UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, decana de América

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE GENÉTICA Y
BIOTECNOLOGÍA

Ensayo Cometa en
linfocitos y monocitos humanos de
sangre periférica.
 Horario:
Martes , 1 pm- 5pm (G-2)

 Docente responsable :
Margarita Rosa Eugenia Velásquez Reinoso

 Docentes invitadas :
Dalia Violeta Churampi Mancilla
Eva Andrea Dueñas Villavicencio.

 Curso:
Genética Humana

 Fecha de realización:
Lunes 23 y 30 de Noviembre del 2017

 Fecha de entrega de informe:

Viernes 10 de Noviembre del 2017

 Alumna:
Justino Templadera Sandra Susan 15100115
 Resumen

Desde hace varias décadas el ensayo Cometa, o electroforesis alcalina de células individuales, se
ha convertido en un método establecido para el estudio del daño de ácido desoxirribonucleico,
con múltiples aplicaciones en ensayos de genotoxicidad, estudios de biomonitoreo en humanos,
epidemiologia molecular y ecotoxicología. En la mayoría de estudios, los linfocitos de sangre
periférica son utilizados como modelo celular. Sin embargo, en los últimos años, la aplicación de
esta técnica se ha extendido a las células germinales, con el fin de evaluar la integridad del ADN
espermático así como una herramienta fundamental para investigaciones sobre daño y
reparación del ácido desoxirribonucleico. Asimismo este ensayo se distinguió por su simplicidad,
sensibilidad, versatilidad, rapidez y economía. Es una poderosa técnica que se basa en la
visualización microscópica de las imágenes del ácido desoxirribonucleico después que las células
son embebidas en agarosa, lisadas y sometidas a una electroforesis alcalina. Esta metodología
básica ha sido ampliada, y permite ahora, detectar con alta sensibilidad una gran variedad de
daños del ácido desoxirribonucleico en cualquier tipo de células, pero es importante tener claro
que su especificidad no es absoluta. El objetivo de esta práctica de laboratorio evaluar el daño
celular inducido por agente genotóxico (peróxido de hidrógeno), en linfocitos de sangre
periférica para análisis de las rupturas de simple cadena y sitios abásicos producidos en el DNA
por el agente como criterio de genotoxicidad mediante la electroforesis alcalina de células
individuales mediante el Ensayo Cometa.
 INTRODUCCION

La mayor parte del material hereditario, DNA, se localiza en el núcleo celular como bases
químicas, Adenina, Guanina, Citosina y Timina; el orden y secuencia de estas determina la
información para construir y mantener un organismo. Existen diferentes tipos de daños al DNA
que inducen ciertas lesiones introduciendo desviaciones a su conformación normal de doble
hélice. Un agente genotóxico, es capaz de producir modificaciones de las características
particulares del DNA; el H2O2 es un agente capaz de dar lugar a múltiples reacciones, llegando a
producir un daño celular. El daño celular producido por estos agentes al encontrarse en elevadas
cantidades, ocurre sobre diferentes macromoléculas, tal es el caso de lípidos, proteínas y DNA,
conociéndose a este daño como estrés oxidativo. En el DNA, el estrés oxidativo puede dar lugar
a fenómenos como mutaciones y carcinogénesis. Los linfocitos humanos periféricos representan
una población celular donde el DNA está predominantemente en la etapa pre-sintética del ciclo
celular, fase Go. Los linfocitos humanos poseen un núcleo denso y citoplasma escaso. Se
distinguen dos tipos principales de linfocitos, células T y B. El número total de linfocitos en un
dulto saludable puede ser aproximadamente 500x 109 , y alrededor del 2% (10 x 109 ) están
presentes en la sangre periférica y el resto se ubican en otros tejidos, como en timo, nodos
linfáticos, tejido linfático del intestino, bazo y médula ósea. Para interpretar aberraciones
cromosómicas, es de gran importancia conocer si el grupo de linfocitos periféricos pertenece al
grupo de redistribución; cerca del 80% de los linfocitos (400 x109 ), pertenecen a este y el tiempo
total de recirculación es de cerca de 12 horas. Empleando los linfocitos de sangre periférica
como modelo experimental no solo puede detectarse el daño cromosómico que ha sido
inducido en los linfocitos en la sangre periférica, sino también aquellos que han sido inducidos
en cualquiera de los órganos donde estas células se distribuyen en el cuerpo. Singh y
colaboradores (1988) introdujeron una técnica en microgeles que involucra la electroforesis
alcalina (pH 13) para detectar el daño al DNA en células individuales; se refiere a la migración
del DNA en una matriz de agarosa bajo condiciones de electroforesis, que al ser observada la
célula al microscopio, por fluorescencia o tinción con plata, presenta la apariencia de un cometa,
con una cabeza, región nuclear, y cola, formada por fragmentos nucleares que han migrado en
dirección del ánodo, por lo que es conocido como Ensayo Cometa, debido al patrón de migración
del DNA que se produce.La integridad de nuestro DNA es un aspecto fundamental para la salud
y el buen funcionamiento de nuestro organismo. Sin embargo , sabemos que el material
genético es sucptible a ser dañado por numerosos agentes y/o procesos , asi por ejemplo la
guanina es especialmente suceptible a las especies reactivas de oxigeno producidas durante el
metabolismo normal de la célula(Collins, 1999 ; Halliwell , 2000; Moller y Loft , 2002) .Si se acepta
que el daño en DNA es perjudicial , la prevención del mismo o , en su defecto , el incremento en
la eficiencia de reparación , cabe considerarlos como beneficiosos ; así surge la necesidad de
contar con herramientas sensibles y fiables que nos permitan profundizar en los aspectos
relacionados con la detección de daño en el ADN , así como su protección y reparación y una de
estas herramientas es el ensayo cometa.

