FACULTAD DE INGENIERIA AGRARIA CON MENCION

FORESTAL
ESPECIALIDAD DE INGENIERIA AGROFORESTAL.

INFORME: PRACTICA DE OBSERVACIÓN DE

BACTERIAS Y HONGOS.

ASIGNATURA:

 Procesos Post productivos Agroforestales I

ALUMNO:
 Quispe Frias Keelvin

DOCENTE:
Ing.: Trujillo Alvarado, Dominic Danisa

Nueva Cajamarca-San Martin

Marzo de
2018
 PRACTICA N° 01:

OBSERVACIÓN DE BACTERIAS

I. OBJETIVOS

1.1. Conocer técnicas de tinción de bacterias

1.2. Diferenciar tipos de bacterias según su forma
1.3. Identificar tipos de bacterias según su coloración

II. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden observarse

directamente al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo
contraste entre las células y su entorno, estos procedimientos se utilizan en
ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la observación de la movilidad
bacteriana. Los microscopios de contraste de fases, interferencia diferencial (DIC
o la microscopía de Nomarski) y campo oscuro permiten aumentar el contraste,
empleándose para la observación de vainas, filamentos u otras estructuras
bacterianas.
La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y
su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas
de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar
notablemente el contraste.
En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de
microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La
fijación es un procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se
puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación
química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias.
Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión
bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación
por calor preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las
estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, folmaldehido
y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras
celulares.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO

3.1. BACTERIA GRAM NEGATIVA

En microbiología, se denominan bacterias Gram negativas aquellas que

no se tiñen de azul oscuro o de violeta por la tinción de Gram, y lo hacen
de un color rosado tenue: de ahí el nombre de "Gram negativas" o también
"gramnegativas".1 Esta característica está íntimamente ligada a la
estructura didérmica dada por la envoltura celular, pues presenta doble
membrana celular (una externa y la otra citoplasmática), lo que refleja un
tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales
supergrupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se utiliza también
el nombre de Negibacteria2 o Didermata. Las restantes son las bacterias
Gram positivas.
 Las bacterias Gram negativas presentan dos membranas lipídicas entre
las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que
las bacterias Gram positivas presentan sólo una membrana lipídica y la
pared de peptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no
retiene el colorante durante la tinción de Gram.

3.2. BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen

de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de
"Gram-positivas" o también "grampositivas".1 Esta característica Química
está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que
refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los
principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se utiliza
también el nombre de Posibacteria. Las restantes son las bacterias Gram
negativas.

La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la

membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa
capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a
la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La
capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y
es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram. A
diferencia de las Gram-positivas, las Gram-negativas presentan una
segunda membrana lipídica externa a la pared celular.

Bacteria Gram-positiva.

 1-membrana citoplasmática,
 2-peptidoglicano,
 3-fosfolípidos,
 4-proteínas,
 5-ácido lipoteicoico
 Bacteria Gram-negativa.

 1-membrana citoplasmática
(membrana interna),
 2-espacio periplasmático,
 3-membrana externa,
 4-fosfolípidos,
 5-peptidoglicano,
 6-lipoproteína,
 7-proteínas,
 8-lipopolisacáridos,
 9-porinas.

3.3. TINCIÓN SIMPLE

La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son
colorantes derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente
pigmentadas que proceden del alquitrán.
Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la
molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de
metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría
utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica y
verde malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte
de los procariotas tienen un pH interno próximo a la neutralidad (pH 7.0) y
una superficie celular cargada negativamente, así los colorantes básicos
son los más eficaces. Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala,
eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son
utilizados para teñir positivamente ciertos componentes como las
proteínas.
La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de
la forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin
embargo tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido

