Análisis de Proteínas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección

advansta
Análisis de Proteínas

Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta

Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas.
Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola
proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra
mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la
proteína de interés.
Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la

Esta guía de laboratorio describe los pasos

involucrados en la realización de un Western
blot, incluyendo la preparación de muestras,
la separación de proteínas, la transferencia y
la detección.

Índice de Contenidos Página

1. Western Blot: Visión General 2

2. Preparación de las muestras 4

3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 5

4. Transferencia Electroforética 11

5. Hibridación Anticuerpos 13

6. Detección 15

7. Solución de Problemas 17

8. Herramientas y Referencias Técnicas 21

presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado

para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras.

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1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some
applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4.

Página 2
AnálisisWestern
de Proteínas
Blot:
Visión General

1. Western Blot: Visión General

Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso.

a. Preparación de la muestra Los materiales de partida incluyen La disrupción mecánica

Extracción de las proteínas de
las muestras biológicas me-
diante disrupción mecánica o
química.
planta, tejidos animales, células con un homogenizador
cultivadas, levadura, o bacterias. disgrega los tejidos.
Procesos adicionales
logran el fraccionamien-
to subcelular

Se usan tampones con-

teniendo detergentes
para la lisis celular

Figura 1. Preparación de muestras

b. Electroforesis en gel de
Acrilamida Se añade un coloran-
te de carga. Así, la Se utiliza una pipeta para
migración de la mues- cargar las muestras en los
Las proteínas en el extracto se tra se puede monitori- pocillos del gel Una fuente de ali-
separan de acuerdo a su ta- zar. mentación propor-
ciona el voltaje
maño mediante electroforesis.
Se prepara un gel de acrilami-
da, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio
(SDS) añadido al gel se une a
las proteínas y confiere, de
forma proporcional a la masa
El gel se coloca dentro de un tanque
de cada proteína, una carga de electroforesis lleno de tampón,
negativa a cada una de ellas. que conducirá la corriente. La proteí-
nas con carga negativa migran des-
de el ánodo.

Figura 2. Electroforesis en Acrilamida

c. Transferencia electroforéti-
ca a una membrana El gel y la membrana se coloca Se aplica voltaje en el
entre papel de filtro y almohadillas tanque de transferencia y
de esponja.. las proteínas migran desde
Las proteínas son transferidas el gel a la membrana.
electroforéticamente a un
soporte rígido o membrana,
dónde quedan inmovilizadas.

Un cartucho aplica presión y

mantiene un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.

Figura 3. Transferencia de Proteínas a la Membrana

Página 3
a. Hibridación del Anticuerpo

La membrana con las proteí-

nas inmovilizadas debe tratar- Los materiales de partida incluyen
se para bloquear las zonas tejidos vegetales, tejidos animales,
con ausencia de proteínas y células en cultivo, levadura, o bac-
así evitar la unión no específi- terias.
ca de los anticuerpos.
A continuación se incuba con
un anticuerpo primario dirigi-
do contra el epítopo específi-
co de la proteína diana.
Tras varios lavados de la mem-
brana, se adiciona un anti-
Figura 4. Hibridación de Anticuerpo
cuerpo secundario marcado
que se unirá de forma especí-
fica al anticuerpo primario,
proporcionando una forma
de detección.

e. Detección de las Bandas

Después de un lavado de la
membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se pro-
cede a detectar la localiza-
ción de la banda en la mem-
brana. Para la detección de
quimioluminiscencia, se utiliza
un anticuerpo secundario
conjugado con el enzima pe-
roxidasa (HRP); la adición de
un sustrato de HRP provoca
una reacción enzimática que
da como resultado final la
emisión de luz. Dicha luz pue-
de ser detectada en una pelí-
cula de rayos X, o de forma
digital, mediante un sistema
de captación de imágenes.
La detección de fluorescen- Figura 5. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas
cia se basa en la captación
de luz emitid por sustancias
fluoróforas conjugadas con el
anticuerpo secundario.

Página 4
 Preparación de En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y
la muestra detergentes, más utilizados habitualmente, según
el tipo de proteína y localización subcelular.

2. Preparación de la muestra Tabla 1. Métodos físicos para la dirupción de muestras

Método Descripción Tipo de muestra
Una adecuada preparación de la muestra es
esencial para tener éxito en un ensayo de Licuadora La muestra se tritura Gran cantidad de
mediante cuchillas tejido
Western Blot. En la mayoría de ensayos, las
rotatorias
proteínas se extraen mediante procesos químicos
y/o mecánicos. El método elegido dependerá del Homogenizador Tubo de vidrio con Células tisulares; útil
tipo de muestra de partida, de la localización Dounce pistón ajustado maja para protocolos de
las células por enriquecimiento de
subcelular de la proteína y de las condiciones
acción de corte. proteínas
óptimas que requiera el anticuerpo para mitocondriales o
reconocer el epítopo proteico. En la tabla 1 se nucleares
resumen los métodos mecánicos que Homogenizador de Ondas de sonido Células, tejidos,
habitualmente se utilizan en la extracción de ultrasonidos emitidas por una bacterias.
sonda para romper
proteínas para inmunotransferencia. las membranas celu-
lares
A menudo, en muestras tisulares de plantas y
animales, se requiere el uso de un proceso Pulverización en La muestra se Tejido animal o o
mecánico para la disrupción de la compleja Nitrógeno líquido pulveriza utilizando vegetal
un mortero y una
matriz celular. Disrupción mecánica que suele almirez refrigerados
preceder a un proceso químico de lisis celular,
mediante el uso de solución tampón que Perlas de vidrio La ruptura celular se Levaduras
produce por
contiene detergentes, que va dirigida a
agitación de las
enriquecer la proteína de interés dentro del perlas de vidrio
extracto final. Las células en cultivo, Tabla 2. Soluciones Tampón y detergentes, según el tipo de
frecuentemente, se suelen lisar utilizando una proteína de interés y la localización subcelular
solución tampón con detergente y sin la Tipo/Localización Detergente o TComentarios
aplicación de métodos mecánicos. Proteína de interés Solución Tampón

La estructura química de los detergentes permite Nativa (no Detergente suave no Evitar detergentes
romper las membranas celulares y solubilizar las desnaturalizada) iónico desnaturalizantes
(SDS, Deoxicolatos)
proteínas. Estas substancias tienen una parte polar
y otra no polar y se pueden clasificar según las Citoplasmáticos Tris-HCl Puede combinarse
características del grupo polar: iónicos si el grupo (soluble) con métodos
polar tiene carga positiva o negativa, no iónicos si mecánicos, tales
como el
no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga
homogenizador
negativa y positiva y la carga neta es 0. Dounce
Citoplasmático Tris-Triton Los detergentes
La elección de la substancia detergente,
(unida a Triton son suaves y
depende en parte de la localización, dentro de la citoesqueleto) no iónicos
célula, de la proteína de interés, citoplasmática,
unida a la membrana, dentro de orgánulos
celulares como el núcleo y las mitocondrias,
etc...Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir
a las proteínas del citoesqueleto, afectando así a
los procesos de fraccionamiento subcelular.