El ensayo cometa o electroforesis de una sola célula es una herramienta sensible y confiable,
con un método rápido, de bajo consto y útil para la detección de daño y reparación del ADN en
distintas poblaciones celulares (Di Giorgio et al. 2001, Hwang y Bowen 2007) existiendo tres
tipos de ensayo el cometa alcalino , cometa neutro y el de reparación de DNA .Es una prueba
sencilla y de bajo costo en la que las células de los tejidos blanco no tienen que estar en
proliferación activa ni experimentar fase mitótica (Prieto y Llópiz 1999), permitiendo medir
cualitativa y cuantitativamente el daño al ADN de células individuales de forma no invasiva
(Bajpayee et al. 2005). En la actualidad existen dos versiones del ensayo Cometa: una,
introducida por Sing y colaboradores, y otra, desarrollada por Olive y colaboradores. Las dos
versiones son similares en principio, pero la mayor diferencia está dada en los valores de pH de
la electroforesis. El método de Sing, conocida como electroforesis alcalina porque emplea pH >
13, mientras que el método de Olive, emplea electroforesis con pH de 8,3 y se conoce como
electroforesis neutra. Ambos métodos son capaces de detectar ruptura de doble cadenas de
ADN(DSB) , pero el método alcalino detecta además, ruptura en una cadena de ADN ( SSB) y
sitios álcali-labiles(ALS). Por esta razón el ensayo en condiciones alcalinas es el más usado (Singh
NP et al. 1991).

En el desarrollo de la técnica las células son embebidas en agarosa y colocadas sobre láminas
portaobjetos para ser sometidas a una electroforesis de condición neutral o alcalina, que se
ejecuta posterior a la lisis por acción de altas concentraciones de sales y detergentes (Mudry y
Carballo 2006, Arencibia y Rosario 2009). Las células con mayor frecuencia de rupturas de
cadena doble, rupturas de cadena simple y sitios álcali lábiles muestran una migración
significativa del ADN hacia el ánodo (Fairbairn et al. 1995, Zúñiga 2009).

El fundamento bioquímico básico de la técnica es la migración del ADN en una matriz de agarosa
bajo condiciones de electroforesis, con lo cual las células con daño se visualizan al microscopio
con apariencia de cometas, donde la cabeza la constituye la región nuclear con material genético
intacto y la cola la conforman los fragmentos de ADN en migración, de los que hacen parte
roturas y puntos sensibles al álcali (Cossio et al. 2004, Liao et al. 2009). El largo o extensión de
los cometas, es directamente proporcional al daño inducido sobre el material genético y es
indicador de la sensibilidad de la prueba.

Su sensibilidad supera en más de 100 veces a las pruebas citogenéticas y que permite detectar
roturas de simple cadena y sitios lábiles a los álcalis. Este ensayo puede ser aplicado a cualquier
célula eucariótica y permite el análisis del daño genético al nivel de células individuales.

Dado que esta técnica permite el análisis de diferentes tipos celulares en un mismo individuo,
brinda una información más acabada de los niveles de daño al ADN a diferencia de los estudios
citogenéticos que utilizan casi siempre el linfocito de sangre periférica.
Obtención de resultados :
Al observar las carencias inherentes a cada nuevo método, distintos científicos se dedicaron a
buscar algún sistema más simple . Así, una nueva forma de conteo basada en la clasificación
visual fue recomendada por Collins et al.(1995), método que resulta especialmente útil en
aquellos laboratorios que no cuentan con experiencia previa en el ensayo cometa ya que no
requiere ni de sistemas ni de programas sofisticados . El ojo humano es una herramienta
capacitada para discernir distintos grados de daño , de acuerdo a la apariencia del cometa . El
método consiste en clasificar el nivel de daño en 5 categorías que van de 0 (celulas sin migración
) a 4 (casi todo el DNA en la cola ) , mostrando una muy buena resolución . TCS : Expresádo en
unidades arbitrarias según la fórmula:
Este método , denominado conteo visual , se ha descrito como una aproximación rápida , simple
y que no requiere de costosos sistemas de análisis , por lo que su uso ha sido ampliamente
recomendado y utilizado (Collins et al. 1997c).

En la fase post analítica para la confirmación de los resultados, no existen valores guías, pero se
realiza bajo condiciones de aseguramiento de calidad. En cada ensayo, se emplea un control
negativo y otro positivo, lo que permite analizar la variabilidad de diferentes grados (desde 0-
4).

Ventajas del Ensayo Cometa :

El ensayo cometa o electroforesis de una sola célula provee ciertas ventajas ante otras pruebas
que evalúan el daño genotóxico por efecto.

En este test los datos son colectados a nivel de células individuales, proveyendo información de
la distribución intercelular del daño y de la reparación. Así mismo se requiere sólo pequeños
números de células para ser llevado a cabo y virtualmente cualquier población de células
eucariotas puede ser utilizada en el proceso (Tice et al. 2000, Di Giorgio et al. 2001, Frenzilli et
al. 2009). Por medio de este ensayo es posible evaluar el daño en células no proliferativas, lo
que representa también un gran beneficio sobre otras técnicas que si lo requieren (Prieto y
Llópiz 1999). En la electroforesis de una sola célula además se ha reportado mayor sensibilidad
de detección de daño con respecto a otras pruebas de citogenética clásica. Estudios
comparativos en donde se evalúan los efectos genotóxicos de la radiación por rayos X en
linfocitos humanos, establecen que el daño se incrementa con las dosis de radiación
proporcionadas a la muestra tanto en el test de micronúcleos como en el ensayo cometa, sin
embargo la sensibilidad del ensayo cometa es significativamente superior, puesto que el daño
es detectado incluso a bajas exposiciones (He et al. 2000). El ensayo del cometa alcalino es
considerado también en otros estudios comparativos de carácter farmacéutico para la
evaluación de nuevas drogas, junto con la prueba de aberraciones cromosómicas, mostrando
un alto grado de valor predictivo (Hartmann et al. 2003). A nivel general este test de
genotoxicidad es bastante flexible permitiendo la detección de un amplio rango de daños que
pueden ocasionarse en el ADN y consta de un proceso sencillo y de rápida ejecución, por lo que
es posible la obtención de resultados el mismo día en que se ha tomado la muestra y se ha
realizado el protocolo (Di Giorgio et al. 2001, Hwang y Bowen 2007)

Desventajas del Ensayo Cometa

A pesar de que la técnica ha sido ampliamente empleada y aceptada a nivel mundial, existen
algunas desventajas en su proceso de evaluación.

