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FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
MAGÍSTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
APROBADO
_______________________________ _______________________________
Carolina Ramírez Higuera M.Sc. Ricardo Piñeros Duque Esp. M.Sc (c)
Directora Asesor
_______________________________ _______________________________
Gustavo Arbeláez Ph.D. Fredy Gamboa Ph.D.
Jurado 1 Jurado 2
_______________________________
Marylin Hidalgo Ph.D.
Jurado 3
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN SIMULTÁNEA Y DISCRIMINACIÓN DEL
Actinobacillus pleuropneumoniae SEROTIPOS 1, 5 Y 7 POR TÉCNICAS DE PCR
MÚLTIPLE BASADAS EN GENES apxIVA Y cps
APROBADO
_______________________________ _______________________________
Dra. Ingrid Schuller García Ph.D. Dr. Manuel Franco Cortés Ph.D.
Decana Académica Director Programa de Posgrados
A la GLORIA de mi vida, alma y corazón
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
estudiantes en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario
al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia”.
AGRADECIMIENTOS
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
2. ESTADO DEL ARTE .......................................................................................... 3
2.1 LA PORCICULTURA EN COLOMBIA ....................................................... 3
2.2 COMPLEJO RESPIRATORIO PORCINO .................................................... 3
2.3 Actinobacillus pleuropneumoniae .................................................................. 4
2.3.1 Características generales ....................................................................... 4
2.3.2 Serotipos ................................................................................................ 6
2.3.3 Genoma.................................................................................................. 7
2.3.4 Factores de virulencia ............................................................................ 7
2.3.4.1 Exotoxinas ............................................................................... 9
2.3.4.2 Polisacáridos capsulares (CPS) ............................................. 10
2.3.4.3 Lipopolisacáridos (LPS) .......................................................... 11
2.3.4.4 Sistemas de captación de hierro ............................................ 12
2.3.4.5 Organelos de superficie ......................................................... 12
2.3.4.6 Quorum sensing..................................................................... 13
2.3.5 Identificación ....................................................................................... 15
2.3.5.1 Bacteriológica........................................................................ 15
2.3.5.2 Inmunológica ......................................................................... 16
2.3.5.3 Molecular .............................................................................. 16
2.4 PLEURONEUMONÍA PORCINA ............................................................... 18
2.4.1 Definición e importancia ..................................................................... 18
vii
2.4.2 Epidemiología...................................................................................... 18
2.4.3 Patogenia ............................................................................................. 20
2.4.4 Patología .............................................................................................. 21
2.4.5 Diagnóstico .......................................................................................... 22
2.4.6 Tratamiento.......................................................................................... 22
2.4.7 Prevención y control ............................................................................ 23
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 25
3.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................. 25
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 25
4. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 27
4.1 EQUIPOS..................................................................................................... 27
4.2 CEPAS BACTERIANAS Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO ..... 27
4.3 ESPECÍMENES CLÍNICOS Y NO CLÍNICOS ..................................... 28
4.4 DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE LAS PCRs MÚLTIPLES .... 30
4.4.1 Análisis bioinformáticos ...................................................................... 30
4.4.2 Iniciadores ........................................... ¡Error! Marcador no definido.
4.4.3 Extracción y preparación del ADN genómico ..................................... 32
4.4.4 Condiciones de las PCRs múltiples ..................................................... 33
4.4.5 Visualización de los productos amplificados ...................................... 33
4.4.6 Especificidad analítica ......................................................................... 34
4.4.7 Sensibilidad analítica ........................................................................... 34
4.4.8 Secuenciación de los productos amplificados ..................................... 34
4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ....................................................................... 35
5. RESULTADOS .................................................................................................. 37
5.1 DESARROLLO Y OPTIMIZACIÓN DE LAS PCRs MÚLTIPLES .... 37
5.1.1 Análisis de oligonucleótidos................................................................ 37
5.1.2 Diseño de iniciadores .......................................................................... 38
5.1.3 Condiciones óptimas de amplificación ................................................ 39
5.2 ESPECIFICIDAD ANALÍTICA ............................................................... 46
5.3 SENSIBILIDAD ANALÍTICA .................................................................. 49
viii
5.4 PROCESAMIENTO BACTERIOLÓGICO DE ESPECÍMENES ........ 52
5.5 PCR A PARTIR DE CULTIVOS PUROS ............................................... 56
5.6 PCR A PARTIR DE ESPECÍMENES ...................................................... 57
5.7 COMPARACIÓN ENTRE PRUEBAS ..................................................... 57
5.8 SECUENCIAS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS ................... 58
6. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 59
7. CONCLUSIONES.............................................................................................. 68
8. RECOMENDACIONES.................................................................................... 70
9. REFERENCIAS ................................................................................................. 72
10. ANEXOS ............................................................................................................. 87
ix
ABREVIATURAS, ACRÓNIMOS, SÍMBOLOS Y UNIDADES
°C Grados Celsuis
% G+C Porcentaje de la relación guaninas/citosinas
10X 10 veces la cantidad de uso
0.5X 0.5 veces la cantidad de uso
A Absorbancia
A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae
ADN Ácido desoxirribonucleico
App Actinobacillus pleuropneumoniae
App1 A. pleuropneumoniae serotipo 1
App5 A. pleuropneumoniae serotipo 5
App7 A. pleuropneumoniae serotipo 7
ATCC Colección de cultivos del tipo americano
c/u Cada uno (a)
Cat. # Catálogo número
CPS Polisacáridos capsulares
CRP Complejo respiratorio porcino
dATP Deoxinucleótido trifosfatado de Adenina
dCTP Deoxinucleótido trifosfatado de Citosina
dGTP Deoxinucleótido trifosfatado de Guanina
dNTPs Deoxinucleótidos trifosfatados
dTTP Deoxinucleótido trifosfatado de Timina
E Especificidad diagnóstica
EBI Instituto bioinformático europeo
F Forward
fg Fentogramos
g Gramos
g Gravedades
h Horas
x
IC95% Intervalo de confianza al 95%
ICA Instituto Colombiano Agropecuario
K Índice Kappa
LNDV Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario
mg Miligramo
min. Minutos
mL Mililitro
mM Milimolar
mPCR PCR múltiple
MgCl2 Cloruro de magnesio
Mpb Mega pares de bases
MWM Marcador de peso molecular
n Total
NAD Dinucleótido adenina-nicotinamida
NCBI Centro nacional de información biotecnológica
ng Nanogramos
nm Nanómetros
nt Nucleótidos
p/v Relación peso/volumen
pb Pares de bases
PFGE Electroforesis en gel de campo pulsado
pg Picogramos
POE Procedimiento operativo estandarizado
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PPLO Organismos del tipo pleuroneumonía
PRRS Síndrome respiratorio y reproductivo porcino
R Reverse
r.p.m Revoluciones por minuto
RTX Repetición en la toxina
S Sensibilidad diagnóstica
xi
seg. Segundos
o
Tm Temperatura de anillaje
TBE Tris-borato EDTA
U/µL Unidades/microlitro
µL Microlitros
µm Micrómetro
µM Micromolar
UV Ultravioleta
V Voltios
v/v Relación volumen/volumen
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 3. Esquema de los operones de las toxinas RTX. (a) ApxI, ApxII, ApxIII, y
(b) ApxIV, en cepas de referencia del A. pleuropneumoniae…………...15
xiii
Figura 12. Resultado por electroforesis en gel de agarosa de la combinación óptima
de iniciadores para la PCR múltiple. (App1) ApToxIVF/R y App1F/R,
(App5) ApToxIVF/R y App5F/R, (App7) ApToxIVF/R y App7F/R, en
presencia de MgCl2 a 2.5 mM…………………………………………..48
Figura 17. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de sensibilidad
analítica de la PCR con ApToxIVF y ApToxIVR………………………53
Figura 18. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de sensibilidad
analítica de la PCR con App1F y App1R……………………………….53
Figura 19. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de sensibilidad
analítica de la PCR con App5F y App5R……………………………….54
Figura 20. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de sensibilidad
analítica de la PCR con App7F y App7R……………………………….54
Figura 21. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de sensibilidad
analítica de la PCR múltiple con ApToxIVF/R y App1F/R…………….55
Figura 22. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de sensibilidad
analítica de la PCR múltiple con ApToxIVF/R y App5F/R…………….55
Figura 23. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de sensibilidad
analítica de la PCR múltiple con ApToxIVF/R y App7F/R…………….56
xiv
ÍNDICE DE TABLAS
xv
ÍNDICE DE ANEXOS
xvi
RESUMEN
xvii
ABSTRACT
xviii
1. INTRODUCCIÓN
1
reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas (Organización Mundial de Sanidad Animal, 2004) a la estandarización de
estos ensayos. Finalmente, se optimizaron los protocolos de detección e identificación
simultánea mediante el uso de los nuevos iniciadores en la misma mezcla reactiva
cuyo resultado se evidenció en la amplificación de un producto de 256 pares de bases
(pb) específico de la especie A. pleuropneumoniae, acompañado de 3 productos de
430, 824 y 629 pb, específicos de los serotipos 1, 5 y 7, respectivamente.