Página 5
 Electroforesis
en Acrilamida

Membrana mitocon- NP-40, RIPA drial o

nuclear (multiples detergen-
Para antígenos con
niveles bajos de
3. Electroforesis en Acrilamida
tes), Triton X-100 expresión pueden
ser necesarios
Las proteínas del extracto se separan mediante
procesos de electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En
enriquecimiento primer lugar, las proteínas, se revisten con carga
Lisado total de célu- NP-40, RIPA, negativa, mediante la acción del detergente
las Triton X-100 Dodecilsulfato Sódico (SDS), así Las proteínas, se
Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas pueden separar en el gel según su tamaño
que pueden degradar la proteína de interés. Por (SDSPAGE).
tanto, es importante evitar, durate la preparación
Medición de proteína total
de la muestra, cualquier actividad proteásica.
Previamente a la electroforesis, es importante
La siguiente estrategia ayuda a evitar la
determinar la concentración de proteínas por las
degradación de proteínas:
siguientes razones:
• Evitar excesivos ciclos de congelación/
1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de
descongelación.
proteínas en el gel.
• Trabajar rápido y mantener las muestras en frío
La cantidad de proteína óptima a cargar
durante todo el proceso.
dependerá de la prevalencia de la proteína de
• Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón interés y de la sensibilidad del anticuerpo
de lisis. primario.

Además de inhibir la actividad de la proteasa,
puede ser interesante reducir la actividad de la
fosfatasa alcalina, en particular en estudios de
fosforilación.
En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa
y fosfatasa de uso más habitual.
Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un
mayor ruido de fondo y unión no específica de
los anticuerpos. A menudo, para determinar la
carga de proteína apropiada, se requiere
hacer experimentos preliminares con
cantidades seriadas de proteínas.

Tabla 3. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la

extracción de proteínas.
Inhibidores Proteasas Concentración en Enzimas diana el
Tampón de lisis

Aprotinina 1-2 µg/ml Proteasas de Serina

EDTA 1-10 mM Mg++/Mn++

Metaloproteasas

EGTA 1-10 mM Ca++ Metaloproteasas

Leupeptin 1-2 µg/ml Proteasas de Serinas,

Cisteinas

Pepstatina A 1µg/ml Proteasas de Aspartico

PMSF (17-170 µg/ml) Proteasas de Serina

O,1—1 mM

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Análisis de Proteínas

Inhibidores Concentración en el Enzimas diana

Fosfatasas Tampón de lisis

- Glicerofosfato 1 mM Fosfatasas Serina/

Treonina

EDTA 1-10 mM Mg++/Mn++

Metaloproteasas

EGTA 1-10 mM Ca++ Metaloproteasas

Leupeptin 1-2 µg/ml Proteasas de Serinas,

Cisteinas

Pepstatina A 1µg/ml Proteasas de

Aspartico

PMSF (17-170 µg/ml) Proteasas de Serina

O,1—1 mM

Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de

muestra, se puede controlar la cantidad de carga de la pro-
teína mediante la cantidad de resina utilizada, evitando la
necesidad de determinar la concentración de proteína. Por
ejemplo, para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Af-
yon.

Información para pedidos

K-02101-025 Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit

2. Realización de Western Blots cuantitativos o Con el fin de determinar la concentración de

semi-cuantitativos.
Si la cantidad de proteína cargada por carril
es la misma, se pueden comparar los niveles
relativos de la proteína de interés. Un
experimento de Western Blot cuantitativo es
útil para estudio de cambios de expresión de
proteínas o de modificaciones proteicas como
la fosforilación.
Descripción del método
Existen diversos métodos para medir la proteína
total de una muestra. Los más habituales son los
métodos Lowry, Bradford y Ácido Bincocinico
(BCA) (Tabla 4). Estos ensayos colorimétricos se
basan en las reacciones que se producen entre
las proteínas de la muestra y los reactivos de
detección.
Página 7
proteínas totales en una muestra, se debe realizar
una curva estándar en cada ensayo. Esto se
logra con la realización de un ensayo de
concentración crecientes, de proteína pura. El
estándar utilizado con mayor frecuencia es la
albúmina de suero bovino (BSA), aunque se
puede utilizar cualquier proteína producida en el
laboratorio o disponible comercialmente.
En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva
estándar. Los valores de absorvancia se trazan en
función del contenido conocido de la proteína
estándar utilizada. El contenido de la proteína de
interés en la muestra (línea verde) se puede
determinar mediante la extrapolación de la
absorvancia obtenida a la cantidad o
concentración de proteína correspondiente.
 Electroforesis
en Acrilamida

Elección de un ensayo de proteínas

La proteína se encuentra en su
estado conformacional, mante-
Hay muchos kits de determinación de niendo su carga intrínseca
proteínas disponibles comercialmente. La
elección depende de muchos factores:

• El equipo de lectura disponible en el SDS

laboratorio (espectrofotómetro, lector
de placas, etc…).

• Los reactivos del tampón de lisis -

revisar el protocolo del fabricante
para identificar sustancias El SDS se une a la proteína y da
interferentes. lugar a una linearización y a una
uniformidad de la carga negativa
• La cantidad de muestra disponible. de ésta.
Lowry Similar al BCA Muy bien cita- El tiempo de da
• La facilidad/rapidez del ensayo.
(reacción de en literatura ensayo puede ser
Tabla 4. Métodos físicos para la dirupción de muestras Biuret) mayor que en otros métodos
• No es práctico
Ensayo Descripción Ventajas Inconvenientes para grupos
grandes de
Bradford El colorante azul de La realización • Interferencia de muestras
Coomasie se une a las de los ensayos SDS o de otros • Se pueden
proteínas y sufre un son detergentes a formar
cambio de absorvancia generalmente altas precipitados
rápidos y concentraciones
sencillos .
• Rango lineal
pequeño.