 La primera de ellas hace referencia al estricto manejo y preparación de los reactivos y el

número de variables que pueden afectar un óptimo desarrollo, pues cualquier
alteración en la concentración de la agarosa, el estado de las distintas soluciones de
trabajo, el pH, la temperatura y los tiempos de cada paso, pueden cambiar
drásticamente el resultado a analizar debido a la alta sensibilidad de la técnica (Zúñiga
2009).
 La segunda desventaja es la imposibilidad de detectar el efecto de agentes aneugénicos
que son agentes químicos que, a nivel molecular, impiden la fijación de las fibras del
huso al cinetocoro , los cuales también son eventos de gran participación en los procesos
carcinogénicos (Mudry y Carballo 2006).
 La tercera desventaja y la más nombrada, hace referencia a la falta de estandarización
en el análisis de las muestras y la representación de los datos que se obtienen en los
estudios, ya que aunque muchos investigadores abarcan el tema, proponen
constantemente nuevas formas de valoración, sin definir un único proceso de
evaluación que permita la comparación entre laboratorios (Zúñiga 2009).

Aplicaciones

Esta técnica es altamente sensible para evidenciar daño genotóxico inducido, identificando
posibles mutágenos y cancerígenos, entre otros aspectos, tanto en estudios in vivo como in vitro
(Ritter y Knebel 2009); ha sido sugerida y aplicada en estudios de cáncer, evaluación de
genotoxicidad ambiental y laboral, estudios de prevención de exposición a productos químicos
y biomonitorización en general (Machado et al. 2009).

Aplicaciones clínicas Biomonitoreo

 El diagnóstico prenatal
 Envejecimiento
 La Susceptibilidad de Cáncer
 El ejercicio
 La terapia de Cáncer
 Mala nutrición
 La diabetes Mellitus
 El ozono
 La artritis de Rheumatoide
 El biomonitoreo ambiental,
 Lupus Erythematosus sistémico
acuático/terrestre.
entre otros
 Materiales y Métodos

Células
1 embebidas en
agarosa sobre
un portaobjetos

2 Lisis

3 Denaturación

4 Electroforesis

5 Neutralización

6 Tinción

Figura . Organigrama de la técnica ensayo cometa

El trabajo se realizó con la intervención de una mujer sana de 20 años de edad , quien no
presenta historia de exposición a genotóxicos, sin contacto cotidiano con químicos, no
fumadores, no expuestos a fármacos por dosis terapéutica, ni evidencia de anomalías genéticas.
Estos criterios de inclusión se manejaron de manera estricta, para mantener la validez interna
del estudio y evitar resultados falsos positivos. La muestra de sangre se realizó por punción
endovenosa en el laboratorio 105 de la Facultad de Ciencias Biológicas (UNMSM) , en tubos con
heparina . Las células evaluadas se obtuvieron por suspensión celular , en la verificación con
Peróxido de Hidrogeno .
El ensayo cometa se desarrolla mediante una serie de pasos o etapas que corresponden a: (1) el
preparado de láminas, en las que las células a evaluar son embebidas en agarosa y colocadas
sobre portaobjetos; (2) la lisis celular por acción de altas concentraciones de sales y detergentes
con los que se degradan las membranas, los residuos de RNA y otras proteínas; (3) la
denaturación del ADN; (4) la electroforesis, que permite la migración del material genético
dañado hacia el ánodo; (5) la neutralización, en la que se eliminan restos de sales presentes en
los geles y se renaturalizan las cadenas de ADN en la cabeza del cometa; (6) la tinción y (7) el
análisis (Mudry y Carballo 2006, Liao et al. 2009, Zúñiga 2009). Ahora bien, el proceso de
estandarización de la técnica se lleva a cabo de manera independiente en cada laboratorio,
estando en la mayoría de ocasiones sujeto a modificaciones del protocolo original por las
condiciones características, así como de los reactivos y materiales que se dispone. El carácter
individual de la estandarización permite al mismo tiempo autonomía a los distintos grupos de
investigación, al momento de introducir variaciones en el manejo del tiempo y empleo de otras
concentraciones en las soluciones de trabajo. Para esta práctica se siguió el siguiente protocolo:
Se extrajo 8ml de sangre periférica en tubos con heparina, seguido de centrifugación a 1000
rpm por 10 minutos , se transfirió con mucho cuidado las 2 fases en un tubo de centrifuga de 15
ml, Adicionando al tubo de centrífuga, un mismo volumen de solución PBS(1x), se coloco , con
mucho cuidado, la mezcla de sangre y PBS(1x), gota a gota por los costados en un nuevo tubo
de centrífuga al que previamente se le adicionó 6 ml de Ficoll hypaque , seguido de una
centrifugación a 2000 rpm durante 20 minutos y se descartó la porción superior del
centrifugado (plasma sanguíneo).

