TEMA 7: ESTRATEGÍA DE DNA RECOMBINANTE

Enzimas de modificación de DNA

Las endonuclasas de restricción.

Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son

enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de
una secuencia que reconocen.

Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).

Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un

mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en
la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve
para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de
restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA
extranjero y no el DNA bacteriano, es decir, pertenecen al sistema de
restricción modificación.

Catalizan el corte de moléculas

de DNA 2c en sitios específicos.

Secuencia diana (sitio de

restricción) palindrómica: 4-8 pb

Punto de corte simétrico

respecto del eje de la diana

3 1ªs letras: género y sp.

4ª letra (opcional): estirpe

Nº romano: orden descripción

El mecanismo del corte de ADN se realiza a través de la ruptura de dos
enlaces fosfodiéster en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA.
Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o
cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de
modo espontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos
coincidentes que pueda haber en la cercanía

Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas

especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo
extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas
isoesquizómeros.

Enzima ligasa:

Son las enzimas que se encargan de unir los fragmentos de DNA mediante un
enlace fosfodiester, para recuperar la cadena DNA original.

Según el tipo de extremo que haya dejado la endonucleasa, es decir, romo o

cohesivo:

Misma enzima, extremos cohesivos o romos: Se recupera la diana

Enzimas diferentes, extremos cohesivos compatibles: No siempre se recupera

la diana

Enzimas diferentes, extremos romos: Casi nunca se recupera la diana

El fragmento de Klenow es un fragmento proteico de gran tamaño
perteneciente a la enzima DNA polimerasa I, procedente de E. coli. Este
fragmento puede separarse del resto de la enzima gracias a la proteasa
subtilisina. Mantiene la actividad polimerasa 5’ → 3’ y la actividad exonucleasa
3’ → 5’ para eliminar nucleótidos previos a la secuencia codificante y corrección
de errores, pero pierde su actividad exonucleasa 5' → 3'.

Potente actividad exonucleasa3’-->5’ y baja actividad polimerasa 5’-->3’

Eliminación de extremos 3’-protuberantes
Pasos generales para el procedimiento de clonación:

El gen, fragmento de DNA que se quiere clonar debe ser aislado de la muestra,
es decir, debe ser extraído del genoma completo.

La primera etapa es la preparación del DNA mediante la rotura con

endonucleasas.

La segunda etapa es la preparación del vector: rotura con la misma

endonucleasa que se ha fraccionado el DNA. Como vector de clonación se
puede utilizar un plásmido, un cósmido, un virus...La propiedad esencial es que
sean autoreplicativos.

La tercera etapa es la unión del DNA al vector: Habiendo cortado el DNA y el

vector con una misma endonucleasa de restricción, ambos pueden unirse
gracias a una ligasa. Al conjunto de vector e inserto se le denomina DNA
recombinante.
La cuarta etapa es la incorporación del DNA recombinante: El DNA
recombinante se introduce en las bacterias empleando métodos diversos:

El vector se replica al dividirse la bacteria y también de forma autónoma. Con

ello, aumenta el número de copias. Cada bacteria, haya incorporado o no un
vector y un DNA recombinante, se multiplica para dar lugar a un "clon",
población de bacterias con idéntico material genético.

1-Preparación del tipo de inserto:

Se pueden realizar dos clones:

-El DNA genómico directamente mediante el corte con enzimas de restricción o

bien mediante la amplificación por PCR

-A partir del RNA mensajero y gracias a la retrotranscriptasa se puede llegar a

obtener el DNA original

Insertos de cDNA:

Las enzimas implicadas en la retrotranscripción son:

Transcriptasa inversa: usa como cebador el oligo T puesto que complementa

con la cola de Poli A
Cuando ya se obtiene la molécula de doble cadena el problema que presenta
es que es una molécula roma

Para purificar se utiliza una cromatografía en gel de oligo-dT de sepharosa.

La DNA polimerasa 1 es la encargada de sintetizar la segunda cadena de DNA

usando como molde la primera cadena sintetizada por la retrotranscriptasa.