BCA Reducción de iones de Compatible Interferencia con

Cu2+ mediante la mayo con agentes
interación con las - quelantes o
proteínas, el BCA se une ría de deter- reductores del
a los iones de Cu1+ y gentes Cobre
forman un producto • Comercialmente
coloreado que se puede disponible en for-
medir mato com-
espectrofometricamente patible con agentes
(reacción de reductores.
Biuret) • Menos variación
proteína-
proteína que en Proteína (mg)
el método
Bradford. Figura 6. Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de
proteínas. Se representa la absorvancia de las soluciones
estándar que contienen la proteína conocida (línea roja). La
concentración de la proteína de interés se puede determinar
extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o
estándar (línea verde de puntos).
Tampón de carga de muestras

Una vez se tienen las muestras de proteína, se

pueden conservar congeladas, teniendo cuidado
en evitar ciclos repetitivos de congelación/
descongelación. Alternativamente, se pueden
utilizar inmediatamente, combinándolas con un
tampón de carga y cargar la muestra en un gel de
electroforesis. Los componentes del tampón de
carga varían, dependiendo de las condiciones

Página 8
Análisis de Proteínas
deseadas. Los ingredientes típicos de un tampón
de carga para detectar proteínas bajo
condiciones desnaturalizantes/reductoras se
describen en la Tabla 5. No se utilizarán ni SDS, beta
mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan
condiciones no desnaturalizantes /no reductoras.
Previamente a la carga del gel, las muestras se
someten a una incubación a 95ºC durante 5-10
minutos, para asegurar que la desnaturalización/
reducción es total. En condiciones no
desnaturalizantes/no reductoras, esta incubación
no es necesaria. En la Figura 7 se ilustra cual es el
mecanis-
mo de desnaturalización del SDS.
Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y
garantizan que las muestras se separan de forma reproduci-
ble, carril a carril y gel a gel. Advansta dispone de tampones
de carga reductores y no reductores.
Información para pedidos
R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x)
R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x)
Gel de Electroforesis
Si se requieren condiciones naturales para que el
anticuerpo pueda detectar el epítopo, en la
electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el
tampón de electroforesis. En esta situación,
también conocida como PAGE nativo, las proteínas
mantienen su estructura tridimensional y la
migración en el gel depende de su masa: relación
Página 9
Figura 7. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteí-
nas.
Tabla 5. Componentes del tampón de carga.
Reactivo Propósito
Glicero. Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar
la muestra la fondo del pocillo y evitar que se
extienda a los pocillos adyacentes.
Azul de Bromofenol Molécula colorante pequeña:
• Da color a la muestra para ayudar a la
carga.
• Migra por delante de las proteínas, de
modo que se puede hacer el
seguimiento del movimiento de las
muestras en el gel.
SDS Detergente desnaturalizante
• Cola hidrofóbica que rodea la
esqueleto peptídico.
• Unión a la proteína de forma regular,
aportando carga negativa de forma
proporcional al tamaño de la proteína.
• Evita las interacciones hidrofóbicas y
rompe los enlaces de hidrógeno.
• Destruye la estructura secundaria/
terciaria y lineariza la proteína.
Beta Agentes reductores
Mercaptoetanol o • Evita la oxidación de cisteínas.
DTT • Completan la linearización de la
proteína al romper los puentes
disulfuro.
Tampón Tris Mantiene el pH adecuado
Pepstatina A
de carga de la proteína por encima de su tamaño.
Sin embargo, la mayoría de ensayos Western Blot,
se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo
SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes.
Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de
reducción, las proteínas cargadas negativamente,
cuando se someten a un campo eléctrico, migran
al electrodo positivo. Debido a que el SDS iguala la
 Electroforesis
en Acrilamida
carga en todas las proteínas, la tasa de migración
viene determinada por su peso molecular. Las
moléculas más pequeñas migran más rápidamente
que aquellas con pesos moleculares mayores.
Los geles de SDS-PAGE están disponibles
comercialmente o se pueden elaborar en el propio
laboratorio. Los geles pre-fabricados son muy
prácticos pero debido al coste, no son tan rentables
como los elaborados por el usuario. En la tabla 6, se
describen los componentes químicos de un gel de
SDS-PAGE.
Elección del grosor del gel y del tamaño de poro
El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína
de interés dictan el espesor y tamaño de poro del
gel.
• Los espaciadores de gel (ver Figura 8)
controlan el espesor del gel. Están disponibles
en diversos tamaños.
• Los geles con mayor espesor, pueden aceptar
mayor volumen de carga. También se
procesarán más lentamente y requieren
tiempos de transferencia mas largos que los
geles más delgados
• El porcentaje del gel, según la cantidad de
acrilamida y bisacrilamida, determina el
tamaño del poro. A más porcentaje menos
tamaño de poro.
• El tamaño de poro determina la ratio de
separación de las proteínas. (tabla 7).
Tabla 6. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis
de proteínas
Reactivos Propósito
Acrilamida Moléculas que polimerizan para formar
cadenas.
Bisacrilamida Forman uniones con las cadenas de
acrilamida para formar un entramado.
SDS Mantiene la linearidad y la uniformidad
de carga de las proteínas según la
electroforesis.
Tampón Tris Mantiene el pH adecuado.
Persulfato de Amonio Generación de radicales libres que
catalizan la reacción de polimerización.
TEMED Aumenta la generación de radicales
libres por el persulfato de amonio.
Tabla 7. Rango de separación de proteínas según el porcentaje
de acrilamida.
Porcentaje Rango Peso Molecular (kDa)
7,5 25-500
10 15-300
12 10-200
15 10-45
20 5-40
Elaboración del gel
Si el gel de acrilamida esta elaborado en el
laboratorio, los distintos reactivos se mezclan y se
vierte en el molde, formado por el conjunto de dos
cristales, espaciadores lateral, espaciador inferior,
peines y un sistema de sujeción (Figura 8), dónde la
acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30
minutos. Para mejorar la nitidez de la banda el gel
resolutivo se corona con una acrilamida de menor
porcentaje (stacking gel).
Diseño Experimental; Controles y Estándares
Antes de la carga del gel, es importante diseñar el
experimento incorporando los controles y
estándares necesarios para la validación de los
resultados. Los tipos de estándares y controles
utilizados incluyen:
1. Marcadores de Peso Molecular.
• Son una mezcla de proteínas purificadas de
peso molecular conocido.
• Se utilizan para verificar si la proteína de interés
está dentro del rango de tamaño apropiado.
• Disponible en diversos intervalos de pesos
moleculares, así como teñidos o incoloros. Las
versiones preteñidas se utilizan para controlar
Página 10
Análisis de Proteínas

el progreso de la electroforesis y comprobar la • Algunos tratamientos pueden alterar la

eficacia de la posterior transferencia. expresión de estas proteínas ―housekeeping‖ .