Figura . Capas formadas después de la centrifugación

Se aspiró 2000ul del anillo blanquecino que contiene los linfocitos y monocitos y se colocó en
un nuevo tubo de centrífuga, adicionándose aprox. 8 ml de PBS(1x), al tubo de centrífuga,
seguido a esto se centrifugo por 20 minutos a 4000 rpm. Se descartó el sobrenadante y se
obtuvo un precipitado blanquecino que se re suspendió en 1ml PBS, nuevamente se centrifugo
por 15 minutos, descartándose la fase superior y se resuspendió nuevamente en 1ml de
PBS(1x),.
*Se tomó 100 μl de la suspensión teñido con azul de tripan , es importante conocer la viabilidad
de nuestras células , como la cantidad o concentración de estas , ya que si hay una gran cantidad
no se obtendrá los resultados esperados , se observara células superpuestas , las celulas se
contabilizaron en la cámara de Neubahuer .Aproximadamente se obtuvo 2x105 cel/ml.
 En otro un tubo de centrífuga, se pasó una alícuota de 500 μl de la suspensión de células
y se agregó la dilución de peróxido de hidrógeno H2O2 (300 μM), y se dejo reposar
durante 30 min. (Control positivo).
 En otro tubo de centrífuga, se pasó una alícuota de 500 μl de la suspensión de células y
se agregó 500 μl de agua destilada y se dejo reposar por 30 min. (Control negativo).

En ese lapso se preparan las láminas de la siguiente manera; las láminas previamente lavadas y
secadas se les agrega un volumen de 500 – 1000 μl de agarosa de normal punto de fusión
(ANF)1% , se dejan secar por 20 minutos a 60 °C, transcurridos los 30 min de reposo de los
tubos, se homogenizan y centrifugan a 1000 rpm por 10 minutos, se descarta el sobrenadante y
se agrega 1000 μl de agarosa de bajo punto de fusión (ABF)1%. Rápidamente colocar esta
mezcla goteando 2 veces en las láminas ya preparadas con ANF (tanto del control positivo y
negativo). Colocar inmediatamente un cubreobjetos sobre ambas gotas y dejar enfriar a
refrigeración por 5 min a 4°C . Retirar el cubreobjetos con mucho cuidado, de inmediato agregar
de 75 a 80 μl de ANF y colocar los cubreobjetos, dejar enfriar a refrigeración por 5 min a 4°C .
 Tercera capa de agarosa de
punto de fusión normal

Se retira las láminas de la refrigeradora , luego se retira el cubreobjetos con mucho cuidado.
 Colocar las láminas ya preparadas en un coplin con solución de Lisis durante 24 h (1
semana) (EN OSCURIDAD), la solución lisis contenía NaCl, EDTA, Trisbase , estos
componentes permiten que el núcleo reviente , y el material genético quede expuesto.
 Denaturación. En cuanto al proceso de desenrrollamiento del ADN , se coloca la cámara
de electroforesis horizontal en la mesa y se debe mantener fría con ayuda de hielo
picado ,se vierte el buffer de electroforesis (NaOH 10 N y EDTA 200 mM) con un pH> 13
,en este paso es crucial la temperatura del buffer que no debe ser menor a 15°C, para
esta práctica se utilizó agentes químicos para la denaturación pero este proceso
también se puede realizar con agentes físicos , las láminas portaobjetos se dejan
reposando en la cámara durante 20 min (tiempo de desenrollamiento).
 Electroforesis .Mientras transcurre el tiempo de desenrollamiento , se configuran los
parámetros de la fuente de poder a 25 V, 300 mA y 20 min para la corrida electroforética
, el ADN migrara hacia el ánodo , la resolución de la muestras dependerá asimismo del
% de agarosa empleada y la fuerza iónica.
 Neutralización. Se retiraron las láminas con ayuda de pinzas y se deja secar , se colocaron
las láminas en la charola de lavados y se les agrega solución de Trisma Base 0.4M, pH
7.5 , aproximadamente el volumen completo de una pipeta Pasteur por muestra , se
dejan reposar 5 min y se repite el lavado, se escurren y se sumergen en etanol anhidro
70% por 10 minutos para deshidratar , se escurren y se sumergen en agua destilada para
la hidratación por 10 minutos . Las hebras de ADN separadas anteriormente por medio
de la electroforesis y ubicadas en la cabeza del cometa se renaturan a su super
enrrollamiento, debido a que sus lazos están intactos pero el ADN contenido en la cola
permanece extendido por sus daños.
 Tinción .Se tiñeron con solución de Nitrato de Plata durante 20 minutos los del control
negativo y los de control positivo con Giemsa, la ventajas de utilizar el Giemsa es que la
lámina puede almacenarse indefinidamente , los resultados son más fáciles de analizar
, y es poco toxico , con respecto al nitrato de plata , su principal ventaja es que muy
sensible , poco toxico pero tiene la desventaja que la lámina tiene un corto tiempo de
almacenamiento ,se paraliza la tinción agregándole ácido acético al 1% por 5 minutos ,
finalmente se hizo la lectura al microscopio de los resultados .
 Resultados

Se fotografiaron 5 campos , de una

sola lamina , tanto para el control
positivo como negativo , en términos
generales se debió contabilizar
aproximadamente 2x105 cel/ml si se
sigue el protocolo adecuadamente ,
adicionalmente se puede observar la
viabilidad de células mediante la
tinción con un colorante biológico
(azul de tripan) .

Figura . Conteo de células mononucleares en la

cámara de Neubahuer

Se observa una gran cantidad de células

mononucleares por área, ya que se
obtuvo una gran cantidad de células
mononucleares(Se aspiró 2000ul del
anillo blanquecino que contiene los
linfocitos y monocitos y se colocó en un
nuevo tubo de centrífuga,
adicionándose aprox. 8 ml de PBS(1x)
para la diluirlo )

Figura .Alta concentración de células

mononucleares y una célula no viable

Con esta muestra se trabajó, ya que se

disminuyó la concentración de células
mononucleares , al diluirlo en PBS(1x)
una vez más , en un volumen .