Se utilizaron 22 cepas bacterianas; incluyendo 11 aislados de campo
colombianos, además de 7 cepas diferentes a la especie A. pleuropneumoniae. La
optimización de la temperatura de anillaje (Tom) y la concentración de cloruro de
magnesio (MgCl2), permitió detectar hasta 6 fentogramos (fg) de ADN inicial en la
muestra a partir de cultivos puros. Cuando los protocolos de amplificación molecular
múltiple optimizados se compararon con la técnica de identificación bacteriológica
convencional, se obtuvo una sensibilidad y especificidad diagnóstica del 100% e
índice Kappa de 1, indicando un grado de concordancia “muy bueno” entre las
mismas.
En conclusión, la tipificación es una herramienta útil en la identificación de
serotipos circulantes y estudio de brotes; sin embargo, el conocimiento de cuáles
serotipos son prevalentes en un predio, región o país, depende de metodologías de
alta calidad e interpretación objetiva que suplan las limitaciones de las técnicas del
serotipado tradicional.
2
2. ESTADO DEL ARTE
3
Streptococcus suis, A. pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis y Salmonella
cholerasuis. La enfermedad en campo afecta principalmente a cerdos en crecimiento
y engorde manifestándose de manera variada por su naturaleza polietiológica; aunque
el signo más evidente es la tos, cuya intensidad representa un aspecto muy importante
en el diagnóstico de la infección (Bochev, 2007).
La emergencia y desarrollo del CRP están asociados con la penetración del
virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRS) a las granjas
porcícolas, así como la ocurrencia del Síndrome Multisistémico de Desmedro Post-
destete (PWMS), asociado generalmente al Circovirus porcino (Morozov et al.,
1998).
4
a. b.
c. d.
5
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Pasteurellales
Familia: Pasteurellaceae
Género: Actinobacillus
Especie: A. pleuropneumoniae
2.3.2 Serotipos
6
desarrollo de nuevos inmunógenos como potenciales antígenos vacunales (Apartado
2.4.7).
2.3.3 Genoma
7
Tabla 1. Características bioquímicas del A. pleuropneumoniae biotipo 1 (Killian
et al., 1978)
Indol - Sucrosa +
Ureasa + Trealosa -
Catalasa + Salicina -
Oxidasa - Adonitol -
β-galactosidasa + Dulcitol -
α-fucosidasa - Glicerol -
L-arabinosa - Manitol +
D-ribosa + Sorbitol -
D-xilosa + Inositol -
L-ramnosa - Xilitol -
D-galactosa + Acético
Ácidos finales
Ácido a partir de glucosa + Láctico
D-manosa + Lactosa 1% -
Sorbosa - Lactosa 5% -
8
2.3.4.1 Exotoxinas
9
exterior. Los operones apx son estables en cepas de un serotipo dado por lo que
pueden ser correlacionados con aislamientos bacterianos según su producción
toxigénica inherente (Figura 3). ApxI y ApxIII son determinadas genéticamente por
los operones apxICABD y apxIIICABD; respectivamente (Jansen et al., 1993a,
1993b; Jansen et al., 1994), mientras que ApxII es determinada por apxIICA (Tu et
al., 1994), careciendo de B y D para su secreción, lo que sugiere la complementación
en trans con los productos de los genes toxigénicos acompañantes. En tanto que
ApxIV, es determinada por un solo gen, apxIVA (Schaller et al., 1999).
10
(ORF) de las regiones cps en los serotipos hasta ahora investigados, corresponde a la
descripción de Jessing et al. (2008) (Figura 4), según su organización genética.
11
inmunológica capaz de disminuir las lesiones en la infección neumónica, como se ha
demostrado en modelos murinos (Rioux et al., 1997) y porcinos (Rioux et al., 1998).
12
proteínas de 65 KDa y una identidad del 100% en sus secuencias aminoacídicas N-
terminales con las flagelinas de otros patógenos gram-negativos. Por otro lado, la
presencia de fimbrias tipo IV (Tfp) han sido identificadas por microscopía electrónica
exhibiendo una arquitectura común de proteínas cuyo promotor presenta una
organización genética de 4 genes contiguos; apfABCD (Zhang et al., 2000; Boekema
et al., 2004), similar a la de bacterias relacionadas. La presencias de estos apéndices
extracelulares se relaciona directamente con la adherencia, colonización y
supervivencia del A. pleuropneumoniae en el tracto respiratorio del porcino.
13
Figura 2. Representación gráfica del genoma circular del A. pleuropneumoniae,
aislado JL03. Los círculos están numerados del 1 (círculo externo) al 10 (círculo
interno). Todos los genes están coloreados de acuerdo a su función biológica: oro
para traducción, estructura ribosomal y biogénesis; naranja para procesamiento y
modificación del RNA; naranja claro para transcripción; naranja oscuro para
replicación, recombinación y reparación del ADN; blanco opaco para división celular
y cromosomal; rosado para mecanismos de defensa; tomate para señales de
transducción; pera para biogénesis de envoltura celular y membrana externa; rosado
profundo para tránsito intracelular, secreción y transporte vesicular; verde pálido para
modificaciones post-traduccionales, rotación de proteínas y chaperonas; azul rey para
producción y conversión de energía; azul para metabolismo y transporte de
carbohidratos; azul gandul para metabolismo y transporte de aminoácidos; azul cielo
para metabolismo y transporte de nucleótidos; azul claro para metabolismo de
coenzimas; siena para metabolismo de lípidos; morado para metabolismo y transporte
de iones inorgánicos; aguamarina para biosíntesis, transporte y catabolismo de
metabolitos secundarios; gris para función desconocida (Xu et al., 2008).
14
a. apxI apxII apxIII Serotipos
C A B D C A 1, 5, 9, 11
B D C A C A B D 2, 4, 6, 8
C A C A B D 3
B D C A 7, 12
C A B D 10
b. apxIVA
Figura 3. (a) Esquema de los operones de las toxinas RTX ApxI, ApxII, ApxIII
(Frey et al, 1993; Beck et al., 1994) y (b) ApxIV (adaptado de Schaller et al., 1999)
en cepas de referencia de A. pleuropneumoniae. Las figuras grises representan los
extremos truncados 3’ de apxIA y 5’ de apxIIB.
2.3.5 Identificación
2.3.5.1 Bacteriológica
15
debidamente suplementados con complejos vitamínicos; y en caso de ser necesario,
con algunos agentes inhibidores. Al cabo de 48 horas, las colonias son pequeñas,
redondas y opacas (Holt et al., 1994). El agar sangre es utilizado para observar el
fenómeno del satelitismo en dirección perpendicular a la estría nodriza de alguna
colonia hemolítica; generalmente S. aureus. La caracterización del agente se realiza
mediante reacciones bioquímicas (Tabla 1), resaltando la presencia de fuerte reacción
ureásica y capacidad hemolítica por acción sinérgica de sus toxinas con otra de
estirpe β del S. aureus conocido como efecto CAMP (Frey et al., 1994; Schaller et al.,
1999). Para el aislamiento exitoso del A. pleuropneumoniae, se deben colectar
muestras que contengan lesiones compatibles con la pleuroneumonía porcina, siendo
conservadas refrigeradas en vez de congeladas.
El diagnóstico bacteriológico ha sido bien complementado por el desarrollo de
técnicas moleculares; de las cuales, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
la más utilizada (Apartado 2.3.5.3).