3.4. TINCIÓN DIFERENCIAL. Las tinciones diferenciales se utilizan

ampliamente en microbiología; consisten en la aplicación de dos colorantes
que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca
una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre
determinadas células dentro de una población. La diferenciación puede ser
provocada por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos
de respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra. Las dos
tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la tinción de
gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia.
  Tinción de Gram
Esta tinción diferencial fué propuesta por el medico danés Christian
Gram (1884) (TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar
de enfermos fallecidos por neumonía observó que la bacteria
Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retenía el
colorante conocido como marrón Bismark (sustituido posteriormente
por el cristal violeta), mientras que el tejido pulmonar no era capaz de
retener el colorante.
Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y
prácticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de
cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información
esencial, además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular,
como es el tipo y composición de la pared que presentan las bacterias.
La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio
Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram
positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa.
La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos
tipos de organismos hace que ambos grupos respondan de manera
distinta, así mientras las bacterias gram positivas mantienen y
conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias gram
negativas se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol,
admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre
rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta

IV. MATERIALES Y EQUIPOS

Material biológico: Muestras bacterianas de yogurt, suelo, sarro dental, etc.
Material de laboratorio
 Colorantes (safranina y cristal violeta, lugol)
  Decolorante (acetona con alcohol etílico)
 Piseta con agua destilada
 Láminas Portaobjetos
 Láminas Cubreobjetos
 Gradilla
 Asa de siembra
 Aceite de inmersión.
 Mechero de alcohol
Equipos:
 Microscopio
 Estufa
 Autoclave

V. METODO

5.1. TINCION SIMPLE

 Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña
alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
 Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el
portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar.
 Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el
portaobjetos.
 Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina)
durante 1 minuto.
 Lavar el exceso de colorante con agua.
 Dejar secar al aire.
 Añadir una gota de aceite de inmersión.
 Observar con objetivo de inmersión (100 x).

5.2. TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM

 Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña

alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
 Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el
portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar.
 Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el
portaobjetos.
 Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.
 Lavar el exceso de colorante con agua.
 Añadir el mordiente lugol, solución de yodo-ioduro potásico, durante
1 minuto.
 Lavar el exceso de mordiente con agua.
 Lavar la preparación con el decolorante (acetona + alcohol)
formando un ángulo con la preparación, durante 30 segundos (el
tiempo de decoloración es clave para un resultado correcto).
 Lavar inmediatamente con abundante agua.
 Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.
  Lavar el exceso de colorante con agua.
 Dejar secar al aire.
 Añadir una gota de aceite de inmersión.
 Observar con objetivo de inmersión (100 x)

VI. RESULTADOS.
 VII. DISCUSIONES.

Los resultados no son como uno esperaba ya que se cometió errores, en comparación
con otras imágenes microscópicas los resultados no son congruentes y claros.

Se necesita organizar correctamente los roles de cada integrante del grupo de práctica
para facilitar el desarrollo de acorde con lo establecido a la ejecución del trabajo y
obtener así mejores resultados.

VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

8.1. CONCLUSIONES

Se conoció el fundamento, importancia y aplicaciones de técnicas de tinción de bacterias

en el yogurt como también diferenciar e identificar bacterias según su forma.

Así como también se aprendió la parte teoría sobre la bacteria y las buenas prácticas
en laboratorio.

8.2. RECOMENDACIONES

Después del análisis correspondiente a la prueba de bacterias vistas al microscopio se

obtuvo resultados no tan claros presentando errores al momento de observar.

-Se recomienda una buena limpieza y mantenimiento de los microscopios.

- Se recomienda realizar las tinciones con más precisión y cuidado.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. https://es.slideshare.net/davidjosesanromangutierrez/observacin-de-clulas-
procariotas-en-el-yogurt-44993293
2. https://omicrono.elespanol.com/2016/05/streptococcus-thermophilus-bacteria/
3. https://nootriment.com/es/lactobacillus-bulgaricus-streptococcus-thermophilus/
 X. ANEXOS

Imagen 02: Secado del muestra para la preparación

Imagen 01: Se retira una pequeña cantidad de yogurt,
y aplicar el tipo de tinción
de su envase hacia la lámina portaobjetos.

