CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS

Las proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células. Son estructuras
formadas por una o más cadenas polipeptídicas. El número de permutaciones y combinaciones
que se pueden obtener a partir de los 20 aminoácidos es enorme y por esto el número posible de
proteínas es realmente muy grande.

Las proteínas, presentes en los organismos vivos, cumplen diferentes funciones. Actúan
como transportadoras de vitaminas, oxígeno y bióxido de carbono. Actúan también como enzimas,
hormonas, anticuerpos, moléculas de almacenaje, unidades estructurales, fuentes de energía, etc.

Uno de los trabajos más laboriosos e interesantes del Bioquímico es la purificación de

proteínas para su caracterización y cuantificación posterior.

I. PRECIPITACION DE PROTEINAS
Las proteínas son coloides liofílico (en particular, hidrofílicos); se hallan estabilizadas por
ambas cargas y por interacciones proteína-solvente. Cuando una de estas influencias
estabilizadoras es removida, la proteína precipita algunas veces; cuando ambas de estas
influencias son eliminadas, la proteína siempre precipita.

1.1. Precipitación en el Punto Isoeléctrico. Las proteínas, como los aminoácidos, son menos
solubles en su punto isoeléctrico. Algunas proteínas, por ejm. caseína, son precipitadas ajustando
el pH de la solución al punto isoeléctrico de la proteína.

1.2. Precipitación por Sales. La adición de una sal neutra causa la precipitación de las proteínas.
Las diferentes proteínas son precipitadas a diferentes concentraciones de sal. Esto ocurre más
fácilmente en el punto isoeléctrico d ela proteína. El efecto de la sal es eliminar el agua de
solvatación, lo cual disminuye la interacción proteína-agua y aumenta la interacciín proteína-
proteína, causando así la precipitación. La sal comúnmente usada para este tratamiento es el
sulfato de amonio, pues es extremadamente soluble.

1.3. Precipitación por Solventes Orgánicos. La adición de ciertos solventes orgánicos , como
etanol y acetona, precipitan las proteínas, y otra vez la precipitación ocurre más fácilmente en el
punto isoeléctrico de la proteína. Los solventes orgánicos también eliminan agua, así disminuyen
la interacción proteína-agua. Este procedimiento debe ser llevado a cabo a 0°C, de otro modo
puede ocurrir desnaturalización.

1.4. Precipitación por Aniones Complejos. Los ácidos como tricloroacético, sulfosalicílico,
pícrico, tánico, tungstico, fosfomolibdico, etc. precipitan proteínas. La precipitación probablemente
se debe a la neutralización de la carga positiva de la proteína por el anión libre. Este tipo de
precipitación causa muchas veces desnaturalización debido al pH extremo al que se le lleva a la
proteína.

1.5. Precipitación por Metales Pesados. Los cationes de metales pesados como mercurio,
plomo, cobre, plata, oro, platino, etc., precipitan las proteínas en condiciones alcalinas. El catón
libre disminuye la carga negativa de la proteína, causando así la precipitación. Estos iones
algunas veces desnaturalizan las proteínas porque reaccionan con los grupos SH para formar
sulfuros.

II. DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINAS

Las proteínas nativas son altamente ordenadas, son moléculas complejas. Cualquier fuerza
que altere la estructura tridimensional de la molécula sin que haya ruptura del enlace peptídico
causa desnaturalización. Las proteínas desnaturalizadas tienen propiedades diferentes a las
proteínas nativas y ellas ya no poseen actividad fisiológica. Además, la desnaturalización
disminuye la solubilidad de las proteínas en agua, porque el arreglo de los grupos hidrofílicos,
orientados hacia la superficie, está destruido. Son comunes agentes desnaturalizantes, el calor,
pH extremo, oxidación y reducción los cuales afectan el enlace disulfuro, agitación, radiación y
urea. Las proteínas presentan diferentes susceptibilidades para cada agente desnaturalizante. La
desnaturalización puede ser un proceso reversible. Algunas veces, cuando se remueve el agente,
como en el caso de la úrea, a proteína nativa es restaurada.

PARTE EXPERIMENTAL

EXPERIMENTO N° 1. DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO Y SOLUBILIDAD DE LA

CASEINA.

FUNDAMENTO
El punto isoeléctrico (pI) es la concentración de iones hidrógeno a la que la proteína es
eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total de
cargas negativas de la proteína. En este punto, algunas proteínas son muy insolubles y precipitan,
pero otras permanecen en solución (ovoalbúmina, gelatina). En este punto la carga neta de todos
los grupos disociables, como carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc., es igual a cero. La
superficie de la proteína siempre posee una carga eléctrica que depende del pH, de los electrolitos
presentes y del solvente, en particular del agua, y de los puentes hidrógenos; pero existe un
conjunto de condiciones, basado en las relaciones de todos estos factores, para el cual la suma
de las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas. En este momento el número de
moléculas de proteína que tienen una carga neta positiva o negativa es mínimo o nulo.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 N
Acido acético 1 N
Acido acético 0.1 N
Acido acético 0.01 N
NaOH al 10%