2.3.5.2 Inmunológica
2.3.5.3 Molecular
16
0 1 2 3 4 5 6 7 Kb
Tipo I
cps1A cps1B
Serotipo 1
Tipo II
cps5A cps5B cps5C cps5D
Serotipo 5a
Tipo III
17
serotipo específico de la infección. Sobre estas limitantes, varias técnicas de PCR han
sido desarrolladas para identificar el serotipo específico dependiendo principalmente
de la prevalencia regional y/o reacciones cruzadas inespecíficas entre algunos de
ellos. En la Tabla 2 se presentan las técnicas de PCR múltiple hasta el momento
desarrolladas para la identificación de serotipo, resaltando la ausencia de una prueba
específica para los serotipos 1, 5 y 7, motivo de estudio en este trabajo.
2.4.2 Epidemiología
18
Tabla 2. Técnicas de PCR múltiple desarrolladas para el diagnóstico del A.
pleuropneumoniae.
19
La transmisión de la pleuroneumonía porcina (A. pleuropneumoniae) se
realiza principalmente vía horizontal por contacto directo entre animales infectados y
susceptibles (Velthius et al., 2003). Se difunde rápidamente por aerosoles vía aérea en
cortas distancias, llegando a las piaras a través de la introducción de portadores
infectados (Apartado 2.4.3). Otros factores como el hacinamiento, las condiciones de
manejo y el transporte (ventilación, humedad, higiene, cambios bruscos de
temperatura o de alimentación), repercuten directamente como factores estresantes
facilitando la diseminación del patógeno.
2.4.3 Patogenia
20
considerados la principal fuente de diseminación de la enfermedad y aparición de
brotes (cita de Maas et al., 2006).
2.4.4 Patología
21
2.4.5 Diagnóstico
2.4.6 Tratamiento
22
catiónicos, sugiriendo que un core externo intacto en los LPS es esencial para su
protección contra estos antimicrobianos.
23
Tabla 3. Distribución de serotipos del A. pleuropneumoniae por países (Tomado y
adaptado de Vanden Bergh et al., 2008).
País Serotipos
Alemania 2, 7, 9
Croacia 2, 9
Estados Unidos 1, 5
Francia 9
Hungría 2, 3, 7
Irlanda 3
2 (52,5 %), 1 (36,3 %), 5 (6,2 %),
Japón 7 (1,5 %), 8 (1,5 %), 3 (1,4 %), 12 (0,5 %)
Noruega 2
Países Bajos 2, 9, 11
Polonia 1, 9
Reino Unido 2, 3, 8
Suecia 2
Suiza 2
9 (46,5 %), 2 (18,5 %), 11 (14,2 %),
República Checa 4-5-7-12 (2,4 %)
24
3. OBJETIVOS
25
Comparar las técnicas de amplificación molecular múltiple; enfatizando en la
región especie específica, con el método de identificación bacteriológica
convencional, a partir de cepas de referencia y cepas de campo colombianas.
Realizar un estimado comparativo entre las técnicas de amplificación
molecular y el método de aislamiento bacteriano a partir de especímenes
pulmonares con lesiones aparentes de pleuroneumonía porcina.
26
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 EQUIPOS
Todos los equipos utilizados en este estudio hacen parte de los laboratorios de
microbiología y biología molecular. De propiedad del Instituto Colombiano
Agropecuario (ICA) y ubicados en el Laboratorio Nacional de Diagnóstico
Veterinario (LNDV), sus características y detalles se mencionan a continuación:
27
serotipificados mediante el método de aglutinación rápida en placa (Mittal et al.,
1982). El total de especies bacterianas y sus descripciones respectivas, se listan en la
Tabla 4.
En este estudio no se incluyeron los serotipos 8-15 del A. pleuropneumoniae,
debido a que no estuvieron disponibles durante el transcurso del proyecto.
Para el cultivo, todas las cepas dependientes de NAD se cultivaron sobre
placas estériles con agar base sangre (OXOID, UK. Cat. # CM0271) al 7% (v/v) de
sangre ovina, a las cuales se les imprimió una estría nodriza de S. aureus posterior a
la siembra de las cepas y se incubaron durante 48 horas (h) a 37°C (4.1a) bajo
condiciones de microaerofilia.
Las especies bacterianas diferentes al A. pleuropneumoniae, se cultivaron y
cosecharon siguiendo los protocolos operativos estandarizados (POEs) del LNDV.
28
Tabla 4. Cepas bacterianas de referencia y cepas de campo utilizadas
para la estandarización de las técnicas de PCR.
a
Cepas de referencia. ATCC, American-type Culture Collection.
b
Aislados de campo. LNDV, Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario.
c
Cepas de referencia. NCIMB, National Collection of Industrial Bacteria
* Cepas control positivo para la PCR.
29
Todos los especímenes se mantuvieron bajo condiciones de refrigeración (4-
8°C) hasta su llegada al laboratorio para su procesamiento.
4.4.2 Iniciadores
30
Tabla 5. Secuencias y propiedades de los iniciadores utilizados para la detección e identificación simultánea y
discriminación del A. pleuropneumoniae, serotipos 1, 5 y 7.
% Tamaño del
# Nombre Función Secuencia (5’ → 3’) Longitud Tom Fuente
G+C producto
Este
1 ApToxIVF Forward GAC TGG GGA CGT AAC TCG G 19 60.52 63.13
trabajo
256 pb
Este
2 ApToxIVR Reverse CTC GGC TAA ACC AAA GTT CG 20 59.88 50.00
trabajo
Este
3 App1F Forward TGA TCC AGA TGA TTT TCT TAG CC 23 58.59 39.13
trabajo
430 pb
Este
4 App1R Reverse TTT CTC AGG CTT TTG CCA AG 20 60.49 45.00
trabajo
Este
5 App5F Forward GTA GCC ACA AGA CCC GAA TG 20 60.52 55.00
trabajo
824 pb
Este
6 App5R Reverse TCA AAT GCA GCT TCA AGG AG 20 59.15 45.00
trabajo
Este
7 App7F Forward GGC AGG CAG TAG ATT CTT GG 20 59.84 55.00
trabajo
629 pb
Este
8 App7R Reverse CCC CTG CTG CTC TAA CGT AT 20 59.36 55.00
trabajo
31
Se establecieron las siguientes propiedades como los criterios de selección de
los nuevos iniciadores: longitud, % G+C, tamaño del producto de amplificación,
formación de estructuras secundarias, Tom y especificidad in silico contra bases de
datos no redundantes.
Se estableció la necesidad de diseñar nuevos iniciadores sobre el análisis de
los ya existentes y sus aspectos por mejorar respecto a los requerimientos óptimos
para su uso en las PCRs de tipo múltiple.
32
4.4.4 Condiciones de las PCRs múltiples
33
de imágenes en alta resolución bajo luz ultravioleta (UV) (4.1k) utilizando el
programa Quantity One® para Windows® versión 4.2.1 (BIO-RAD, USA).
34
porcentajes de homología (identidad) cuando se compararon con aquellas reportadas
en las bases de datos públicas usando la herramienta BLAST.
Aislamiento bacteriano
Positivo Negativo Σ
Σ A+C B+D N
35
La sensibilidad (S) y especificidad (E) diagnósticas se calcularon usando las
siguientes fórmulas:
A
S=
AC
D
E=
BD
36
5. RESULTADOS
37
amplificación de 346 a 1.603 pb, un rango de Tom de 57 a 66.7°C y alineamientos
con serotipos diferentes del App contra los cuales fueron diseñados originalmente,
motivo por el cuál se diseñó un nuevo set de iniciadores entre especie-específicos y
serotipo-específicos.
38
Los iniciadores 5 y 6; denominados App5F y App5R, se diseñaron a partir de
la secuencia parcial de los genes cps del A. pleuropneumoniae serotipo 5a (GenBank®
No. AF053723.1), los cuales alinearon en las posiciones 1.641-1.660 [(App5F)
dirección 5’ → 3’] y 2.464-2.445 [(App5R) dirección 5’ → 3’], resultando en un
producto de amplificación de 824 pb (Figura 7). Esta región cps parcial; homóloga a
la región cps dentro del genoma completo del serotipo 5b (GenBank® No.