A la preparación de ADN se le añade una molécula denominada Linkers (

conectores)

Conversión de extremos cohesivos en romos

•Rellenado de extremos 3’-retraídos: Klenow

•Eliminación de extremos 3’-protuberantes: DNApolT4

Conversión de extremos romos en cohesivos

Oligonucleótidos de DNA 2c de extremos romos con dianas de enzimas que

producen extremos cohesivos

•Adición de conectores (‘linkers’) a los extremos

Para convertir un ADN a romo se hace mediante La enzima es la SMA1.

Otra estrategia es usar los Linkers que se corta mediante la enzima Bam H1 se
añade al inserto y se une gracias a la ligasa

2-Preparación del vector.

Molécula de DNA de pequeño tamaño, que actúa como portador/ vehiculo del
DNA a clonar( inserto de DNA).

Se debe conocer las características y la secuencia del vector, así como que
posea la capacidad de replicación autónoma, es decir, que pueda ser replicado
independiente del cromosoma bacteriano..

El vector puede ser comerciales y generalmente están basados en plásmidos

bacterianos o en genomas víricos.

Características

Origen de replicación

 Replicación dentro de la célula hospedadora

 Correcto reparto de copias entre las células hijas

Define el organismo utilizable como célula hospedadora, puesto que es propio

de cada organismo.

Marcador de selección

 Identificación/selección de células que contienen el vector

 Más utilizados: genes de resistencia a antibióticos (AbR)

Sitio de clonación múltiple (MCS) o policonector(‘polylinker’)

Es una secuencia de ADN que contiene una gran cantidad de sitios de

restricción en tándem. El sitio de restricción es único

Le confiere versatilidad al vector.

Marcador de selección adicional

 Identificación/selección de células que contienen DNA recombinante

 Más utilizados: sistemas de inactivación insercional(lacZ)

Al ser un inserto, aquellas bacterias que las hayan incorporado se ha

interrumpido con nuestro gen a clonar de forma que aquellas que expresen el
gen testigo LacZ es porque no lo han incorporado, es lo que se denomina
inactivación insercional. Aquella colonia que no exprese LacZ es porque si que
ha incorporado el inserto y ha interrumpido la secuencia del gen LacZ de forma
que no expresa beta-galactosidasa.

Tipos de vectores

A) Según su utilidad/objetivo

Vectores de clonación :Sólo mantienen y propagan el inserto de DNA de interés

Vectores de expresión: Elementos/señales necesarios para la transcripción y

traducción del inserto en la célula hospedadora
 En este caso se sabe que es un vector
de expresión porque contiene un origen
de replicación (F1 origin, pBR322
origin), tiene un promotor seguida por
las secuencias MCS que cualquier
elemento que se incluya va a ser
transcrito.

También posee un codón de inicio ATG

y luego un codón de STOP

Según el tipo de célula hospedadora

•E. coli: Plasmídicos ,Víricos

•Otras bacterias Pseudomonas,Bacillus, Streptomyces, etc. El origen de

replicación es quien nos va a dar la identidad de la célula hospedadora.

•Levaduras

•Plantas

•Células/embriones animales

•Vectores mixtos/lanzadera(‘shuttlevectors’): Son los vectores que son capaces

de replicarse en más de una célula, también se llama vectores lanzadera. Estos
vectores contienen orígenes de replicación que son capaces de inicirar la
replicación en dos o más espcies. Este de aquí es capaz de replicarse en
bacterias puesto que tiene el punto OricC y también en levaduras porque
contiene el punto ARS

El URA 3 es un marcador de auxotrofia es decir una cepa que sea uaxotrofa a

un compuesto con este marcador se soluciona el problema
Tipos de vectores

C) Según su capacidad de replicación en la célula hospedadora

Vectores replicativos: ori (bacterias), ARS (levaduras), etc.

Vectores integrativos: No se replican, sino que se integran en el genoma de la

célula hospedadora
Los baculovirus son los virus que se replican en los insectos.