METODO DE TRABAJO
Preparar el siguiente sistema de tubos:

Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ac. Acético 0.01 N 0.62 1.25 - - - - - - -
Ac. Acético 0.1 N - - 0.25 0.5 1.0 - - - -
Ac. Acético 1.0 N - - - - - 2.0 4.0 8.0 1.6
Agua destilada 8.38 7.75 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
Caseína 0.5% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Agitar los tubos antes y después de agregar la caseína. Haga el cálculo del pH teórico para
cada uno de los tubos y si fuera posible determine el pH de cada tubo en un pHmetro. Con los
resultados construya una gráfica. Además anote la presencia o falta de turbidez de 0 a ++++,
según corresponda para cada tubo. Determinar con la mayor precisión el tubo que presenta el
máximo de precipitación, lo cual se producirá en el tubo que tiene un pH próximo al punto
isoeléctrico y al de solubilidad mínima de la caseína. Observar a los 10 minutos y 30 minutos,
anote los cambios.

Seguidamente calentar los tubos en baño maría y apreciar el resultado. Anote sus
apreciaciones. Agregar NaOH al 10% gota a gota y observe. Anote los resultados.
 Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH
Turbidez inmediata
Turbidez a los 10 min
Precipitado
NaOH 0.1 N

Explique sus resultados

EXPERIMENTO N° 2. DESNATURALIZACION DE PROTEINAS

FUNDAMENTO
Una proteína está en su estado nativo cuando existe en su forma natural dentro de las
células. El aislamiento de proteínas tiene por objeto no alterar este estado nativo y si este se
altera se dice que a proteína se ha desnaturalizado. La desnaturalización proteica se debe a la
ruptura de los enlaces secundarios, como puentes de hidrógeno y enlaces de tipo iónico, lo que
hace que la estructura globular de la proteína se altere desenrollándose la molécula, ocurriendo la
precipitación. En el estado desnaturalizado, las proteínas se vuelven menos solubles. Esta
solubilidad puede ser restablecida por acción de álcalis o bases.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de albúmina da huevo al 1%
Acido acético
Acido clorhídrico
Nitrato de plata
Nitrato de potasio

METODO DE TRABAJO
a) Desnaturalización de las proteínas por acción del pH:
Se toman 3 tubos de ensayo y se les agrega 2 ml de solución de albúmina de huevo a cada uno
de ellos. Al tubo número 1 agregue 10 gotas de HCl concentrado y observe, al número 2
agregue 10 gotas de ácido acético glacial y observe, al tubo número 3 agregue 10 gotas de
agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo. Anote y analice los
resultados obtenidos.

Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina + HCl
2 Albúmina + CH3COOH
3 Albúmina + Agua destilada

Anote sus conclusiones

b) Desnaturalización de las proteínas por acción de los metales pesados:
Se toman 3 tubos de ensayo y se les agrega 2 ml de solución de albúmina de huevo a cada uno
de ellos. Al tubo número 1 agregue 10 gotas de nitrato de plata y observe, al número 2 agregue
10 gotas de nitrato de potasio y observe, al tubo número 3 agregue 10 gotas de agua destilada
como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo. Anote y analice los resultados
obtenidos.

Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina + Nitrato de plata
2 Albúmina + Nitrato de potasio
3 Albúmina + Agua destilada

Anote sus conclusiones

c) Desnaturalización de las proteínas por acción de la temperatura:

Se toman 1 tubo de ensayo y se le agrega 2 ml de solución de albúmina de huevo. Lleve el tubo
al calor y observe. Luego realice la prueba de Biuret. Anote y analice los resultados obtenidos.

Tubo Observación Prueba de Biuret

1 Albúmina + Calor

Anote sus conclusiones

EXPERIMENTO N° 3. PRECIPITACION POR SALES DE METALES PESADOS Y IONES

NEGATIVOS.

FUNDAMENTO
Las proteínas pueden ser precipitadas de la solución en donde se hallen, con una variedad
de iones positivos o negativos.

Los iones positivos comúnmente usados son aquellos de metales pesados, tales como el
zinc, cadmio, mercurio, fierro, cobre y plomo. Estos iones precipitan las proteínas de soluciones
alcalinas, porque este pH la proteína está disociada como proteína - (anión), la cual se combina
con los iones metálicos positivos para dar un precipitado insoluble de proteinato de metal. Estos
iones metálicos pueden ser removidos del proteinato de metal por acidificación, lo cual convierte a
la proteína negativa en proteína positiva.

Los iones negativos (aniones) se combinan con las proteínas cuando ellas están bajo la
forma de proteínas positivas, formando sales de proteínas. Varias de estas sales son insolubles y
son la base de los métodos de desproteinización. Entre los más comúnmente usados se
encuentran: ácido tungstico, ácido fosfotungstico, ácido tricloroacético, ácido pícrico, ácido tánico,
ácido ferrociánico, ácido sulfosalicílico.