Figura .Baja concentración de células

mononucleares .
 Resultados esperados

Células mononucleares sin

exposición a ningún agente físico ,
químico o biológico como rayos
UV , rayos x , H2O2 , acrilamida ,
entre otros. El nucleo se mantiene
compacto , las células fueron
teñidas con Giemsa .Aumento
1000 x .

Figura . Control negativo

Células mononucleares con exposición a

H2O2 (300uM) por 30 minutos. Se
observan células con diferentes
frecuencias del grado de daño apreciado
en los cometa, siendo el de más
frecuencia el de tipo 3 , donde el tamaño
de la cola sobrepasa el tamaño de la
cabeza , las células fueron teñidas con
Nitrato de Plata .Aumento 1000 x .

Figura . Control positivo

 Resultados obtenidos

Células mononucleares sin exposición a

ningún agente físico , químico o biológico
como rayos UV , rayos x , H2O2 , acrilamida ,
entre otros. En este caso el nucleo no
observa muy compacto , hasta se puede
confundir con núcleos con ADN dañado tipo 1
, esto se debe a varios factores como el
tiempo de exposición en la solución de Lisis ,
el tiempo de denaturación y electroforesis ,
las células fueron teñidas con Giemsa,
.Aumento 1000 x .
Figura . Control negativo

Células mononucleares con exposición a H2O2 (300uM)

por 30 minutos. Se observan células con diferentes
frecuencias del grado de daño apreciado en los cometa,
siendo el de más frecuencia el de tipo 3 , donde el
tamaño de la cola sobrepasa el tamaño de la cabeza , las
células fueron teñidas con Nitrato de Plata , no se
observa una buena resolución .Aumento 1000 x .

Figura . Control positivo

En cuanto a la evaluación de resultados , se realizó la clasificación visual recomendada
por Collins et al.(1995), método que resulta especialmente útil en aquellos laboratorios que no
cuentan con experiencia previa en el ensayo cometa ya que no requiere ni de sistemas ni de
programas sofisticados . El ojo humano es una herramienta capacitada para discernir distintos
grados de daño , de acuerdo a la apariencia del cometa . El método consiste en clasificar el nivel
de daño en 5 categorías que van de 0 (células sin migración ) a 4 (casi todo el DNA en la cola ) .

Células Clasificación

0 -> sin daño

2 -> El tamaño entre la

cabeza y la cola es
proporcional

3-> El tamaño entre la

cabeza es menor que
la cola

*No se puedo realizar un conteo de células, por lo tanto no se pudo aplicar el TCS (Expresado
en unidades arbitrarias según la fórmula) , ya que los núcleos no poseían una buena resolución
y no había fotos de campos totales , para realizar el % de las células de acuerdo a su daño.
Las curvas mostradas en la figura se llevaron a cabo teniendo en cuenta que las dosis de daño
aplicadas a la sangre periférica constituían la variable independiente, que podía hacer variar la
variable dependiente, en la que se evaluaba el efecto causado (daño en los cometas), por la
longitud de cola y el porcentaje de ADN en cola.

Finalmente, después de analizar todos los ensayos de verificación se propuso una escala
cualitativa de daño a partir de los cometas observados en los ensayos hechos, tal y como se
aprecia en la figura .
 Discusión

El ensayo cometa o electroforesis de una sola célula es una herramienta sensible y confiable,
con un método rápido, de bajo consto y útil para la detección de daño y reparación del ADN en
distintas poblaciones celulares (Di Giorgio et al. 2001, Hwang y Bowen 2007), cabe mencionar
que la utilización de muestras de sangre ha sido una herramienta muy eficaz en la evaluación de
la genotoxicidad con H2O2 en esta pratica , empleando principalmente linfocitos aislados ,
además , los linfocitos al estar en circualcion , podemos considerar que su estado celular ,
nuclear y metabolico (incluyendo el DNA) , refleja la exposición global del organismo , los
linfocitos aislados son muy sensibles para el análisis del potencial genotoxico (Elhajouji et
al.,1994; Surralles et al., 1995) . Los linfocitos son parte de la línea linfoide del sistema inmune
y se encuentran en los organos linfoides , en particular los linfocitos de sangre periférica
reprensentan un sistema muy vetajoso ya que son fáciles de obtener , son ciculantes y están en
contacto con las genotoxinas , constituyen una población celular sincrónica , su tasa de
reparación es baja , sin embargo existen algunas desventajas , tales como : A veces los linfocitos
que se estimulan pueden no ser las células diana del agente que se pretende evaluar , presentan
una capacidad metabólica limitada , al no ser una población homogénea , las subpoblaciones de
linfocitos solo difieren en sus funciones , en sus características físicas , tamaño y permeabilidad
de membrana , asimismo en la sensibilidad frente a determinados agentes , tanto físicos como
químicos , esta desventaja es importante y ha de tenerlo presente en los resultados .

Para el aislamiento de células mononucleares se realizó el protocolo convencional con la

obtención de 8ml de sangre periférica por punción endovenosa y heparinizada , la cual es
centrifugada y el sobrenadante es transferido a otro tubo que contenía Ficoll hypaque . La
técnica de Ficoll hypaque es una técnica de centrifugación por gradiente de densidad para
separar células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de otras células de la sangre, se
obtuvo aproximadamente 2000 uL de anillo blanquecino que contiene los linfocitos y
monocitos,la cual fue diluido para obtener una menor concentración de celulas por campo
aprovechando una de las ventajas del ensayo cometa como es la de necesitar pequeños número
de células , y así observar mejores resultados , encontrando células dispersas .

Es importante conocer la viabilidad de nuestras células , en este practica se utilizó un colorante

biológico , el azul tripán , asimismo como la cantidad o concentración de estas , ya que si hay
una gran cantidad no se obtendrá los resultados esperados , se observara células superpuestas
, la cantidad indicada para obtener resultados óptimos es de aproximadamente 2x105 cel/ml
aunque este cantidad también depende de las células con las que se este trabajando , por
ejemplo en caso de queratinocitos, se utilizan aproximadamente 10 000 células en la camara
de neubauer .