Imagen 03: vista al microscopio de una bacteria

Gram positiva ( Estreptococcus thermophilus)100X
 10.1. Investiga sobre otros tipos de tinción existentes

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el

laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un
siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran variedad
de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes
infecciosos –en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos.
 La tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de muestras
para análisis bacteriológico. Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m,
lavado con alcohol, Safranina 30 seg)

 Tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy

particulares en el rubro de la parasitología.
 Tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades
crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis,
 Tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los componentes
estructurales de los hongos.
 Tinción Ácido Resistente:
Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con ácido mineral reducido.
En esta tinción las bacterias ácido resistentes conservan el colorante primario color
rosa o rojo, los demás microorganismos son decolorados por el ácido y toman el color
azul.
 Tinción de Giensa:
El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de
protozoos en la sangre para observar materias núcleos de la células.
 Tinción de Esporas:
Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.
 Tinción de Cápsula:
Colorante nigrosuna, aquí se observa microorganismos encapsulados
creando resistencias.
 Tinción de Flagelos:
Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del microorganismo.

Mencionar, seleccionar y fundamentar las bacterias Gram positivas y Gram

negativas que pueden proliferar en los alimentos.

Bacterias Gram positivas que proliferan en alimentos.

 Yogurt
 Lactobacillus bulgaricus
 Streptococcus thermophilus
 Quesos
 Streptococcus lactis
 Matequilla madurada
 Lactobacillus lactis
 Crema acida
 Leuconostoc cremoris
 Yakult
 Lactobasillus casei
 Productos cárnicos cocinados y recalentados
 Clostridium perfringens
Bacterias Gram negativas que proliferan en los alimentos

 Carnes, leche, nata y huevo

  Salmonella spp.
 Leche y carne de aves
 Campylobacter jejuni
 Moluscos crustáceos y peces
 Vidrio Parahaemolyticus
 Carne
 Escherichia coli
 Cerdo, leche
 Yersinia enterocolitica

PRACTICA N° 02:

OBSERVACIÓN DE HONGOS

I. OBJETIVOS

a. Reconocer las diferentes morfologías de los hongos

b. Distinguir algunos hongos ambientales y de alimentos

II. INTRODUCCIÓN
Aunque la mayoría de mohos y levaduras no requieren del hombre para
sobrevivir, salvo raras excepciones como los dermatofitos, ellos han llegado
hasta el hombre accidentalmente y le han causado enfermedades infecciones
superficiales, cutáneas y subcutáneas, como consecuencia de los cambios
ambientales.
Entre los agentes etiológicos encontrados en estas patologías oportunistas son:
cryptococcus, Aspergillosis, penicillum, candida, rhizopus.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO

a. DEFINICIÓN - HONGO

El término hongo (del latin fungus, seta). Incluye organismos unicelulares

y multicelulaes eucarióticos, portadoras de esporas, carentes de clorofila,
heterótrofos fundamentalmente terrestres, aunque algunos son de agua
dulce o marinos.

Muchos son patógenos e infectan a las plantas y animales. Pertenecen al

reino Fungi.

La ciencia que estudia a los hongos es la Micología. Del griego mykos: seta
y logos: tratados

Según la morfología los hongos se clasifican en: levaduras (unicelulares) y

mohos (pluricelulares)

Los hongos tienen una gran importancia económica: las levaduras son las
responsables de la fermentación de la cerveza y el pan, y se da la
 recolección y el cultivo de setas como las trufas. Desde 1940 se han
empleado para producir industrialmente antibióticos, así como enzimas
(especialmente proteasas). Algunas especies son agentes de biocontrol de
plagas. Otras producen micotoxinas, compuestos bioactivos (como los
alcaloides) que son tóxicos para humanos y otros animales. Las
enfermedades fúngicas afectan a humanos, otros animales y plantas; en
estas últimas, afecta a la seguridad alimentaria y al rendimiento de los
cultivos.

b. FORMA.
Los hongos se presentan bajo dos formas principales:

Hongos filamentosos (antiguamente llamados "mohos"). El cuerpo de un

hongo filamentoso tiene dos porciones, una reproductiva y otra
vegetativa.1 La parte vegetativa, que es haploide y generalmente no
presenta coloración, está compuesta por filamentos llamados hifas
(usualmente microscópicas); un conjunto de hifas conforma el micelio
(usualmente visible). A menudo las hifas están divididas por tabiques
llamados septos.