MATERIAL
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de caseína al 0.5%
Solución de albúmina da huevo al 1%
Cloruro de mercurio al 5%
 Acetato de plomo al 10%
Acido acético al 5%
Ferrocianuro de potasio al 10%
Ac. Tricloroacético al 10%

METODO DE TRABAJO
Preparar el siguiente sistema de tubos:

TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Caseina 0.5% 2.0 2.0 - - 2.0 2.0 - - 2.0 -
Ovoalmúmina 1% - - 2.0 2.0 - - 2.0 2.0 - 2.0
Cloruro de mercurio 5% 0.5 - 0.5 - - - - - - -
Acetato de plomo 10% - 0.5 - 0.5 - - - - - -
Ferrocianuro de potasio 10% - - - - 0.5 - 0.5 - - -
Ac. Acético 5% - - - - - 0.5 - 0.5 - -
Ac. Tricloroacético 10% - - - - - - - - 0.5 0.5

Anote los resultados en la tabla. Luego a los tubo 5, 6, 7 y 8 agregue NaOH 10% gota a
gota y observe los resultados.

Caseina Ovoalmúmina NaOH

Cloruro de mercurio
Acetato de plomo
Ferrocianuro de potasio
Ac. Acético
Ac. Tricloroacético

Anote sus conclusiones

EXPERIMENTO N° 5. ESTIMACION CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE PROTEINAS.

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE
BIURET

FUNDAMENTO
Este método colorimétrico está basado en la formación de un complejo tetraédrico de color
púrpura que se produce entre las sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos y el
cobre divalente (Cu++) en solución alcalina.

MATERIALES
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Fotocolorímetro o Espectrofotómetro
Estándar de proteínas (Sero Albúmina de Bovino) 10 mg/ml en NaOH 1 N
NaOH 1 N
Reactivo de Biuret: Disolver 1.5 g de sulfato de cobre y 6 g de Tartrato de sodio y potasio en
500 ml de agua destilada. Añadir agitando constantemente 300 ml de NaOH al 10%.
Completar a 1000 ml con agua destilada
PROCEDIMENTO
a) Determinación cualitativa de proteínas. Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solución
a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 2 ml del reactivo de Biuret. Se mezcla y se
deja en reposo 30 minutos a 37 °C. Si la prueba es positiva se desarrollará un color violeta.

b) Curva Estándar para proteínas. A una cantidad de proteína en un rango comprendido entre 2
a 10 mg se le adiciona NaOH para obtener un volumen final de 1.0 ml. Luego se le agrega 4.0
ml del reactivo de Biuret. Se mezcla y se deja en reposo 30 minutos a 37 °C. Transcurrido este
tiempo se lee en el fotocolorímetro frente a un blanco apropiado (1.0 ml de NaOH más 4.0 ml
de Biuret). Anote sus resultados. Determinar el factor de calibración.

[Proteína]
Tubo N UK UK neta Ab Fc
mg/ml
Bl -
1 2
2 4
3 6
4 8
5 10

Las absorbancias se grafican en un sistema de coordenadas, colocando en el eje vertical

las absorbancias y en el eje horizontal las concentraciones de proteínas.

c) Determinación cuantitativa de proteínas. Se toma 1.0 ml de suero diluido 10 veces (1:10). Se

añade 4.0 ml del reactivo de Biuret, se agita y se deja en reposo durante 30 minutos a 37 °C.
Transcurrido este tiempo se lee en el fotocolorímetro a 540 nm frente a un blanco apropiado.

Determinar la cantidad de proteína en mg/ml teniendo en cuenta el factor de calibración

determinado anteriormente.

*En los cálculos no se olvide de la dilución realizada*

CUESTIONARIO
1. Cuál es el fundamento de la reacción de biuret y que grupos de las proteínas son
responsables de esta reacción?

2. La desnaturalización de una proteína puede producirse por tratamiento con varios agentes
desnaturalizantes. Indicar cómo actúan los siguientes agentes desnaturalizantes:
a) Calor
b) ácido fuerte
c) solución salina saturada
d) disolventes orgánicos (alcohol, cloroformo).

3. Qué pH eligiría para separar mediante electroforesis una mezcla de las siguientes proteínas:
Mezcla A: Ureasa (pI = 5.0) y Seroalbúmina (pI = 4.9)
Mezcla B: Mioglobina (pI = 7.0) y Citocromo c (pI = 10.6)

4. La insulina es sintetizada en las células ß del páncreas a partir de la proinsulina, que es un

polipéptido de una sola cadena. Señale los métodos que Ud. utilizaría para realizar la
separación de ambas proteínas, teniendo en cuenta los siguientes datos fisico-químicos.
Indique los resultados que esperaría encontrar al usar cada uno de los métodos que propone.
Proinsulina: PM = 6000, pI = 5.3; Insulina: PM = 9000, pI = 6.4.