Con respecto al tipo de ensayo cometa a realizar , si neutra o alcalina , ¿De que depende? Dos
años más tarde Olive en el año 1990, introdujo otra versión alcalina de este ensayo, con esta
variante se detectan SLA convertidos en RSC. Por lo tanto, en la actualidad existen dos versiones
del ensayo Cometa: una, introducida por Sing y colaboradores, y otra, desarrollada por Olive y
colaboradores. Las dos versiones son similares en principio, pero la mayor diferencia está dada
en los valores de pH de la electroforesis. El método de Sing, conocida como electroforesis
alcalina porque emplea pH > 13, mientras que el método de Olive, emplea electroforesis con pH
de 8,3 y se conoce como electroforesis neutra. Ambos métodos son capaces de detectar ruptura
de doble cadenas de ADN, pero el método alcalino detecta además, sitios alcalinos lábiles y RSC.
Por esta razón el ensayo en condiciones alcalinas es el más usado y es el que utilizamos en esta
practica .

En el preparado de las láminas los protocolos varían entre una y tres capas de agarosa. La
preparación es esencial por dos objetivos principalmente, siendo el primero de ellos brindar un
soporte adecuado a las células a analizar y el segundo lograr la mejor visualización posible sin
ruido que imposibilite el posterior análisis (Zúñiga 2009). Cuando se emplea una única capa de
agarosa la suspensión celular mezclada con el gel se coloca directamente sobre una lámina
portaobjetos limpia y desengrasada. El empleo de una sola capa es una posibilidad poco usada
actualmente, puesto que su uso requiere de mucho cuidado en la manipulación y además es
mayor el trabajo para la visualización de los cometas (Zúñiga 2009).

Lo más común es el uso de tres capas de agarosa a modo de sándwich. En este caso las células
de interés son suspendidas en agarosa de bajo punto de fusión, generalmente a 37°C, y
colocadas entre una primera y tercera capa (Mudry y Carballo 2006, Liao et al. 2009) . La primera
es una capa de agarosa de punto de fusión normal que sirve de base a la capa celular, para
conferirle mejor adherencia (Zúñiga 2009). La última o tercera capa de agarosa es igualmente
de bajo punto de fusión y juega principalmente un papel protector (Zúñiga 2009), aunque en
nuestro caso la tercera capa utilizada fue de normal punto fusión Algunos laboratorios han
eliminado esta tercera capa y han dejado el protocolo con solo dos, puesto que se ha
demostrado que no dificulta el proceso y permite mejores resultados ante otras modificaciones
(Liao et al. 2009). Cada capa debe solidificarse antes de agregar una capa superior (Ritter y
Knebel 2009).

En la capa celular, bien sea la segunda o primera, debe manejarse la concentración de agarosa
y la dilución celular con mucho cuidado. Si la cantidad de células por unidad de área es grande,
el análisis tiende a verse afectado, con mayor efecto en los estudios en los que el daño inducido
es alto y por tanto mayor la migración esperada del ADN, pues en estos casos se visualizará un
solapamiento de colas y es imposible la medición rigurosa del daño causado. Por su parte, la
concentración de agarosa puede dificultar la migración del ADN. Normalmente se sugiere una
mezcla de aproximadamente 10000 hasta 50000 células en 10 µl de suero con 75 µl de agarosa
de bajo punto de fusión, a una concentración final entre 0.5 y 1.5% (Tice y Vásquez 1999). Los
microlitros de muestra y agarosa varían también de acuerdo a sí las células a analizar han pasado
por un cultivo o se adicionan de manera directa sin antes ser estimuladas (Speit et al. 2003,
Bajpayee et al. 2005, Speit y Schütz 2008).

Con respecto a la primera capa de agarosa (punto de fusión normal) 1% , se estableció la

ejecución de un proceso de deshidratación previa a la aplicación de la segunda capa a 60°C por
20 minutos , ya que de no ser así, se manifestaba el fenómeno de desprendimiento de geles, es
posible presumir que entre más delgada sea la primera capa, mayor será la adhesión al
portaobjetos, así como también será mejor la estabilidad proporcionada a la segunda capa del
preparado (Zúñiga 2009). En el caso de la segunda capa de agarosa, lo único importante a
mencionar es que al ser embebidas las células a estudiar, la agarosa de punto de fusión normal
debe mantenerse a 37°C, de lo contrario se comete el error experimental de denaturar por calor
el ADN de las células.

La solución de Lisis está conformada por los diferentes componentes NaCl , EDTA , Trizma base
, DMSO y Tritón , ahora dependiendo de la célula a estudiar es que varían las concentraciones
de estos componentes existiendo una concentración óptima para cada componente y para
cada tipo de célula ,por ejemplo la solución de lisis conformada por Tris HCl pH 8, EDTA 0,5M y
SDS 10%, no es óptima pues con su uso la membrana celular de linfocitos de sangre periférica
ya que la célula no es degradada . Esto posiblemente se debe a que el SDS no es un detergente
tan fuerte como el Tritón X-100, lo cual no garantiza la lisis de los linfocitos(Jiménez y Martínez
2000), que la solucion de lisis no contenga DMSO , también es un error , ya que
fundamentalmente este sirve para limpiar los radicales generados por el hierro liberado de la
hemoglobina (Tice y Vásquez 1999), asimismo según estudios realizados por ( Angela Vergara ,
2010) se e llegó a la conclusión de que el buffer de lisis bajo ninguna circunstancia debe ser
reutilizado, pues este habiéndose utilizado aunque sea solo una vez con anterioridad, genera un
daño agregado en el ADN . Esto puede explicarse potencialmente por el daño oxidativo que
causa en el ADN la liberación de hierro ocasionada durante la lisis de los eritrocitos (Mudry y
Carballo 2006). Este daño no se evidencia en un primer uso del buffer por la acción del DMSO
en su concentración adecuada (10%), sin embargo puede plantearse que para un segundo
evento de uso o posteriores eventos de uso el DMSO no cumple con este fin, debido a que la
concentración de este en la solución ha disminuido o se ha agotado, encontrándose el buffer de
lisis contaminado por radicales oxidantes. El buffer de lisis por un tiempo prolongado, permite
evidenciar los resultados esperados (Figura ) , tal como lo exponen Güerci et al. 2006, Mudry y
Carballo 2006, Sotil et al. 2007 y Zúñiga 2009, se estableció el de 17 horas es un tiempo adecuado
para la lisis de celulas mononucleares , únicamente con el fin de agilizar la consecución de
resultados; pues las medidas cuantitativas evaluadas para lisis de 17 horas y 22 horas, en ambos
casos, tuvieron gran similitud al compararse con los controles trabajados por Henderson et al.
1998, por lo tanto es de esperarse buenos resultados a las 24 hrs que fue lo obtenido (Fig )

