer si la
reacción fue exitosa. (6)

También es importante que en el análisis sepamos elegir el tipo de cuantificación que se

usará para determinar la amplificación precisa del blanco génico el cual va a depender del
investigador. (6)

10
Existen dos tipos de cuantificación:

Absoluta.
Se utiliza para conocer el número exacto de copias amplificadas del blanco o la
concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra. En la práctica, esta se usa para
medir la carga viral o bacteriana en diferentes tejidos. (6)

Relativa.
Se utiliza cuando se desean evaluar los cambios en la expresión de genes en distintos
estados fisiológicos los mismos que se basan en los niveles del ARNm del gen blanco
comparados con un gen de referencia (gen housekeeping) que no cambia su expresión a
pesar de que los estados fisiológicos se modifiquen por diversas causas. (6)

Los datos que se obtengan son referidos como el número de veces en el que aumentaron
o disminuyeron los niveles de ARNm o en su caso, si no hubo cambios. (6)

DIAGNOSTICO MEDICO POR PCR

El diagnostico medico por PCR nos permite la detección simultánea, identificación y

cuantificación de diferentes serotipos de enterovirus lo que nos resulta de gran ayuda
puesto que el riesgo de la aparición de complicaciones neurológicas depende en gran
medida del microorganismo infeccioso detectado. (7)

Existen métodos de detección por PCR de agentes infecciosos como los virus de la
hepatitis B y C, del papiloma y del sida. También pueden detectarse otros
microorganismos patógenos como las clamidias, las microbacterias que causan
tuberculosis, los Heliobacter causantes de gastritis y los tripanosomas responsables de la
enfermedad de Chagas. (7)

La forma de diagnosticar enfermedades infecciosas causadas por virus, consiste en

detectar los anticuerpos que el paciente produce contra el virus, si existen anticuerpos
circulantes se sabe que hay o hubo infección, pero no se puede distinguir entre las dos
posibilidades. (7)

En cambio, la detección directa mediante PCR permite saber con certeza si hay o no
infección en el momento del análisis esta nos ha facilitado también el diagnóstico de
enfermedades hereditarias. Talasemias y otras anemias, fenilcetonuria, hemofilia,

11
distrofia muscular de Duchenne, fibrosis quística, poliquistosis renal, retardo mental
asociado a fragilidad del cromosoma X, corea de Huntington, enfermedades de Sandhoff,
de Gaucher, etc. (7)

Los genes responsables de estas enfermedades han sido aislados, caracterizados y se

encuentran disponibles pruebas diagnósticas seguras de estas enfermedades. En
enfermedades oncológicas pueden detectarse por PCR mutaciones de oncogenes. Estas
mutaciones pueden llevar a la generación de tumores. En algunos casos, saber cuál es el
oncogen mutado puede permitir diagnosticar prematuramente cánceres de naturaleza
hereditaria o establecer pronósticos. (7)

La PCR nos permite evaluar el riesgo de padecer trastornos autoinmunes tales como
diabetes, enfermedad celíaca y esclerosis múltiple. (7)

12
 CONCLUSIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la mayor

parte de las aplicaciones de la biología molecular. Se ha presentado la base teórica y
práctica de la PCR. Existen muchas variantes de la PCR convencional, como son la PCR
en tiempo real o PCR cuantitativa, para el análisis del proceso se dio mediante la
separación de moléculas atreves de un campo eléctrico por agarosa y por bromuro de
etidio que con luz ultravioleta se puede observar las bandas y marcadores
correspondientes.

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 BIBLIOGRAFÍA
1. Tamay de Dios L *ICVC. Tecnología en salud. [Online].; 2013 [cited 2017 12 de diciembre 29
de diciembre. Available from: file:///C:/Users/ZONA%20INFORMATICA/Downloads/PCR.pdf.

2. jonnathan. Tecnología en salud. [Online].; 2013 [cited 2017 12 de diciembre 29 de diciembre.

Available from: file:///C:/Users/ZONA%20INFORMATICA/Downloads/PCR.pdf.

3. Carmen Alicia Padilla Peña JDDEMGJABRCGA. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de

agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico. [Online].; [cited
2017 Diciembre 28. Available from: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
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4. Dios Td. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo

real. [Online].; 2012 [cited 2017 Diciembre 28. Available from:
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf.

5. Costa J. ELSEVIER"Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real". [Online].; 2004

[cited 2017 Diciembre 28. Available from:
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6. MORCILLO ECyG. Principios básicos de Manipulación Génica Madrid, España; 1999.

7. READ TSYA. Genética molecular humana.: OMEGA; 1999.

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