• Pueden estar marcadas por la detección por • Se utiliza para verificar que la carga de
fluorescencia o quimioluminiscencia. proteína por carril es más o menos igual, así los
niveles de proteínas se pueden comparar de
2. Controles Positivos.
forma cuantitativa.
• Para verificar si el anticuerpo primario se une a
• La expresión cuantitativa de la proteína de
la proteína correcta.
interés puede normalizarse con la del control
• Generalmente, si está disponible, son una de carga para cada muestra.
muestra de la proteína de interés purificada.
Péptidos de bloqueo
• Puede ser una línea celular que sobreexprese
• Algunos proveedores ofrecen péptidos de
la proteína de interés.
bloqueo para sus anticuerpos.
• Puede ser una muestra de tejido del que se
• El péptido de bloqueo se mezcla con el
conozca que expresa altos niveles de la
anticuerpo primario antes de la incubación
proteína de interés. Se pueden utilizar otras
con la membrana y evita la uníón del
especies como tejido de control si el
anticuerpo a la proteína diana. Por tanto no se
anticuerpo tiene reactividad cruzada
detectará ninguna banda.
apropiada.
• Estos estudios demuestran que el anticuerpo
1. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre utilizado se une de forma específica a la
los cristales. proteína de interés.
2. Tras fijación de los lados, verter el gel resolutivo y esperar que
el gel se polimerice.
3. Colocar el peine en la parte superior del gel.

4. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya

polimerizado. Lavar los pocillos con ddH20. El gel está listo
para cargar las muestras y la electroforesis.
Figura 8. Preparación del gel de electroforesis para la separa-
ción de proteínas.

Controles de carga

• Como norma general se utilizan proteínas con

niveles de expresión constante para todas las
muestras. Similar a los ―housekeeping genes‖
en Biología Molecular.

Página 11
 Electroforesis
en Acrilamida

Inicio de Electroforesis

Las muestras se cargan en los pocillos del gel Muestra (pH 6,8)
mediante una pipeta. Normalmente se cargan de
20 a 40 µg de proteína total por carril. Es
importante conocer de antemano, el volumen
que se puede cargar por pocillo, para así evitar
sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida Gly
Proteinas Stacking Gel
de muestra o derrames en pocillos adyacentes. CL- pH 6,8
Una vez finalizada la carga, el gel se somete a un
campo eléctrico generado por una fuente de
alimentación. El tampón utilizado durante la
electroforesis, contiene Tris (mantiene el pH),
Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene
Gly Resolving Gel
las proteínas cargadas negativamente). El pH 8,8
Proteinas
progreso en el gel se monitoriza observando el
frente coloreado por el colorante presente en el
tampón de carga y la posición de los marcadores
de tamaño siempre que estos estén teñidos.

La técnica de electroforesis más habitualmente

utilizada es la de Laemmli. En este método, los
valores de pH de la capa de gel de apilamiento o
concentración (Stacking Gel) y el gel de
resolución (Resolving Gel) son diferentes. La figura
9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis.
Tampón de Electroforesis (pH 8,3)
La glicina tiene carga negativa en el tampón de electrofo-
resis a pH 8,3.
Con la aplicación de un campo eléctrico, la glicina, en el
Stacking Gel, se aleja del electrodo negativo.

La glicina empieza a perder su carga a pH 6,8 y ralentiza

su movimiento. Los iones de cloruro avanzan por delante
de la Gly. El aumento de la resistencia, obliga a las proteí-
nas a alejarse, de forma apilada, del electrodo negativo.

La glicina, debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖ , au-

menta su carga negativa y se mueve por delante de las
proteínas.

Las proteínas se separan según su peso molecular por el

Figura 9. Concentración de bandas de proteínas por el flujo

iónico en el sistema discontinuo de Laemmli.

Página 12
4. Transferencia a una Membrana
Una vez la electroforesis del gel ha terminado, las
proteínas se transfieren a una membrana. La
membrana es un soporte sólido que une e
inmoviliza las proteínas, permitiendo así que la
hibridación de un anticuerpo las pueda detectar.
La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan
la generación de un campo eléctrico para
conducir a las proteínas desde el electrodo
negativo al positivo. Los sistemas de transferencia
están disponibles en formato semiseco o húmedo.
Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren
menor cantidad de volumen de Tampón que los
sistemas húmedos, sin embargo no son apropiados
para transferencia de proteínas de gran tamaño
(>70 kDa) y pueden causar, según el sistema de
detección, un mayor ruido de fondo. Ambos
métodos requieren, para una transferencia
efectiva de las proteínas, un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.

Aunque ambas funcionan bien en experimentos Figura 8. Transferencia de proteínas a una membrana.
de inmunotransferencia, las diferencias en sus
características puden influir a la hora de la
elección. La membrana de PVDF, ofrece una
mayor resistencai mecánica, resistencia la SDS y
una mayor unión que la nitrocelulosa. La
membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de
proporcionar un menor ruido de fondo y que no
requieren un pretratamiento con metanol.
Recientemente se han desarrollado, con el objetivo
de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de
detección de fluorescencia, membranas PVDF de
baja autofluorescencia.

Previamente a la transferencia, tanto el gel como la

Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre
-cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de mini-
membrana se equilibran en una solución tampón gel. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiem-
pre-enfriada. Típicamente, el tampón de po y elimina la contaminación accidental de las membranas
transferencia contiene Tris, Glicina, SDS (opcional) y con guantes o tijeras contamindas.

metanos (para membranas de nitrocelulosa). La

figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la Información para pedidos
membrana en un transferencia semiseca o L-08001-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm
húmeda.
L-08002-010 Membrana Nitrocelulosa 0,45 µm 8x10 cm
A continuación se describen algunas sugerencias
para la consecución exitosa de una transferencia: L-08003-010 Membrana Nitrocelulosa 0,22 µm 8x10 cm
• Las burbujas de aire entre el gel y la membrana
• Evitar la manipulación de las membranas con las pueden causar transferencia defectuosa y
manos desnudas. Las proteínas y aceites de la desigual. Se pueden eliminar haciendo rodar
piel pueden adherirse a la membrana y pueden suavemente una pipeta Pasteur por encima del
dar lugar a manchas no deseadas en la ―sándwich‖ formado por el gel/
membrana. membrana/papel de filtro.

Página 13
 Electroforesis
en Acrilamida

• No permitir un sobrecalentamiento durante la (temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser

transferencia. Es aconsejable utilizar tampón frio, suficiente para un bloqueo de los lugares de
un sistema de refrigeración o hacer la unión no específicos del anticuerpo. Si los
transferencia en una cámara fría. Disminuir el niveles del ruido de fondo son demasiados
voltaje o el tiempo si fuera necesario. altos, se pueden seleccionar otras soluciones
de bloqueo alternativas.
• Ajustar las condiciones de transferencia al
tamaño de la proteína. Las proteínas más
pequeñas se transferirán más rápidamente y
pueden atravesar la membrana. Reducir o
eliminar el SDS o utilizar una membrana con un
tamaño de poro menor puede ayudar a una
mayor retención de la proteína. Incrementar la
cantidad de SDS y disminuir la concentración de
Metanol pueden facilitar la transferencia de
proteínas de gran tamaño.