CP000569.1), se determinó mediante el algoritmo bl2seq, resultando en los
nucleótidos comprendidos entre las posiciones 1.804.208-1.809.296 de la minus
strand.
Los iniciadores 7 y 8; denominados App7F y App7R, se diseñaron a partir de
la secuencia parcial de los genes cps del A. pleuropneumoniae serotipo 7 (GenBank®
No. AY534317.1), los cuales alinearon en las posiciones 4.059-4.078 [(App7F)
dirección 5’ → 3’] y 4.687-4.668 [(App7R) dirección 5’ → 3’], resultando en un
producto de amplificación de 629 pb (Figura 8).
La posición espacial agrupada de los iniciadores serotipo-específicos respecto
a sus regiones blanco de amplificación y al genoma completo del A.
pleuropneumoniae serotipo 5b, se muestra en la Figura 9.
39
CLUSTAL 2.0.12 multiple sequence alignment
ApToxIVF
AF188858.1-apxIVA-App1 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188857.1-apxIVA-App2 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188866.1-apxIVA-App11 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188867.1-apxIVA-App12 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188865.1-apxIVA-App9 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188864.1-apxIVA-App7 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188863.1-apxIVA-App6 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188862.1-apxIVA-App5b ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188861.1-apxIVA-App5a ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188860.1-apxIVA-App4 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188859.1-apxIVA-App3 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACG 50
AF188868.1-apxIVA-App8 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCTGGTGCAGGTAATGATACG 50
AF188869.1-apxIVA-App10 ACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCTGGTGCAGGTAATGATACG 50
******************************* ***** ************
40
ApToxIVR
AF188858.1-apxIVA-App1 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188857.1-apxIVA-App2 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188866.1-apxIVA-App11 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188867.1-apxIVA-App12 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188865.1-apxIVA-App9 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188864.1-apxIVA-App7 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188863.1-apxIVA-App6 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188862.1-apxIVA-App5b GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188861.1-apxIVA-App5a GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188860.1-apxIVA-App4 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188859.1-apxIVA-App3 GATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188868.1-apxIVA-App8 GATATCGACACCTTAAAATTTACCGATATTGGTTTATCCGAACTTTGGTT 250
AF188869.1-apxIVA-App10 GATATCGACACCTTAAAATTTACCGATATTGGTTTATCCGAACTTTGGTT 250
*********************** ****** ******************
ApToxIVR
AF188858.1-apxIVA-App1 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188857.1-apxIVA-App2 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188866.1-apxIVA-App11 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188867.1-apxIVA-App12 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188865.1-apxIVA-App9 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188864.1-apxIVA-App7 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188863.1-apxIVA-App6 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188862.1-apxIVA-App5b TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188861.1-apxIVA-App5a TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188860.1-apxIVA-App4 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188859.1-apxIVA-App3 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188868.1-apxIVA-App8 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
AF188869.1-apxIVA-App10 TAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATA 300
**************************************************
41
CLUSTAL 2.0.12 multiple sequence alignment
App1F
AF518558.1-cps-App1 GTTACCTTTATTGATCCAGATGATTTTCTTAGCCTAAATTATTTCTTAGAAGTAGATAAA 2880
***********************
App1R
AF518558.1-cps-App1 TCTTGGCAAAAGCCTGAGAAATATAAAAACGTACTAGAGTATGGTTTTATTCCAATGTTA 3300
********************
42
CLUSTAL 2.0.12 multiple sequence alignment
App5F
AF053723.1-cps-App5a GAGCTGAATTATTATCTTTAGTAGCCACAAGACCCGAATGGTATAATGAAGATTATCCTA 1680
CP000569.1-cg-App5b GAGCTGAATTATTATCTTTAGTAGCCACAAGACCCGAATGGTATAATGAAGATTATCCTA 1680
************************************************************
App5R
AF053723.1-cps-App5a TATTTAAACAATCTGATTTTATTATTAGTTTAAATTCTCAAGGGCTCCTTGAAGCTGCAT 2460
CP000569.1-cg-App5b TATTTAAACAATCTGATTTTATTATTAGTTTAAATTCTCAAGGGCTCCTTGAAGCTGCAT 2460
************************************************************
App5R
AF053723.1-cps-App5a TTGATGGTATAAAACCTATACAGTTAGGTAATGCTTTTTATGGAAAAAAAGGATTCACGT 2520
CP000569.1-cg-App5b TTGATGGTATAAAACCTATACAGTTAGGTAATGCTTTTTATGGAAAAAAAGGATTCACGT 2520
************************************************************
43
CLUSTAL 2.0.12 multiple sequence alignment
App7F
AY534317.1-cps-App7 GGAACTCGCATTAATTCAAAGTAAACAGGCTAAACTGTGGCAGGCAGTAGATTCTTGGAC 4080
********************
App7R
AY534317.1-cps-App7 TATAGAGAGAAAACAATATACTCCGTATTGGTTCTATCGTTGCGCTTATACGTTAGAGCA 4680
*************
App7R
AY534317.1-cps-App7 GCAGGGGCTATATGAAAGAGCCTCAAAAATGTATTTGAAATTACGTAAAGATCCCTCATT 4740
*******
44
1.804.208
1.805.848
1.805.867
1.806.652
1.806.671
1.809.016
1.809.281
1.809.296
1.809.839
1.810.303
1.811.847
1.811.869
1.812.257
1.812.276
1.813.339
1.813.358
1.813.948
1.813.968
N< >N
App 5b – cg Query
(CP000569.1)
N=2.274.482 pb
1.641
1.660
2.445
2.464
App 5a – cps Subject 824 pb 99%
(AF053723.1) 1 5.090
N=5.090 pb
2.832
2.854
3.242
3.261
App 1 – cps Subject 87% 430 pb
(AF518558.1) 1 1.297 4.798
N=4.798 pb
4.688
4.059
4.078
4.668
App 7 – cps Subject 88% 629 pb
(AY534317.1) 1 559 7.401
N=7.401 pb
Figura 9. Ubicación espacial (bl2seq) de las regiones cps (códigos de acceso al Genbank® en azul) de los serotipos 1, 5a y 7, y
sus porcentajes de identidad respecto a la región cps dentro del genoma completo del A. pleuropneumoniae 5b (del nucleótido
1.804.208 al 1.813.968). Las cajas coloreadas representan regiones homólogas. Las cajas punteadas representan regiones
variables. Las flechas representan la ubicación y dirección de los iniciadores, y las cajas rojas representan su producto de
amplificación. Distancias arbitrarias entre los valores.
45
Para la Tom, se determinó un rango de trabajo de 56 a 59°C y para la
concentración de MgCl2 se realizó una curva con rango entre 1.5 y 2.5 mM. Los
resultados por electroforesis en gel de agarosa evidenciaron la amplificación
consistente de los productos de tamaño esperado, con mejor eficiencia a 2.5 mM de
MgCl2, mientras que las condiciones óptimas en la Tom resultaron estar entre 56.5 y
58.5°C. Sin embargo; aunque la amplificación inespecífica de un producto
acompañante a la región cps del App5 a 58.5°C se minimizó con el aumento de la
Tom a 59°C, ésta resultó en detrimento de la eficiencia de amplificación en los
productos de la misma región (Figuras 10, 11). Con 58.5°C de Tom final y 1.0 mM y
3.0 mM de MgCl2, no se obtuvieron mejores resultados (resultados no publicados).
La concentración de iniciadores se mantuvo desde el principio en 0.4 µM ofreciendo
siempre óptimos resultados.
Los iniciadores fueron analizados posteriormente de modo simultáneo, de tal
manera que cada región serotipo-específica estuviera acompañada por la región
especie-específica. Para el desarrollo de estas mPCR por serotipo, se diseñó un
estudio de concentraciones inversamente proporcionales comenzando con los
iniciadores ApToxIVF/R a 0.4 µM c/u acompañando a cada pareja de iniciadores
App1F/R, App5F/R y App7F/R a 0.1 µM; c/u respectivamente, manteniendo una Tom
de 58.5°C y una concentración de MgCl2 a 2.5 mM. Mientras que la concentración de
iniciadores contra apxIVA fue disminuyendo, la concentración de iniciadores contra
cps fue aumentando; ambos, a intervalos de 0.05 µM. Finalmente, cada pareja de
productos de amplificación de 256 y 430 pb, 256 y 824 pb, y 256 y 629 pb, obtuvo
sus parámetros químicos y térmicos ideales como se evidencia en la Figura 12.