Cósmidos

Plásmido que contiene sitios cosdel fago λ

Introducción en la célula hospedadora .: Empaquetamiento in vitro e infección

Dentro de la bacteria se comporta y replica como un plásmido -->Se aíslan

colonias, no halos de lisis.

Es un vector mixto entre el fago landa y un plásmido de bacteria. Tiene un sitio

COS y lo bueno es que se puede introducir fragmentos muy grandes de DNA.
Se puede introducir en E. coli muy fácilmente puesto que puede actuar como
un fago.

Aplicaciones:

 Genotecas genómicas eucariotas

 Clonación de genes eucariotas(completos)
 Clonación y análisis de grandes regiones de DNA eucariota
Los productos que se pueden obtener al ligar el inserto con el vector son:

Ligación intramolecular: Recircularización vector, es decir, el vector vuelve a

cerrarse sobre si mismo

Ligación intermolecular

 Vector-Inserto: es el producto deseado, es cuando el DNA inserto se une

al vector
 Vector-Vector: No es un producto deseado, es cuando se unen entre sí
dos vectores, falta el inserto.
  Inserto-Inserto: No es un producto deseado, es cuando se unen dos
insertos, falta el vector.

Hay tres formas de evitar dichos subproductos no deseados:

 Clonación direccional: Es cuando se corta el inserto y el vector con dos

enzimas de restricción diferentres.
 Desfosforilación del vector: Al aplicar la fosfatasa alcalina, de los 4
puntos de posible unión solo 2 pueden unirse con la ligasa( Gracias a los
5´P del inserto. Por tanto, en cada punto de unión una hebra queda
ligada y la otra con una mella, sin enlace y sin fosfato. Estas mellas
serán cerradas más tarde por los mecanismos de reparación del DNA de
la célula hospedadora

 Una relación molar entre inserto/vector elevada de forma que se

pueda llegar a establecer una buena proporción de productos
deseados:Inserto-vector.
4. Introducción del DNA recombinante en la célula hospedadora

Las características de las células hospedadoras son:

 Células especializadas de un genotipo adecuado

 Que se trate de un organismo modelo puesto que se conoce la
genética de dichos organismos
 Determinación del tipo de vector a utilizar puesto que no todos los
vectores se replican y expresan en todas las células
hospedadoras
 Propagación del DNA recombinante de forma estable y sin afectar
su integridad

Escherichia coli

•Estirpes deficientes en restrictasasy recombinación: r–m–,rec–

•Crecimiento fácil y rápido

•Genética muy conocida. Grandes colecciones de mutantes

Otras células hospedadoras

Otras bacterias: Gram(+) y Gram(–)

Levaduras (Saccharomycescerevisiae)

Plantas

Líneas celulares mamíferos: HeLa, NIH-3T3, HEK-293, etc.

Embriones animales

Células de insecto

Introducción del DNA recombinante en la célula hospedara

1) Transformación

Captación de DNA directa desde el medio extracelular

Bacterias, levaduras y células vegetales

 Tratamiento con cationes (Ca2+, Mg2+, Co2+, Rb+, Li+) o compuestos

químicos (PEG, DMSO) para alterar la permeabilidad de la mb.
plasmática Células competentes
 Choque térmico (0-4 ºC-->37-45 ºC; 30 s-1 min)
 105-109 colonias transformantes/μg DNA
Transformación de las bacterias o bien las introducción del rDNA en las células
anfitrionas (métodos diversos). Se puede llegar a establecer una
cotransformación es decir, dos moléculas de rDNA. Cada célula anfitriona
puede incorporar ninguna, una ,o siendo esto menos frecuente, varias
moléculas de DNA recombinate.

2) Transfección

Análoga a la transformación, en células animales

 DNA precipitado con Ca3(PO4)2o adsorbido a DEAE-

dextrano(policatión)

5. Amplificación del DNA recombinante

Las células proliferan y cada una da lugar a un clon o a colonias de células

idénticas.
A partir de aqui las día positivas impresas.