• La aparición de marcadores de tamaño

preteñidos en la membrana es indicación que se Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo
ha completado la transferencia. y de lavado para su línea de reactivos de detección, Wes-
ternBright, así como soluciones tampón en polvo de PCS, TBS,
• El colorante Ponceau S puede utilizarse para teñir ...que facilitan una rápida y fácil preparación
la membrana y asegurarse de la eficacia de la
transferencia. La membrana debe ser desteñida Información para pedidos
antes del proceso de transferencia. La tinción
R-03024-D50 AdvanWashTM , 500 ml
con Coomassie puede usarse para la tinción del
gel una vez realziada la transferencia y R-03023-D20 AdvanBlockTM -PF, 200 ml
comprobar los residuos de proteína en el gel.
R-01038-020 AvantTM Buffer Pouches - PBS
Bloqueo R-01039-020 AvantTM Buffer Pouches - TBS

El bloqueo de la membrana se lleva a cabo

incubando con una solución diseñada para reducir
los lugares de unión no específicos al anticuerpo. A
menudo, son soluciones a base de proteínas, como
la leche descremada en polvo o la albúmina de
suero bovino (BSA). La primera elección, cuando se
inicia un nuevo protocolo, es la utilización de la
leche descremada en polvo, ya que es más
rentable que el BSA, sin embargo y debido a la
presencia de biotina en las fosfoproteínas, puede
que no sea la mejor elección cuando se van a
utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos
de detección de biotina. Es preferible, para estas y
otras situaciones, el uso de agentes bloqueantes no
proteicos.
5. Hibridación del Anticuerpo.
Después del proceso de bloqueo, la membrana se
incuba con el anticuerpo primario. En general, los
anticuerpos reconocen una secuencia de
aminoácidos pequeña (epítopo) que queda
expuesta al eliminar la estructura tridimensional de
la proteína en condiciones desnaturalizantes y
reductoras. Los geles nativos se pueden utilizar
cuando los anticuerpos requieren de la proteína
plegada para el reconocimiento del antígeno.

El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón Anticuerpos Primarios:

Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino); se Monoclonal vs Policlonal.
puede añadir también detergente Tween 20.
Una incubación durante una hora

Página 14
Análisis de Proteínas

En la transferencia Western se pueden utilizar, tanto otras especies

anticuerpos primarios monoclonales como más probable.
policlonales. Los dos tipos tienen distintas ventajas y
desventajas y se diferencian según la forma en la
que se sintetizan. El primer paso en la producción
de ambos anticuerpos, es la inyección de un
antígeno en un animal, para provocar una
respuesta inmune. Los anticuerpos policlonales se
obtienen directamente a partir del suero del
Tiempo requerido Largo Más corto
animal, comúnmente conejo, cabra, burro u oveja para su producción
y son finalmente purificados y probados. Los
anticuerpos policlonales reconocen múltiples Coste de Mayor coste - requiere Menor coste
Preparación personal capacitado y
epítopos del antígeno y en cambio los equipamiento especializado.
monoclonales reconocen un único epítopo de la
proteína. Para la síntesis de un anticuerpo
monoclonal, las células que sintetizan anticuerpos Variabilidad Los lotes de un mismo Propenso a
se aíslan del bazo del animal y se fusionan con hibridoma son muy estables. cierta
células del mieloma. Lo hibridomas resultantes variabilidad
entre lotes.
secretan anticuerpos al medio de cultivo, el cual se
Tolerancia a Poca tolerancia - puede Más tolerante a
analiza y determina la afinidad al antígeno. Los condiciones dejar de reconocer al condiciones
hibridomas con secreción más estable se variables antígeno en condiciones de variables.
seleccionan y pueden ser cultivados desnaturalización/reducción
indefinidamente. Algunas características de los de la proteína, o por
modificaciones químicas
anticuerpos monoclonales y policlonales se (glicosilación fosforilación) o
describen en la Tabla 8. por diferencias en la
secuencia peptídica debido
Tabla 8. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales. a la presencia de
Anticuerpos Anticuerpos polimorfismos.
Monoclonales Policlonales

Reconocimiento • Reconocimiento de un • Reconocimiento

epitopo y único epítopo múltiples
sensibilidad • Menos sensibilidad epítopos en una
debido a que sólo un proteína
anticuerpo se une a • Más sensible
cada proteína debido a los
multiples lugares
de unión de
anticuerpo en
cada proteína.
• Bueno para
proteínas poco
abundantes.
Reactividad • Reactividad cruzada • Reactividad
cruzada menos probable. cruzada más
potencial • Potencial para reconocer probable.
otras proteínas que • Mayor ruido de
contengan el epítopo. fondo potencial
debido al
reconocimiento
de multiples
epítopos.
• Reactividad
cruzada con

Página 15
 Hibridación IgM, IgA, IgD, IgE) y posiblemente la
Anticuerpos subclase (IgG1, IgG2a,…). Un anticuerpo
con amplia especificidad
inmunoglobulínica debería ser suficiente,
Incubación de los anticuerpos ya que los anticuerpos específicos para
sub-clases se utilian mayoritariamente, en
El anticuerpo primario se diluye en tampón de
experimentos de doble etiquetado u otras
bloqueo, TBST o en un tampón de disolución de
aplicaciones.
anticuerpo comercial. El fabricante puede
recomendar una cantidad inicial, pero a menudo
la concentración óptima de anticuerpo debe
determinarse empíricamente. La afinidad del
anticuerpo, la abundancia de la proteína en la
muestra y la sensibilidad del sistema de detección
afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar.

• Generalmente, un periodo de incubación de

1 hora a temperatura ambiente suele ser
suficiente. También es posible una
incubación a 4ºC durante toda la noche.