46
apxIVA cps-App1
MWM
500
430 400
300
256 200
cps-App5 cps-App7
MWM
900
800 824
700
600 629
500
47
Los iniciadores 1 y 2 alinearon con los genes apxIVA con el 100% de los
serotipos reportados en la base de datos (App 1-12) (Anexo 2). De igual manera, los
iniciadores 3 y 4; 5 y 6; 7 y 8, alinearon con sus respectivas regiones parciales de
biosíntesis de polisacáridos capsulares (cps) de los serotipos 1, 5 y 7, evidenciándose
una identidad total para los serotipos contra los cuales fueron diseñados, sin
alineamientos cruzados entre ellos (Anexos 3, 4, 5).
El ensayo de especificidad analítica in vitro, se llevó a cabo aplicando las
anteriores condiciones favorables de amplificación molecular (Apartado 5.1.3) a una
colección de 22 cepas de la especie A. pleuropneumoniae, incluyendo cepas de
campo representativos de los serotipos 1 (n = 4), serotipo 5 (n = 5) y serotipo 7 (n =
7), así como 7 cepas bacterianas representativas de especies diferentes al A.
pleuropneumoniae, de las cuales 2 cepas hacen parte de la Familia Pasteurellaceae
(Haemophilus, Pasteurella).
824
629
500
430
256
48
Así, todas las cepas de referencia y cepas de campo colombianas del A.
pleuropneumoniae amplificaron el producto de tamaño esperado (256 pb) (Figura
13), mientras que los serotipos 1, 5 y 7 de la misma, amplificaron los productos de
tamaño esperado (430, 824 y 629, respectivamente) (Figuras 14, 15, 16). En igualdad
de condiciones, la aplicación del mismo protocolo químico y térmico al grupo de
cepas bacterianas diferentes a la especie A. pleuropneumoniae, demostró la
especificidad de la PCR (iniciadores) al no presentar amplificación del producto
especie-específico de tamaño esperado para esta región (256 pb) (resultados no
publicados), mismos resultados que se obtuvieron con la aplicación del protocolo
optimizado de amplificación con los iniciadores serotipo-específicos (resultados no
publicados); destacando igualmente, la falta de amplificación cruzada entre los
primeros 7 serotipos del A. pleuropneumoniae con el uso de estos iniciadores
(Figuras 14, 15, 16). Durante la estandarización de estos ensayos, las 4 parejas de
nuevos iniciadores se cruzaron con ADN porcino proveniente de tejido pulmonar sin
lesiones aparentes de pleuroneumonía porcina (control negativo); criterio establecido
bajo concepto Médico Veterinario de análisis macroscópico del tejido, así como agua
ultrapura utilizada como diluyente de templado de ADN, sometida a las mismas
condiciones de extracción de material nucleico (Apartado 4.4.3) (control negativo de
extracción), en los cuales se evidenció la falta de amplificación molecular de los 4
productos de tamaño esperado.
49
500
300
256 200
Figura 13. Resultado por electroforesis en gel de agarosa del análisis de especificidad
in vitro de los iniciadores ApToxIVF y ApToxIVR e identificación de un fragmento
de amplificación de 256 pb. Carriles 1-7 [Controles positivos (DNA App 1-7
respectivamente)], carriles 8-9 [Controles negativos (Pulmón sano y control de
extracción respectivamente)]. MWW (marcador de peso molecular).
500
400 430
Figura 14. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de especificidad
in vitro de los iniciadores App1F y App1R e identificación de un fragmento de
amplificación de 430 pb. Carriles 1-7 [Controles positivos (DNA App 1-7
respectivamente)], carriles 8-9 [Controles negativos (Pulmón sano y control de
extracción respectivamente)]. MWW (marcador de peso molecular).
50
824 900
800
500
Figura 15. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de especificidad
in vitro de los iniciadores App5F y App5R e identificación de un fragmento de
amplificación de 824 pb. Carriles 1-7 [Controles positivos (DNA App 1-7
respectivamente)], carriles 8-9 [Controles negativos (Pulmón sano y control de
extracción respectivamente)]. MWW (marcador de peso molecular).
700 629
600
500
Figura 16. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de especificidad
in vitro de los iniciadores App7F y App7R e identificación de un fragmento de
amplificación de 629 pb. Carriles 1-7 [Controles positivos (DNA App 1-7
respectivamente)], carriles 8-9 [Controles negativos (Pulmón sano y control de
extracción respectivamente)]. MWW (marcador de peso molecular).
51
Para asegurar la confiabilidad de los resultados, la lectura del material
nucleico se realizó por triplicado (A260) (4.1d); al igual que las corridas
electroforéticas, obteniéndose un nivel de pureza (relación A260/A280) de 1.86 ± 0.1
lo que indicó un nivel óptimo de pureza. Con todos los amplicones estudiados
individualmente, 274 fg de ADN a partir de cultivos puros resultó ser la cantidad
mínima de material nucleico requerido para observar y detectar una banda
representativa del gen apxIVA (Figura 17); mientras que para las regiones parciales
cps, las cantidades mínimas establecidas ser 1.36 pg, 18.8 pg y 640 fg para los
serotipos 1, 5 y 7, respectivamente (Figuras 18, 19, 20). Bajo el contexto de la
mPCR, las cantidades mínimas establecidas para la visualización concomitante de los
productos especie-específicos y serotipo-específicos fueron, 171 fg (apxIVA) y 4.8 ng
(cps) para el App serotipo 1 (Figura 21), 6 fg (apxIVA) y 3.7 pg (cps) para el App
serotipo 5 (Figura 22) y, 640 fg (apxIVA) y 3.2 pg (cps) para el App serotipo 7
(Figura 23).
52
500
300
256
200
Figura 17. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de sensibilidad
de la PCR con ApToxIVF y ApToxIVR. Carril 1 (C+ puro), Carril 2 (1:5), Carril 3
(1:25), Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125), Carril 7 (1:15625), Carril
8 (1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125). MWM (marcador de peso
molecular).
500
400 430
Figura 18. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de sensibilidad
de la PCR con App1F y App1R. Carril 1 (C+ puro), Carril 2 (1:5), Carril 3 (1:25),
Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125), Carril 7 (1:15625), Carril 8
(1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125). MWM (marcador de peso
molecular).
53
900
800 824
500
Figura 19. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de sensibilidad
de la PCR con App5F y App5R. Carril 1 (C+ puro), Carril 2 (1:5), Carril 3 (1:25),
Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125), Carril 7 (1:15625), Carril 8
(1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125). MWM (marcador de peso
molecular).
700
600 629
500
Figura 20. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de sensibilidad
de la PCR con App7F y App7R. Carril 1 (C+ puro), Carril 2 (1:5), Carril 3 (1:25),
Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125), Carril 7 (1:15625), Carril 8
(1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125). MWM (marcador de peso
molecular).
54
MWM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
500
400 430
300
256
200
Figura 21. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de sensibilidad
de la mPCR con ApToxIVF y ApToxIVR y App1F y App1R. Carril 1 (C+ puro),
Carril 2 (1:5), Carril 3 (1:25), Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125),
Carril 7 (1:15625), Carril 8 (1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125).
MWM (marcador de peso molecular).
MWM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
900
800 824
500
300
256
200
Figura 22. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de sensibilidad
de la mPCR con ApToxIVF y ApToxIVR y App5F y App5R. Carril 1 (C+ puro),
Carril 2 (1:5), Carril 3 (1:25), Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125),
Carril 7 (1:15625), Carril 8 (1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125).
MWM (marcador de peso molecular).
55
MWM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
700
600 629
500
300
256
200
Figura 23. Resultado por electroforesis en gel de agarosa, del análisis de sensibilidad
de la mPCR con ApToxIVF y ApToxIVR y App7F y App7R. Carril 1 (C+ puro),
Carril 2 (1:5), Carril 3 (1:25), Carril 4 (1:125), Carril 5 (1:625), Carril 6 (1:3125),
Carril 7 (1:15625), Carril 8 (1:78125), Carril 9 (1:390625), Carril 10 (1:1953125).
MWM (marcador de peso molecular).