Los hongos levaduriformes —o simplemente levaduras— son siempre

unicelulares, de forma casi esférica. No existen en ellos una distinción
entre cuerpo vegetativo y reproductivo.

c. CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES

 Las levaduras, un grupo de hongos, presentan al menos una fase de

su ciclo vital en forma unicelular; durante ésta, se reproducen por
gemación o bipartición. Se denominan hongos dimórficos a las
especies que alternan una fase unicelular (de levadura) con otra
miceliar (con hifas)
 La pared celular de los hongos se compone de glucanos y quitina; los
primeros se presentan también en plantas, y los segundos, en el
exoesqueleto de artrópodos; esta combinación es única. Además, y a
diferencia de las plantas y oomicetos, las paredes celulares de los
hongos carecen de celulosa.
 La mayoría de los hongos carecen de un sistema eficiente de
transporte a distancia de sustancias (estructuras que en plantas
conforman el xilema y floema). Algunas especies, como Armillaria,
desarrollan rizomorfos, estructuras que guardan una relación funcional
con las raíces de las plantas.
 En cuanto a rutas metabólicas, los hongos poseen algunas vías
biosintéticas comunes a las plantas, como la ruta de síntesis de
terpenos a través del ácido mevalónico y el pirofosfato. No obstante,
las plantas poseen una segunda vía metabólica para la producción de
estos isoprenoides que no se presenta en los hongos. Los metabolitos
 secundarios de los hongos son idénticos o muy semejantes a los
vegetales. La secuencia de aminoácidos de los péptidos que
conforman las enzimas involucradas en estas rutas biosintéticas
difieren no obstante de las de las plantas, sugiriendo un origen y
evolución distintos.
 Carecen de fases móviles, tales como formas flageladas, con la
excepción de los gametos masculinos y las esporas de algunas formas
filogenéticamente “primitivas” (los Chytridiomycota).
 No poseen plasmodesmos.
 La mayoría de los hongos crecen como hifas, estructuras cilíndricas y
filiformes de 2 a 10 micrómetros de diámetro y hasta varios
centímetros de longitud. Las hifas crecen en sus ápices; las hifas
nuevas se forman típicamente por la aparición de nuevos ápices a lo
largo de hifas preexistentes por un proceso llamado de ramificación, o
—en ocasiones— el extremo apical de las hifas se bifurca, dando lugar
a dos hifas con crecimiento paralelo.

Partes de un hongo: (1) Hifa, (2) Conidióforo, (3) Fiálide, (4) Conidia, y (5) Septos.

d. REPRODUCCIÓN

Los hongos se reproducen sobre todo por medio de esporas, las cuales se
dispersan en un estado latente, que se interrumpe solo cuando se hallan
condiciones favorables para su germinación. Cuando estas condiciones se
dan, la espora germina, surgiendo de ella una primera hifa, por cuya
extensión y ramificación se va constituyendo un micelio. La velocidad de
crecimiento de las hifas de un hongo es verdaderamente espectacular: en
un hongo tropical llega hasta los 5 mm por minuto. Se puede decir, sin
exagerar, que incluso es posible ver crecer a algunos hongos en tiempo
real.

Las esporas de los hongos se producen en esporangios, ya sea

asexualmente o como resultado de un proceso de reproducción sexual. En
este último caso la producción de esporas es precedida por la meiosis de
las células, de la cual se originan las esporas mismas. Las esporas
producidas a continuación de la meiosis se denominan meiosporas. Como
la misma especie del hongo es capaz de reproducirse tanto asexual como
sexualmente, las meiosporas tienen una capacidad de resistencia que les
permite sobrevivir en las condiciones más adversas, mientras que las
 esporas producidas asexualmente cumplen sobre todo con el objetivo de
propagar el hongo con la máxima rapidez y extensión posible.