• Durante la incubación, la membrana debe

someterse a agitación suave y sumergida en
la disolución, e incubar en un agitador de
vaivén. Un menor volumen puede utilizarse si
la membrana se sella dentro de una bolsa e Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos
incuba en un agitador orbital.
secundarios marcados para detección mediante
• En algunos casos, la disolución con el quimioluminscencia o fluorecencia.
anticuerpo, puede reutilizarse. Si se utiliza
acida sódica como conservante, debe ser
totalmente lavada de la membrana, ya que Información para pedidos
puede eliminar la actividad de la peroxidasa
e interferir en los métodos de detección. R-05051-050 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 50 µl

Después de la incubación con el anticuerpo

primario, se procede a la eliminación del
excedente mediante tampones de lavado (TBS,
PBS, TBST o PBST). En métodos de detección
indirectos (sección 6), es necesario un anticuerpo
secundario apropiado. A continuación se
describen las consideraciones a tener en cuenta
a la hora de la elección de un anticuerpo
secundario:
• Las especie del primer Ac dicta la elección
del Ac secundario. Si el primer Ac es de
conejo, el segundo Ac debe ser anti-conejo,
o sea, deber ser producido en otra especie
distinta a conejo.
• Para anticuerpos monoclonales se debe
considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG,
R-05051-250 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 250 µl
R-05052-050 IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 50 µl
R-05051-250 IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 250 µl
R-05071-500 Anticuerpo Secundario conjugado HRP
cabra-anti-ratón, 500 µl
R-05072-500 Anticuerpo Secundario conjugado APC
cabra-anti-conejo, 500 µl
6. Detección.
La detección de la proteína se puede hacer
mediante métodos directos o indirectos, cada
uno con sus ventajas e inconvenientes. Los
métodos directos utilizan un anticuerpo primario

Página 16
 Análisis de Proteínas

conjugado con un marcaje detectable, como un Los métodos más comúnmente utilizados para
enzima, biotina o molécula fluorescente. Los detectar proteínas son: 1. Quimioluminiscencia,
anticuerpos se pueden marcar mediante kits 2. Fluorescencia y 3. Colorimetría.
disponibles en le mercado u obtenerlos ya
Inconvenientes: requiere una habitación oscura
(película rayos X) o sistemas de imagen caros, se -
micuantitativa - porque se basa en una reacción
enzimática, la película tiene un rango dinámico
limitado, la intensidad de la señal puede variar
con la incubación o el tiempo de exposición, no
son posibles detecciones multiplex (detección de
mas de una proteína, sólo un color de reacción)

Nota: LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para Información para pedidos
la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos
L07014-100 Película Rayos X LucentBlueTM , 20x25 cm, 100 uds
realizados con los substratos WesternBright HRP, incluyedo Western-
BrightTM ECL, Westernbright Quantum y WesternBright Sirius. L07013-100 Película Rayos X LucentBlueTM , 13x18 cm, 100 uds

marcados. Lo métodos indirectos utilizan dos 1. Quimioluminiscencia.

anticuerpos; un anticuerpo primario y un
Los métodos de detección de
anticuerpo secundario contra la especie del primer
quimioluminiscencia utilizan comúnmente
anticuerpo. En la detección indirecta, es el
anticuerpos secundarios conjugados con
anticuerpo secundario el que está conjugado con
peroxidasa (HRP). La reacción entre el encima y
un marcaje detectable. La figura 11,ilustra los
el substrato produce luz, que puede ser
métodos de detección directos e indirectos y en la
Tabla 9 se resumen las ventajas e inconvenientes detectada mediante la exposición de la
membrana a una película de rayos X o captada
de los dos métodos.
de forma digital utilizando una cámara CCD.

Ventajas: muy sensible, la membrana puede

Métodos de detección. tratarse para re-utilizarse, se pueden hacer
multiples exposiciones en películas de rayos X,
fácil de documentar.

Página 17
 Figura 11 . Detección directa e indirecta de proteínas

Tabla 9. Ventajas e Inconvenientes de los métodos de

detección
Indirecto Directo

Ventajas • Amplificación de • Menos pasos.

señal debido a la • Menos
unión de posibilidades de
múltiples Ac unión no
secundarios a específica.
cada Ac
primario.
• Versátil - el mis-
mo Ac secunda-
rio puede
utilizarse para
diversos
anticuerpos de
la misma
especie.
Inconvenientes • Mayor posibilidad • Puede ser más
de unión no costoso.
inespecífica. • La
• Más pasos. inmunorreactividad
del Anticuerpo
puede estar
afectada por el
marcaje.

2. Fluorescencia. Re-utilización de la membrana

El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo, Después de captar la imagen, la membrana

que cuando es ―excitado‖ emite luz. La luz
emitida, se detecta mediante un dispositivo capaz
de medir la fluorescencia o mediante una cámara
CCD provista con los filtros de longitud de onda
apropiada. La imagen se digitaliza para su análisis.
Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede
incrementarse utilizando el sistema streptavidina/
biotina), apto para ensayos multiplex con múltiples
colorantes, amplio rango dinámico, no se Detección
puede ser tratada para volver a ser utilizada para
la detección de otra proteína. Este procedimiento
puede conservar las muestras, pero consume
mucho tiempo. Con la detección multiplex de
fluorescencia, se pueden detectar múltiples
proteínas de forma simultanea, es ideal para
comparar la proteína de interés con un control de
carga, o diferentes isoformas de la proteína. Las
membranas PVDF son preferibles a la de

Página 18
Análisis de Proteínas

nitrocelulosa en protocolos de lavados para

reutilización.

Nota: WesternBright TM
MCF permite la detección, mediante la
detección fluorescente multicolor, de dos proteínas en una
sola membrana. Perfecto para aquellos experimentos en los
que se necesite comparar la proteína de interés con un control
de carga.

Información para pedidos

K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit

Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos

de detección de quimioluminiscencia optimizados para los
diferenentes métodos, concentración de muestra y tipos expe-
rimentales.

Información para pedidos

K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP
Substrate (para 1000 cm2 de membrana)

K-12042-D10 WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Subs-

trate (para 1000 cm2 de membrana)

K-12045-D20 WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substra-

te (para 2000 cm2 de membrana)

K-12042-D10 WesternBrightTM ECL Spray

requiere el uso de una cámara oscura, aporta datas cuantificables, fácil documentación de resultados,
pueden usarse Ac primarios marcados (para proteínas abundantes) y eliminar pasos.

Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden ser costosos, no es tan sensible como la
quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para proteínas poco abundantes).

3. Colorimetría.

Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima
(peroxidasa o fosfatasa alcalina). El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible
en la membrana. La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. La
intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro.

Ventajas: sencilla de realizar, no requiere cámara oscura, las membranas se pueden documentar
fácilmente mediante fotografía.

Página 19
Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos, el color se desvanece con el tiempo.