56
y como se mencionó anteriormente en el Apartado 5.2 de Especificidad Analítica. Así
mismo, todos los serotipos fueron reasignados al mismo tipo mediante nuestras
técnicas moleculares, al amplificar consistentemente productos de tamaño esperado
para cada uno de ellos; 430, 824 y 629 pb, para los serotipos 1, 5 y 7,
respectivamente.
57
amplificación por las nuevas técnicas de PCR, con el fin de homogeneizar las
condiciones de manipulación, instrumentos y reactivos.
Con un IC 95%, los resultados del diagnóstico por aislamiento bacteriano y
caracterización bioquímica tradicional versus la mPCR, demostraron una sensibilidad
y especificidad diagnósticas del 100%; respectivamente, e índice Kappa de 1, lo que
indicó un grado de acuerdo “muy bueno” entre las dos técnicas según los márgenes
de Landis y Koch (Anexo 7). Con esto se evidenció que las técnicas de mPCR
ofrecen los mismos resultados que la metodología tradicional en la detección de la
especie A. pleuropneumoniae a partir de cultivos puros, con la ventaja que presentan
estas últimas de ser más rápidas y sencillas, además que ofrecen la posibilidad de
identificar concomitantemente el serotipo de la cepa aislada; en este caso particular,
el 1, 5 y/o 7.
En este estudio no se comparó la técnica de serotipificación convencional con
antisueros contra las mPCR, debido a que existe evidencia suficiente sobre los
problemas de reacción cruzada entre algunos de los serotipos del A.
pleuropneumoniae. Sin embargo, es menester continuar con el análisis de
especificidad in vitro con el restante de serotipos del A. pleuropneumoniae que no
pudieron ser incluidos durante el transcurso de esta investigación.
58
6. DISCUSIÓN
59
como patógeno en la producción de casos esporádicos y brotes de pleuroneumonía
porcina.
Aunque hasta la fecha no existe reporte de técnica alguna confiable y capaz de
diferenciar la totalidad de estos serotipos, se han publicado ya protocolos de
amplificación específica para varios de ellos (Tabla 2), sobre la base de su
prevalencia geográfica y/o reacciones cruzadas inespecíficas entre ellos. Por lo tanto,
en este trabajo se presentan 3 protocolos de mPCR que identifican y discriminan los
serotipos 1, 5 y 7; respectivamente, y detectan concomitantemente la especie A.
pleuropneumoniae, con potencial intrínseco de combinado simultáneo triple o
cuádruple a partir de cultivos bacterianos puros.
Los ensayos se optimizaron con cepas de referencia y cepas de campo
colombianas, aprovechando las ventajas de la mPCR en la cual más de una pareja de
cebadores conducen a la amplificación de 2 o más regiones diana de ADN bajo las
mismas condiciones en el proceso de reacción (Markoulatos et al., 2003). Para esto,
se diseñó un nuevo set de iniciadores específicos constituido por 4 parejas, 1 pareja
especie-específica y 3 pareas adicionales serotipo-específicas (Tabla 5). A pesar de
existir oligonucleótidos ya reportadas para la identificación de los serotipos 1, 5 y 7,
debido a sus parámetros altamente variables entre ellos bajo el contexto de la mPCR;
de especial importancia la Tom y el tamaño del producto, no permitían obtener una
combinación óptima para su uso simultáneo, combinados con aquellos específicos
para la detección de especie.
En esta especie; A. pleuropneumoniae, se han descubierto varias estructuras y
productos de patogenicidad, entre ellos los CPS (Bandara et al., 2003) y las
uniformemente denominadas exotoxinas Apx (Frey et al., 1993). Por un lado, la
cápsula es el antígeno primario de serotipo, atributo que hace de sus genes (cps) un
blanco ideal de amplificación para su identificación genotípica serotipo-específica por
PCR; por el otro, la toxina ApxIVA resultó estar presente en todos los serotipos
estudiados de esta bacteria (Schaller et al., 1999), característica que ha sido
aprovechada para detectar molecularmente sus cepas a nivel de especie mediante su
correspondiente gen, apxIVA. Por lo tanto, en este estudio se aprovechó la naturaleza
60
variable y conservada; respectivamente, de estos genes asociados a virulencia para
obtener los 8 iniciadores específicos, soportados con la aplicación de herramientas
computacionales antes, durante y después de su diseño y selección. La utilización de
esta clase de cebadores; específicos contra la región ADN capsular, ha sido
igualmente reportada como un método de genotipificación confiable en otras especies
bacterianas (Kong and Gilbert, 2003; Poyart et al., 2007; Turton et al., 2008),
incluyendo otros patógenos porcinos (Wisselink et al., 2002).
Los iniciadores ApToxIVF y ApToxIVR; específicos de especie, se diseñaron
para producir un fragmento de amplificación de 256 pb a partir de la secuencia
consenso de las porciones 3’ del gen apxIVA. Estos iniciadores aparearon con todas
las regiones en los 12 primeros serotipos del A. pleuropneumoniae hasta ahora
reportados en el GenBank®, las cuales demostraron un 98% de identidad (Figura 5),
correspondiendo a los hallazgos obtenidos por Schaller et al. (1999). Los iniciadores
específicos de serotipo, se diseñaron a partir de las regiones parciales cps de los
serotipos 1, 5 y 7; respectivamente. Al momento de esta investigación se encontraban
reportadas las secuencias nucleotídicas parciales involucradas en la encapsulación de
los serotipos 1 (GenBank® No. AF518558.1, AY496882.1), serotipo 2 (GenBank®
No. AY357726.1), serotipo 3 (GenBank® No. EU010971.1), serotipo 5a (GenBank®
No. AF053723.1), serotipo 6 (GenBank® No. AY534316.1), serotipo 7 (GenBank®
No. AY534317.1), serotipo 8 (GenBank® No. AY356527.1) y serotipo 12 (GenBank®
No. AY496881.1); aunque de diferente tamaño, dificultando el diseño y limitando la
confiabilidad de los iniciadores.
En respuesta a estas limitaciones, dichas regiones se ubicaron espacialmente
respecto al genoma completo del A. pleuropneumoniae serotipo 5b (GenBank® No.
CP000569.1), utilizando la secuencia AF518558.1 para el caso del serotipo 1 debido
a su mayor tamaño y utilidad bioinformática. En la Figura 9 se demuestra la posición
de las 3 secuencias parciales cps de los serotipos 1, 5 y 7, así como las regiones
homólogas (> 87% de identidad). Aunque el serotipo 5 se encuentra dividido en
subtipos a y b; cuya diferencia radica en un residuo de β-D-glucopiranosil en el
serotipo 5b (Altman et al., 1992), sus regiones parciales presentaron un 99% de
61
identidad, probablemente debido a que la región de ADN involucrada en esta
diferencia fenotípica no hacía parte de la secuencia analizada correspondiente al
serotipo 5a.
En contraste, la región parcial cps del serotipo 1 (n = 4.798 nt), evidenció una
identidad del 87% con sus primeros 1.297 nt, mientras que las región parcial cps del
serotipo 7 (n = 7.401 nt) evidenció una identidad del 88% con tan solo sus primeros
559 nt. Sin embargo, estos resultados eran de esperarse ya que; según el trabajo de
Jessing et al. (2008), los serotipos que integran el grupo de organización genética tipo
I (serotipos 1 y 12), tipo II (serotipo 5a) y III (serotipos 2, 6, 7 y 8); de acuerdo a sus
operones, no poseen homología significativa entre sus genes cps y productos
deducidos. Por lo tanto, se aprovecharon las regiones variables para el diseño de los
iniciadores serotipo-específicos.
Los iniciadores App1F y App1R, se diseñaron para producir un fragmento de
amplificación de 430 pb (Figura 6), los iniciadores App5F y App5R para producir un
fragmento de amplificación de 824 pb (Figura 7), mientras que los iniciadores
App7F y App7R para producir un fragmento de amplificación de 629 pb (Figura 8).
Ya que no existen secuencias cps disponibles reportadas para los serotipos 4, 9, 10,
11, 13, 14 y 15, se desconoce aún la probabilidad de alineamiento contra estos
serotipos, como si se conoce su probabilidad in silico contra los demás, prueba de ello
se encuentra evidenciado en los Anexos 2, 3, 4 y 5. Estas tres parejas se combinaron
respectivamente con la pareja especie-específica (ApToxIVF/R) para obtener tres
protocolos de mPCR para la detección (especie) e identificación (serotipo) simultánea
y discriminación de estos patógenos, los serotipos 1, 5 y 7 del A. pleuropneumoniae.