El problema de los núcleos del control negativo , se piensa que fue debido al tiempo de
denaturacion , se conoce que el uso de tiempos cortos de reposo alcalino y corrida
electroforética da buenos resultados , ya que estudios realizados con muestras de control
negativo a periodos largos de denaturacion y electroforesis presentaba nucleos concéntricos
mas no compactos como lo observado en la figura ( ) , esto indica que la denaturación ha sido
tal, que se ha afectado negativamente el ADN, ocasionando que posterior a un proceso de
neutralización no se vuelva a condensar el material genético, como es el proceso normal
esperado. Debido a que se comprobó experimentalmente que el tiempo no es un factor que
afecte la corrida electroforética, este se disminuyó con el fin de agilizar la obtención de
resultados, además de evitar la exposición de las láminas a mayor tiempo en el buffer a pH > 13,
al cual se lleva a cabo la descondensación del ADN por efecto de la denaturación.

Por otro lado en el proceso de electroforesis, se fijó para el protocolo final un nivel bajo del
buffer en la cámara electroforética, ya que de lo contrario la corriente se escapa a través del
buffer y no de los geles, evidenciándose en muestras de un control positivo el daño en la
periferia de la cabeza de los cometas y no en la existencia de cola,si a pesar de que la muestra
es control positivo y no se oberva cola esto se atribuye a una electroforesis no óptima.

En la etapa de la neutralización embargo se recomienda aumentar el número de lavados en el

proceso de neutralización, únicamente si se observa mucho background en los controles
negativos .

La electroforesis era llevado a cabo durante los siguientes 20 min a 25 V utilizando una fuente
de alimentación compacta de electroforesis , La cola del cometa se forma debido a que los
fragmentos de ADN que en ella se encuentran son menos pesados que el resto de la cadena de
ADN y por tanto su velocidad de migración hacia el polo positivo es mayor. En nuestros
experimentos, la sangre completa se ha utilizado con éxito y, por lo tanto, elimina la necesidad
de aislamiento de linfocitos. Además, dado que la duración de la migración depende sobre el
porcentaje de agarosa en el gel y sobre la duración de electroforesis, debería ser posible usando
agarosa de mayor porcentaje geles o tiempos electroforéticos más cortos para cuantificar
cantidades mayores de ADN daño en células individuales. Por el contrario, aumentar la duración
de la electroforesis quizás permitiría una evaluación de niveles extremadamente bajos de daño
en el ADN.

Este paso se realiza con el mismo buffer empleado en la denaturación. La electroforesis llevada
a cabo en el ensayo cometa, es diferente a las convencionales, pues en este caso se necesita que
el ADN migre solo una fracción de milímetros, lo que se consigue con la exposición de los
portaobjetos a bajos voltajes por corto tiempo, entre 0,5 – 5 V/cm y 5 – 30 minutos (Mudry y
Carballo 2006, Liao et al. 2009, Zúñiga 2009). Las condiciones óptimas de voltaje y amperaje
dependen generalmente de la migración evidenciada en los controles negativos. Los fragmentos
de ADN inducidos por agentes genotóxicos migran hacia el ánodo (Faust et al. 2004).

El resultado efectivo de la técnica, además de un número de pasos, está mediado por el control
de otros factores como la constitución de la matriz de agarosa, el nivel de pH, la temperatura, el
tiempo de lisis y electroforesis y el voltaje y amperaje con los que se lleva a cabo el ensayo (Tice
et al. 2000, Arencibia y Rosario 2009, Liao et al. 2009). Así pues, la apariencia de los cometas
difiere notablemente por los procesos de lisis y electroforesis empleados (Klaude et al. 1996).

Neutralización Este paso se lleva a cabo para neutralizar los álcalis presentes en el o los geles de
agarosa. Generalmente se realizan tres lavados con buffer Trizma pH 7,5 con duración cada uno
de 5 minutos (Mudry y Carballo 2006, Liao et al. 2009, Zúñiga 2009). Si en los portaobjetos se
evidencia ruido de fondo pueden realizarse mayor número de lavados o ampliar el tiempo de
los mismos. En la neutralización las cadenas de ADN separadas por el tratamiento alcalino en la
cabeza del cometa se renaturalizan, puesto que el material genético está intacto, mientras que
el ADN de la cola permanece como monocaternario (Liao et al. 2009, Zúñiga 2009). Finalizada la
neutralización, los preparados pueden ser teñidos o deshidratados para su análisis inmediato o
posterior respectivamente. Si se decide realizar preparados permanentes, se pasan las láminas
sucesivamente por varios alcoholes, con lo que se logra la deshidratación de los geles (Klaude et
al. 1996).