El micelio vegetativo de los hongos, o sea el que no cumple con las

funciones reproductivas, tiene un aspecto muy simple, porque no es más
que un conjunto de hifas dispuestas sin orden. La fantasía creativa de los
hongos se manifiesta solo en la construcción de cuerpos fructíferos, los
cuales, como indica el nombre, sirven para portar los esporangios que
producen las esporas.

IV. MATERIALES Y EQUIPOS

Material biológico: Muestras, Alimentos contaminados con hongos,
levadura de panadería
Material de laboratorio
 Bisturís
 Piseta con agua destilada
 Láminas Portaobjetos
 Láminas Cubreobjeto
 Asa de siembra
 Aceite de inmersión.
 Mechero de alcohol
 Azul de metileno, Azul de lactofenol o hidróxido de potasio al 10%
(KOH)
Equipos:
 Microscopio

V. METODO

OBSERVACION DIRECTA DE LEVADURAS

a. En una lámina porta objetos coloque una gota de azul de metileno,
utilizando el asa redonda
b. Con el asa toque la colonia de levadura, emulsiónela en la gota del
colorante y colóquele una lámina cubre objetos encima
c. Observe la preparación con los objetivos de 10X y 40X

PREPARACIÓN EN FRESCO
a. Colocamos sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no
demasiado grande para evitar que el cubre objetos flote y la preparación
quede demasiado gruesa
b. Realizamos la misma operación en otro portaobjetos que usaremos para
lavar la muestra, esta gota puede ser de agua.
c. Tomamos el material a observar en una mínima cantidad con el asa de
siembra procurando arrancarlo desde la base y lo colocamos con cuidado
sobre la gota de uno de los porta objetos. (lavado para desprender el
exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que
impiden ver lo que realmente interesa, los conidióforos)
 d. Transportamos el material con la asa de siembra a la gota del segundo
portaobjetos que será el definitivo
e. Distribuimos el material homogéneamente sobre la gota de modo que no
quede amontonado
f. Colocamos el cubre objetos poco a poco empezando de un lado, tratando
de que no queden burbujas entre los vidrios
g. Observamos con los diferentes objetivos hasta tener una visión clara de la
muestra.

VI. RESULTADOS.
 VII. DISCUSIONES.
Realizar las anotaciones necesarias como también capturar imágenes
en con ayuda de una cámara fotográfica durante el desarrollo de la
práctica, de esta manera facilitando la elaboración del informe.
Se necesita organizar correctamente los roles de cada integrante del
grupo de práctica para facilitar el desarrollo de acorde con lo establecido
a la ejecución del trabajo y obtener así mejores resultados.

VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

a. CONCLUSIONES

Se conoció el fundamento, importancia y aplicaciones de las diferentes técnicas de

observación de hongos en frutas, levaduras, queso, como también la identificación de
hongos ambientales.

.
b. RECOMENDACIONES
 Se recomienda obtener la muestra sin dañar su estructura para poder
visualizar hongos a más detalle en el microscopio.
 Se debe hacer un aislamiento o un cultivo de hongos en placas Petri de cada
tipo y diferente muestra para obtener óptimos resultados.
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. https://es.slideshare.net/joyzflorez/johanna-florez-mejia-hongos-lab
2. https://es.scribd.com/doc/144716766/laboratorio-3-OBSERVACION-
MICROSCOPICA-DE-HONGOS
 X. ANEXOS

Hifas .Aspergillus(limón)
Geotricum (queso)

Penicillum sp

(Tomate)
 1. ¿Cuáles son las partes que componen la estructura del hongo?

 Píleo.
 Láminas
 Laminillas.
 Anillo.
 Estipe.
 Volva.
 Micelio.

2. ¿Cuál es la principal fuente de contaminación de hongos en

alimentos?
 Temperatura entre 20 y 30 ºC.
 La presencia de oxígeno.
 Estado físico de los alimentos, las semillas o cereales molidos son un sustrato
más favorable porque están desprovistos del tegumento o cáscara externa que
hace de protector.
 Humedad.
3. ¿En qué medios se aíslan los hongos a partir de alimentos?

 A partir de un tejido vegetal.

 A partir de trozos de tejido vegetal.
 Aislamiento directo a partir del signo.
 Uso de cebos.