La combinación de iniciadores por serotipo específico, requirió cambios a nivel de
condiciones químicas, en contraste con sus condiciones térmicas, las cuales se
mantuvieron estables. En la Tabla 5, se puede observar como se mantiene una Tom
de 58.7°C ± 1 entre cada uno de los 8 iniciadores, lo que explicaría este
comportamiento aunque inicialmente se presentaron electroforéticamente bandas
inespecíficas inesperadas en los amplificados del serotipo 5 mientras se mantenía el
producto cps correspondiente (Figura 11), inconveniente que se minimizó
62
manipulando los parámetros de Tom y concentración de MgCl2. Con las Tom
establecidas, se comprueba en primera instancia el potencial de combinado
simultáneo triple y cuádruple de estos iniciadores; sustentado en segunda instancia,
en la diferencia promedio de 189 nt entre los productos de amplificación
inmediatamente adyacentes, perfectamente visibles y diferenciables posterior a su
separación electroforética.
Los primeros experimentos se realizaron con cepas de campo colombianas del
A. pleuropneumoniae y posteriormente con cepas de referencia de origen
multigeográfico; como son, App1/cepa 4074 (Argentina), App2/cepa S1536 (Suiza),
App3/cepa S1421 (Suiza), App4/cepa M62 (Estados Unidos), App5a/cepa K17
(Estados Unidos), App6/cepa Femo (Dinamarca) y App7/cepa WF83 (Canadá), lo
que supone una extensión exitosa de estos protocolos en dichos países. Las regiones
apxIVA y cps respectivas, se amplificaron esperadamente a partir de templados
purificados de estos aislamientos puros, por lo tanto, la aplicación exitosa de estos
protocolos de mPCR sobre colonias bacterianas purificadas, proporcionó un método
eficaz para la tipificación de cepas del A. pleuropneumoniae. Todos los aislados de
campo nacionales asignados en su momento como serotipos 1, 5 y 7, fueron
reasignados nuevamente a dichos serotipos por las técnicas moleculares. De igual
manera, la amplificación del gen apxIVA en el 100% de los aislados colombianos
concuerda con los resultados de Cho and Chae (2001), lo que amplía su potencial e
importancia del campo diagnóstico molecular al inmunológico y a la tecnología
vacunal.
La secuenciación constante de estas regiones en aislados de campo permitirá
caracterizar las cepas circulantes y establecer o rechazar relaciones entre ellas;
facilitando así, el conocimiento sobre la fuente u origen de las infecciones en campo y
su expansión geográfica, así como constatar, vigilar y controlar la emergencia de
aquellas nuevas que pudieran escapar a la inmunidad conferida tras la aprobación de
vacunas debido a mutaciones o recombinación genética entre las existentes. En el
trabajo de Bossé et al. (2004), se demostró la capacidad del A. pleuropneumoniae 1 y
5b de usar material genético del donador Knockout serotipo 1 como medio de
63
transformación al desencadenar reemplazamientos alélicos; resaltando así, la
naturaleza competente de los miembros de la Familia Pasteurellaceae por captar
ADN del ambiente (Redfield et al., 2006), importantes resultados sobre el
conocimiento del potencial coinfectante de varios serotipos de este patógeno en el
hospedador (Mittal et al., 1983).
Por otro lado y remitiéndonos específicamente a apxIVA, su estudio y
amplificación por PCR ha resultado ser útil en el estudio e integridad del genoma del
A. pleuropneumoniae (Schaller et al., 2001). Además; comprobada la naturaleza
estricta de su expresión in vivo, estudios complementarios determinaron que la
inserción del elemento ISAp1l previno la detección serológica de ApxIVA
(Tegetmeyer et al., 2008), lo que plantea la posibilidad que cualquier tipo de
inserción en apxIVA podría afectar el desarrollo normal de técnicas moleculares
basadas en este gen. Por lo tanto, con la revisión constante de secuencias reportadas,
se podría dilucidar el comportamiento genético en cepas de campo que pudiera
afectar potencialmente y de manera negativa la capacidad de hibridación de los
cebadores contra apxIVA.
Los análisis de especificidad in silico se complementaron a nivel in vitro con
un grupo de bacterias diferentes al A. pleuropneumoniae (Tabla 4). Todos los
ensayos de PCR fallaron en amplificar las regiones apxIVA y cps en estas especies
(resultados no publicados). Sin embargo, es recomendable ampliar el pool de
especímenes bacterianos para complementar estos análisis de especificidad. Sobre
esto, líneas de evidencia han demostrado que cepas de Actinobacillus genomoespecie
1 y Actinobacillus lignieresii han amplificado productos de tamaño esperado cuando
se han enfrentado a cebadores específicos contra el ADN capsular del A.
pleuropneumoniae (Angen et al., 2008), resultados concordantes si se tiene en cuenta
que A. lignieresii ha sido determinada como más relacionada filogenéticamente al A.
pleuropneumoniae (Borr et al., 1991); tanto así, que la reclasificación taxonómica del
Haemophilus pleuropneumoniae en A. pleuropneumoniae, se sustentó sobre el
estudio de homología ADN-ADN con A. lignieresii (Pohl et al., 1983). A esta altura,
vale la pena acotar también que las hibridaciones inespecíficas en el A. lignieresii de
64
sondas dirigidas contra apxIVA, se han evidenciado hacia su extremo 5’ (Schaller et
al., 2001), lo que comprueba y enfatiza la importancia del extremo 3’ para su
amplificación molecular y determinación especie-específica.
Es un hecho que las técnicas de PCR están complementando el aislamiento de
bacterias en los casos de detección de agentes que resultan difíciles de cultivar.
Debido a esto, se estudió el potencial de amplificación sobre otros especímenes; entre
tejido pulmonar e hisopados, a la vez que el tejido pulmonar con lesiones aparentes
de pleuroneumonía porcina se sometió a aislamiento bacteriano y caracterización
bioquímica para la determinación del A. pleuropneumoniae. Según Williams y col.
(2000), el aislamiento de este patógeno a partir de pulmones tomados en planta de
beneficio es difícil, y en este trabajo no se pudo aislar alguna cepa representativa del
A. pleuropneumoniae; en contraste, se pudo detectar material genético de esta especie
en 18 pulmones y 4 hisopados. Estas diferencias pueden ser interpretadas de manera
general e incipiente como resultado de una baja sensibilidad del cultivo respecto a la
PCR, o como una ventaja inherente de las técnicas moleculares para detectar
microorganismos viables y no viables. Al respecto, son varios los factores que
pudieron influenciar estos resultados, teniendo en cuenta que las muestras de tejido
pulmonar se tomaron de animales sin historia clínica y son considerar además, la
localización y/o extensión de las lesiones como una limitante para su recolección. Por
un lado, es probable que estos animales hubieran sido sometidos a tratamiento
médico antes de su sacrificio permitiendo el rápido aclaramiento de bacterias en los
pulmones, sobre todo si se conoce que el A. pleuropneumoniae es susceptible a un
amplio rango de antibióticos (Aarestrup and Jensen, 1999; Williams y col., 2001;
Chang et al., 2002; Gutiérrez-Martín et al., 2006); por el otro, la escasa articulación y
concordancia entre el éxito del aislamiento bacteriano y el tamaño de la muestra o
localización de la lesión en el pulmón (Mittal et al., 1983; Willson et al., 1987; Frank
et al., 1992; Lo et al., 1998; Durán Reina, 2000; Williams y col., 2000; Hernández-
Castro y col., 2002) hace pensar que estas variables no son individualmente
influyentes a la hora de obtener resultados bacteriológicos positivos, aunque tampoco
se puede dejar a un lado los errores de objetividad al momento de la selección de los
65
especímenes, así como la probabilidad de inhibición en el crecimiento del A.
pleuropneumoniae por la presencia de otras bacterias, como se encontró en esta
investigación (resultados no publicados).