Tinción La tinción o colorante utilizado es específico para ADN. Los colorantes más empleados
son el Bromuro de Etidio, en algunos estudios también se han empleado técnicas no
fluorescentes como la tinción con nitrato de plata (Cossio et al. 2004).

A la hora de presentar los resultados, es de destacar que tampoco existe un método estadístico
estándar, sin embargo, generalmente los datos son presentados a manera de histogramas de
frecuencia en función de distintas propiedades como: momento de cola, dispersión de la
longitud de la cola, porcentaje de ADN que migra, entre otras (Ejchart y Sadlej 2003, Moller
2006). Otros trabajos sugieren el uso de curvas de calibración para estandarizar los parámetros
que permiten cuantificar el daño evaluado entre laboratorios, teniendo en cuenta las dosis de
daño a las que han sido expuestas las células in vitro y el momento o porcentaje de ADN en cola
(Güerci et al. 2006).
El peróxido de hidrogeno (H2O2) es un compuesto químico conocido ampliamente por su poder
oxidante. En el material genético produce alteraciones que se expresan a manera de rupturas
de cadena sencilla y doble, además de modificaciones de bases sensibles al álcali (Marnett
1987). La inestabilidad que causa el peróxido de hidrógeno en el ADN es generada por la
formación del radical OH (Fairbairn et al. 1995), el cual está considerado como la principal
especie derivada del oxigeno que contribuye a la oxidación endógena a nivel celular.

Aunque la exposición al H2O2 también puede dar origen a reacciones en cadena en donde se
forman diferentes intermediarios reactivos, son las rupturas de cadena sencilla, de cadena doble
y los sitios sensibles al álcali, los puntos de interés por la sensibilidad de la versión alcalina del
ensayo cometa (Cossio et al. 2004). Se escogió el peróxido de hidrogeno para la verificación de
la estandarización llevada a cabo, pues es un compuesto altamente utilizado como control
positivo en estudios de genotoxicidad dentro de los que se encuentra el ensayo cometa (Sotil et
al. 2007, Soler et al. 2008) y además, es bien conocido su efecto en linfocitos humanos,
monocitos, fibroblastos neonatales humanos, hepatocitos, sangre periférica humana y líneas
celulares de mamíferos roedores (Rojas et al. 1999). Por los resultados obtenidos se puede
establecer una medida cualitativa de daño evaluada (Figura ) . En la practica solo se expuso
todas las células a una dosis de (300 uM por 30 minutos ) , pero otras investigaciones emplearon
dosis de 0,249M y 0,499M, donde se aprecia un efecto dosis dependiente, en donde a medida
que se incrementa la concentración varía de forma creciente el daño. Esto permite plantear que
la misma cantidad de ADN, se encuentra más afectada a una concentración más alta, lo que se
evidencia en fragmentos más pequeños que migran más rápido que la cabeza del cometa y por
tanto recorren una mayor longitud hacia el polo positivo, formando la cola. Las concentraciones
de peróxido de hidrogeno aplicadas en este ensayo se tomaron del trabajo realizado por
Henderson et al. (1998), quienes reportan daño, citando medidas como la longitud de cola y el
momento de cola. A diferencia de Henderson et al. (1998), los valores de los momentos de cola
y de las longitud de cola obtenidos en el presente ensayo son más altos. La diferencia entre
evaluar linfocitos de sangre periférica y línea celular de linfoblastos, es que estos últimos tienen
capacidad de división y por lo tanto están activas las enzimas que participan en los mecanismos
de reparación celular (O’Donovan 1995), observándose diferentes niveles de daño en la célula .
En la Figura ( ) se observa dos grados de daño celular a pesar de ser las mismas celulas y estar
expuestas a una misma dosis y tiempo de peróxido , esto particularidad posiblemente se deba a
que los leucocitos de la sangre periférica se encuentran en diferentes tiempos de vida por lo que
es mas probable el daño ocasionado afecte en mayor proporción a las células senescentes o
viejas , que las células más jóvenes (Ramana 1998).
 Conclusiones

Los tiempos establecidos, los reactivos y la forma en la que se llevaron a cabo los procesos de
cada una de las etapas del ensayo cometa, permitieron establecer el desarrollo adecuado de la
técnica para la obtención de resultados verídicos, en los que no se aprecia el efecto negativo de
ninguna de las variables examinadas.

Se evidenció un comportamiento de dosis efecto, con una escala de menor a mayor daño (0-3)
en el siguiente orden dependiendo de las condiciones de fisiológicas de la células , por ejemplo
el tiempo de vida de las células mononucleares , siendo las células senescentes las mas afectadas
. Esta escala de daño está íntimamente ligada a las propiedades intrínsecas de cada agente
genotóxico evaluado.

La estandarización realizada del ensayo cometa se comprobó satisfactoriamente al comparar los

resultados negativos y positivos existente para el agente genotípico H2O2 (300 uM x 30 minutos)

La técnica del ensayo cometa , permite la detección sensible del daño del ADN, así como la
evaluación de la reparación del ADN en células individuales. En las aplicaciones descritas
anteriormente, hemos observado heterogeneidad celular tanto en la respuesta al daño del ADN
(con H202) .

Recomendaciones

 Para posteriores ensayos de genotoxicidad se sugiere realizar pruebas de viabilidad

celular, con el fin de disminuir el error experimental de diagnosticar un resultado falso
positivo por citotoxicidad.
 Todas las soluciones después de realizadas se deben mantener en refrigeración a 4°C,
para procurar la estabilidad de los buffers, al igual que ambas preparaciones de
agarosa. La solución de tinción, tanto stock como de trabajo, fueron la excepción, pues
se mantuvieron a temperatura ambiente y protegidas de la luz.
 Todos los tampones utilizados en este ensayo no deben haber sido preparados con un
tiempo superior a un mes para mejores resultados, de acuerdo con los criterios de
control de calidad.
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