Página 20
 Análisis de Proteínas

7. Solución de Problemas

Solución de problemas con Western Blot

A. No se puede B. Tamaño inco-

C. Bandas arte- D. Problemas en E. Ruido de fon-
ver la proteína rrecto de la
factuales la electroforesis do excesivo
de interés banda

Preparación La proteína es Bandas El gel polimeriza Bloqueo

Muestra menor de lo Incompletas demasiado Insuficiente
(ver 1) esperado (ver 12) rápido o dema- (ver 24)
(ver 7) siado lento
(ver 17,18,19)

Transferencia Bandas Difusas Lavado

Inadecuada La proteína es (ver 13) inapropiado
(ver 2) mayor a lo es- (ver 25)
El gel corre de-
perado masiado rápido
(ver 8, 9) o demasiado
Rayas lento
Unión ineficien- Verticales (ver 20,21) Contaminación
te del Anticuer- (ver 14) Reactivos
po (ver 3, 4) (ver 26)
Bandas Múlti-
ples (ver 10)
Frente corre
Distorsión curvado
Problemas con Lateral Elección de
los reactivos ―smiling‖
(ver 15) Membrana
(ver 5, 6) (ver 22)
(ver 27)
Las bandas
aparecen muy
altas o muy
bajas en el gel Bandas distor- Frente corre
sionadas Unión no es-
(ver 11) inclinado
(ver 16) pecífica del
(ver 23) Anticuerpo
(ver 28)

Revelado de la
película
(ver 29)
Solución de
Problemas

A. Problema Causa(s) Solución

1. Preparación Muestra Extracción ineficiente Intentar métodos alternativos; incluir

control positivo en el gel

Página 21
 Baja expresión de la proteína en el tejido Cargar más cantidad de proteína total en
o las células el gel; concentrar utilizando Afyon, juntar
múltiples muestras

La proteína se ha degradado durante la Usar inhibidores de proteasa en le tampón

extracción de lisis

2. Transferencia indadecuada Tampón de transferencia preparado Revisar el protocolo/disminuir metanol

incorrectamente/demasiado metanol en el
tampón

Proteínas de mayor tamaño necesitan Repetir con un tiempo mayor/mayor

mas tiempo/voltaje voltaje

Contacto insuficiente entre el gel y la Revisar la almohadilla de fibra; sustituir si es

membrana muy delgada

3. Unión ineficiente del Baja afinidad del anticuerpo por la Incrementar la concentración del
Anticuerpo primario proteína o el anticuerpo es antiguo/débil Anticuerpo; comprar un anticuerpo nuevo
y almacenarlo de forma apropiada

El Anticuerpo tiene reactividad cruzada Probar con un Anticuerpo primario de

débil con las especies de interés diferente origen

El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava- Usar menor numero de lavados; disminuir

do la concentración de sales el tampón de
lavado
Antígeno enmascarado por el agente Utilizar un agente de bloqueo alternativo
bloqueante (ej.: Leche,…) (ej.: BSA,…)

4. Unión ineficiente del Anti- Elección de especies errónea Usar Anticuerpos dirigidos contra la espe-
cuerpo secundario cie del Anticuerpo primario
Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno
o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo

5. Conjugado/Substrato Inac- Reactivos viejos o inestables Mezclar conjugado + substrato en un

tivo tubo; o luminiscencia en oscuridad -
conseguir un nuevo reactivo si no hay
señal
Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica Evitar utilizar disoluciones conteniendo
este agente conservante

6. Reactivo de detección La disolución es antigua o está Comprar reactivo nuevo

(ECL) almacenada de forma inapropiada

B. Problema Causa (s) Solución

7. Proteína más pequeña de Proteólisis; Congelación/descongelación Uso de inhibidores de proteasa/muestras

lo esperado de la muestra frescas

Proteína variante (Splicing) Consultar literatura/utilizar controles

apropiados

8. Proteína más larga de lo Proteínas modificadas de forma natural Consultar literatura para encontrar
esperado y/o bandas (glicosilación, fosforilación, acetilación, aditivos que puedan eliminar grupos
múltiples etc…) químicos

Página 22
 Análisis de Proteínas

Cambio de la expresión de la proteína en Utilizar cultivos anteriores; incluir un control

la línea celular positivo

9. Proteína más larga de lo Agregado de proteínas - puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra; pulso
esperado intactos de centrífuga previo a la carga de la
muestra

B. Problema Causa(s) Solución

(continuación)

10. Bandas Extras Unión no específica del Anticuerpo Disminuir concentraciones; intentar un
primario o secundario experimento de bloqueo de péptido
(eliminará la proteína de interés)

11. La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel Incrementar el porcentaje para proteínas
alta o muy baja en la de pequeño tamaño; disminuir para
membrana proteínas de gran tamaño

C. Problema Causa(s) Solución

12. Bandas Incompletas Burbujas entre el gel y la membrana Usando una pipeta, hacer rodar por
encima del paquete gel/membrana para
forzar la salida de las burbujas

13. Bandas difusas Migración lenta Incrementar voltaje; asegurarse de la

correcta preparación del tampón

Las muestras no se han calentado Asegurarse que las muestras se han

correctamente incubado durante 2 min a 90ºC antes de
cargarlas en el gel

El SDS del tampón es antiguo Preparar SDS nuevo para le tampón de

muestra

14. Rayas en los carriles Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el
tampón de muestra

Muestra muy concentrada o insuficiente Incrementar concentración/usar más SDS

SDS

15. Distorsión lateral de las Difusión de la muestra en los pocillos Minimizar el tiempo de carga
bandas durante la carga

16. Distorsión de las bandas Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP pocillos

Presión aplicada excesiva a la hora de No apretar en exceso los tornillos del siste-
montar el gel ma, apretar hasta encontrar primera
resistencia

Burbujas en el gel debido al uso de crista- Usar guantes en la preparación de los ge-
les sucios les
Uso de Etanol y H2O desionizada en la
limpieza de los cristales

Burbujas introducidas en el gel por el No expulsar totalmente el volumen de la

dispositivo de llenado (jeringa o pipeta) mezcla del gel

Burbujas de aire atrapadas por el peine Insertar el peine en ángulo y antes que se
polimerice el gel

Página 23
D. Problema Causa (s) Solución

17. El gel no polimeriza Fallo al añadir el TEMED y AP Repetir con TEMED y AP

La disolución AP es estable durante dos o Preparar AP fresco

tres días a 4ºC

El oxígeno inhibe la polimerización Aplicar isopropanol antes de verter el gel

de apilamiento (stacking gel)

18. El gel polimeriza muy lento TEMED/AP Insuficiente Incrementar la cantidad de TEMED/AP

La disolución de AP ha perdido su Preparar disolución fresca de AP

actividad

Solución de
Problemas

D. Problema Causa(s) Solución

(continuación)