Como hallazgo relevante, se encontró que en tan solo una de las muestras que
amplificaron positivamente la región apxIVA (256 pb), se amplificó alternamente un
producto cps de tamaño esperado para el serotipo 5 (825 pb), sugiriendo la
circulación de otros serotipos diferentes a los reportados por Durán Reina (2000),
probablemente algunos de los encontrados en un principio como son el 2 y el 4 (cita
de Durán Reina, 2000). Cabe anotar que; aunque esta investigación carece de
connotación epidemiológica, la naturaleza específica de la toxina ApxIV en el A.
pleuropneumoniae y la inequívoca amplificación de su determinante genético
(apxIVA) por nuestras PCR, podrían sustentar esta teoría, además de la diferencia
entre la cantidad de fuentes de tejido pulmonar utilizada en este trabajo (n = 1) en
comparación con las utilizadas por Durán Reina (2000) (n = 2), lo que implicaría una
desventaja epidemiológica respecto a las regiones geográficas y predios de los que
provenían los animales. La detección de ADN de este patógeno a partir de hisopados
también resulta ser clave a la hora de detectar animales portadores asintomáticos y
evitar así, la diseminación de la enfermedad en el hato hacia otras regiones. Esto es
particularmente importante con relación a los programas de control de enfermedades,
si bien se conoce que a Colombia entran porcinos desde países con prevalencia
reportada de otros serotipos, tales como Venezuela, Canadá, Estados Unidos y
Bélgica, situación que podría desencadenar la aparición de nuevos serotipos.
En cuanto a la sensibilidad de las técnicas, las cantidades mínimas de material
genético detectables fueron similares en sus dos versiones (convencional y múltiple),
aunque con una diferencia a favor de la mPCR para el serotipo 5 y otra en contra de
la mPCR para el serotipo 1, pudiendo esta última ser objeto de pruebas de
reestandarización para optimizar su rendimiento y adaptarse a las necesidades del
laboratorio de diagnóstico. Sin embrago, estos valores se presentan en general como
superiores cuando se compararon con protocolos previamente reportados (Gram and
Ahrens, 1998; Zhou et al., 2008).
66
El uso de iniciadores dirigidos contra regiones específicas de ADN capsular es
la metodología más prominente con potencial de uso en la tipificación del A.
pleuropneumoniae. Si se llegasen a utilizar todos los cebadores serotipo-específicos
actualmente existentes, se podrían identificar los serotipos 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 y 12, y;
una vez sean determinadas y publicadas las secuencias nucleotídicas específicas de
las regiones capsulares de los serotipos restantes, las técnicas podrían ser expandidas
a éstos. Además, estas secuencias podrían ayudar a dilucidar la naturaleza de las
reacciones cruzadas encontradas entre algunos de ellos como se mencionó
anteriormente.
En conclusión, en este trabajo se presentan varios protocolos de PCR que
podrían ser de gran utilidad e importancia en la detección e identificación de aislados
del A. pleuropneumoniae, especialmente en países donde los serotipos 1, 5 y 7 son
prevalentes. La capacidad de discriminación entre los mismos, así como de la especie
con otros patógenos bacterianos, sería ventajosa para entender la naturaleza
(epidemiología) y biología (virulencia) de la pleuroneumonía porcina. Su efectividad,
especificidad, sensibilidad, versatilidad, potencial multiplexado y expansión a
especímenes biológicos (clínicos y no clínicos), sustentarían su implementación en el
laboratorio de diagnóstico veterinario. Complementariamente, la metodología de
extracción y purificación de material nucleico utilizado en este estudio, podría
facilitar el procesamiento de los aislados en una sola jornada de trabajo, lo que
permitiría agilizar la entrega oportuna de los resultados.
67
7. CONCLUSIONES
Las cantidades mínimas detectables por las nuevas técnicas, resultaron ser similares
en sus dos versiones optimizadas (convencionales y múltiples), incluso superiores a
algunos protocolos previamente reportados.
68
hisopados para la región apxIVA, y 1/15 (6.6%) a partir de hisopados para la región
cps-App5.
69
8. RECOMENDACIONES
Completar los ensayos de especificidad (de serotipo) incluyendo los serotipos del A.
pleuropneumoniae que no se utilizaron en estas pruebas (serotipos 8-15),
inmediatamente estén disponibles y al alcance de los investigadores subsiguientes.
70
pleuropneumoniae, compararlas entre ellas y con aquellas de referencia internacional
en la búsqueda de mutaciones que pudieran llegar a afectar el desarrollo de las PCR,
específicamente el anillamiento de los primers o brindar información epidemiológica
valiosa.
71
9. REFERENCIAS
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86
10. ANEXOS
Anexo 1
Buffer TBE 10X (1 litro)
AF188865.1 Actinobacillus pleuropneumoniae strain CVI13261 ApxIVA 37.4 72.9 35% 10 100%
Max Total Query E Max
Accession Description
score score coverage value ident
(apxIVA) gene, partial cds
XM_001891095.1 Laccaria bicolor S238N-H82 hypothetical protein partial mRNA 30.1 30.1 14% 1556 100%
XM_001888134.1 Laccaria bicolor S238N-H82 hypothetical protein partial mRNA 30.1 30.1 14% 1556 100%
XM_001887589.1 Laccaria bicolor S238N-H82 hypothetical protein partial mRNA 30.1 30.1 14% 1556 100%
XM_001884822.1 Laccaria bicolor S238N-H82 hypothetical protein partial mRNA 30.1 30.1 14% 1556 100%
Anexo 3
Especificidad in silico (BLAST) de los iniciadores 3 y 4 contra bases de datos no
redundantes
AC007071.7 Arabidopsis thaliana chromosome 2 clone T9H9 map nga361, 35.6 86.8 18% 38 100%
Max Total Query E Max
Accession Description
score score coverage value ident
complete sequence
EF131321.1 Sus scrofa clone KVL1617 microsatellite sequence 33.7 33.7 15% 133 100%
AC190034.5 Rhesus Macaque BAC CH250-532C21 () complete sequence 33.7 33.7 20% 133 91%
NM_072774.4 Caenorhabditis elegans F52E1.13b (F52E1.13) partial mRNA 33.7 33.7 15% 133 100%
AC108022.3 Homo sapiens BAC clone RP11-9D8 from 4, complete sequence 33.7 33.7 15% 133 100%
U41109.3 Caenorhabditis elegans cosmid F52E1, complete sequence 33.7 33.7 15% 133 100%
CP000931.1 Shewanella halifaxensis HAW-EB4, complete genome 31.9 185 34% 463 100%
CP000903.1 Bacillus weihenstephanensis KBAB4, complete genome 31.9 259 19% 463 100%
CP000813.1 Bacillus pumilus SAFR-032, complete genome 31.9 316 37% 463 100%
CP000826.1 Serratia proteamaculans 568, complete genome 31.9 387 35% 463 100%
EF089399.1 Uncultured marine bacterium EB0_39H12 genomic sequence 31.9 60.3 30% 463 100%
Anexo 4
Especificidad in silico (BLAST) de los iniciadores 5 y 6 contra bases de datos no
redundantes
CP000569.1 Actinobacillus pleuropneumoniae L20 serotype 5b complete genome 37.4 99.4 35% 10 100%
AC097494.3 Homo sapiens BAC clone RP11-273B19 from 4, complete sequence 33.7 33.7 16% 128 100%
AC004014.2 Homo sapiens BAC clone CTB-22K14 from 7, complete sequence 31.9 31.9 15% 446 100%
Z81143.1 Caenorhabditis elegans Cosmid ZK265, complete sequence 31.9 31.9 15% 446 100%
Anexo 5
Especificidad in silico (BLAST) de los iniciadores 7 y 8 contra bases de datos no
redundantes
XM_001162212.1 PREDICTED: Pan troglodytes similar to C19orf46 protein, 31.9 31.9 15% 446 100%
Max Total Query E Max
Accession Description
score score coverage value ident
transcript variant 2 (LOC746096), mRNA
CP000383.1 Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406, complete genome 31.9 31.9 15% 446 100%
CP000683.1 Rickettsia massiliae MTU5, complete genome 30.1 54.9 25% 1557 100%
CP000821.1 Shewanella sediminis HAW-EB3, complete genome 30.1 79.6 15% 1557 100%
AP009044.1 Corynebacterium glutamicum R DNA, complete genome 30.1 54.9 25% 1557 100%