19. El polimeriza demasiado Cantidad excesiva de TEMED/AP Reducir la cantidad de TEMED/AP,

rápido manteniendo la relación entre ambos

20. Tiempo de carrera Buffer de electroforesis demasiado Revisar protocolo; diluir el tampón en caso
inusualmente largo concentrado necesario

Voltaje insuficiente Incrementar voltaje

21. Tiempo de carrera Tampón demasiado diluido Revisar el protocolo; reemplazar tampón
inusualmente corto en caso necesario

22. Frente curvado (smiling) Migración demasiado rápida Disminuir voltaje

Generación de calor Disminuir voltaje; refrigerar

23. Frente inclinado Burbuja atrapada entre los cristales en la Aguantar el gel en ángulo; colocar una
parte inferior del gel esquina en el tanque inferior del sistema
de electroforesis; lentamente volver a
posición vertical

E. Problema Causa(s) Solución

24. Bloqueo insuficiente La presencia de Biotina en la leche es Usar BSA

incompatible con el uso de Estreptavidina,
o la leche contiene el antígeno de interés

Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright Incluir BSA o leche en la disolución

MCF, algún Anticuerpo primario puede AdvanBlock-PF utilizada en la dilución del
requerir un bloqueante proteico Anticuerpo primario

La disolución está demasiado diluida Incrementar con un 5% la disolución

Tiempo de bloqueo muy corto Incrementar el tiempo de incubación

Algunos detergentes no son efectivos a Incubar a temperatura ambiente en vez

bajas temperaturas de toda la noche a 4ºC

Página 24
 Análisis de Proteínas

25. Condiciones de lavado Número insuficiente de lavados Incrementar el número de lavados o la

inapropiadas duración de cada uno de ellos

Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de

detergente o usar detergentes más fuertes
(SDS, NP-40)

26. Contaminación de los Crecimiento bacteriano o fúngico en los Revisar la turbidez de los tampones;
reactivos tampones preparar nuevos

27. Elección de tipo de Las membranas PVDF pueden tener más Elegir membranas de Nitrocelulosa
membrana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa

Algunas membranas tienen alta Utilizar únicamente membranas PVDF con

autofluorescencia baja autofluorescencia con Western Blots
fluorescentes

Membrana seca Estar seguro que la membrana esta

húmeda durante todo el proceso

28. Unión no específica del Concentración muy alta del Anticuerpo o Disminuir la concentración de Anticuerpo;
Anticuerpo primario o secun- no purificado por afinidad intentar con Anticuerpo monoclonal o
dario purificado por afinidad

Mucha cantidad de proteína en el gel Disminuir la cantidad de proteína

29. Sobreexposición de la El tiempo excesivo de exposición a la Reducir los tiempos de exposición; si no es

imagen película o al CCD posible incrementar la dilución de los
Anticuerpos o cargar menor cantidad de
muestra

8. Herramientas y Referencias Técnicas

g de Soluto
Molaridad de una disolución =
[Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución)

Tabla 10. Código genético y abreviaciones de los aminoácidos

Segunda Posición

U C A G

UUU Fenilalanina UCU UAU Tirosina UGU Cisteina

UUC (Phe, F) UCC Serina UAC (Tyr, T) UGC (Cys, C)
UCA (Ser, S)
U UUA Leucina UCG UAA STOP UGA STOP
UUG (Leu, L) UAG
UGG Triptófano
(Trp, W)

Página 25
 CUU CCU CAU Histidina CGU
CUC Leucina CCC Prolina CAC (His, H) CGC Arginina
C CUA (Leu, L) CCA (Pro, P) CGA (Arg, R)
CUG CCG CAA Glutamina CGG
CAG (Gln, Q)
AUU Isoleucina ACU AAU Asparagina AGU Serina
AUC (Ile, I) ACC Treonina AAC (Asn, N) AGC (Ser, S)
AUA ACA (Thr, T)
A ACG AGA Arginina
AAA Lisina
AUG Metionina AAG (Lys, K) AGG (Arg, R)
(Met, M)
GGU
GUU GCU GGC Glicina
GAU A. Aspártico
GUC Valina GCC Alanina GGA (Gly, G)
GAC (Asp, D)
G GUA (Val, V) GCA (Ala, A) GGG
GUG GCG
GAA A. Glutámico
GAG (Glu, E)
Tabla 11. Conversión entre masa y moles de proteína Tabla 12. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale

Peso molecular 1 µg Proteina 1 nmol A280 Uds por 1 mg&ml

(Da)

10.000 100 pmol o 6x1013 moléculas

IgG 10 µg 1,35

20.000 20 pmol o 1,2x1013 moléculas

IgM 50 µg 1,2

100.000 10 pmol o 6x1012 moléculas

IgA 100 µg 1,3

150.000 6,7 pmol o 4x1012 moléculas

Proteina A
150 µg 0,17

Avidina 1,5

Estreptavidina 3.4

Albumina suero bovino 0,7

Herramientas y
Referencias

Tabla 13. Prefijos métricos Tabla 16. Masa molecular media de los aminoácidos

Página 26
 Análisis de Proteínas

M mega 106 n nano 10-9 Códigos Aminoácidos Masa molecular media

K Kilo 103 K pico 10-12 A Ala 71,08

m mili 10-3 f femto 10-15 C Cys 103,1

µ micro 10-6 a atto 10-18 D Asp 115,1

ds doble cadena ( como en dsDNA) E Glu 129,1

ss cadena sencilla (como en ssDNA) F Phe 147,2

G Gly 57,05
bp pares de base
H His 137,1
kb kilobase; 1.000 bases o pares de base
I Ile 113,2
Da Dalton, unidad de masa molecular
K Lys 128,2
mol mol
L Leu 113,2
M molaridad, moles de soluto por litro de disolución
M Met 131,2
Radioisótopo Vida media
N Asn 114,1

Carbono-14 (14C) 5.730 años P Peo 91,12

Q Gln 128,1
Iodo-125 (125I) 60 días
R Arg 156,2
Fósforo-32 (32P) 14,3 días
S Ser 87,08
Azufre-35 (35S) 87,4 días
T Thr 101,1
Tritio (3H) 12,4 años
V Val 99,07

W Trp 186,2
Tabla 14. Abreviaciones
Y Tyr 163,2

Tabla 15.. Vida media de los Radioisótopos más habituales

Página 27
Copyright © 2011 Advansta. All rights reserved. The Advansta logo is a registered trademark of the Company. AdvanBlock™, AdvanWash™, Afyon™, Avant™, LucentBlue™ and
WesternBright™ are trademarks of the Company. All other trademarks, service marks and tradenames appearing in this brochure are the property of their respective owners.

Página 28
 Importador

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Tel./Fax: 94 450 26 01 Tel.: 91 444 06 62; Fax: 91 594 02
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