FOTOLUMINISCENCIA

MOLECULAR
 El término “luminiscencia”
lo introdujo por primera vez el
físico e historiador científico
alemán Eilhard Wiedemann
en el año 1888

Luminescencia es la emisión de luz de una

sustancia (no producida por calor)
 Clasificación

Incandescencia Luz a partir de energía calórica. Ej: sol

Fotoluminiscencia: fluorescencia y
fosforescencia (radiación electromagnética)

Luminiscencia Quimioluminiscencia (reacción química)

Electroluminiscencia (corriente eléctrica)

Radioluminiscencia (energía nuclear)

 Fotoluminescencia
Fluorescencia ¿Cómo la reconocemos?

Luz
incandenscente
Los pigmentos
sensibles a la luz UV la
absorven y devuelven
Luz ultravioleta al sistema luz visible.

El τ de fluorescencia es
muy corto y se observa
Luz ultravioleta “fluorescencia” durante
la irradiación con luz UV
 Fotoluminescencia
Fosforescencia
¿Cómo reconocemos que estamos observando
fosforescencia?
Las moléculas fosforescentes emiten luz visible que
persiste aún en ausencia de la luz de excitación.

El tiempo de vida de fosforescencia es más largo, y

veremos la señal después que la luz se apagó
 Fotoluminescencia
La diferencia “macroscópica” entre los dos
principales tipos de luminiscencia se relaciona
con los tiempos del proceso de emisión
Fluorescencia: la molécula absorbe radiación
y la re-emite prácticamente en forma
instantánea. La fluorescencia cesa dentro de
los 10−5 seg después que la fuente de energía
se apaga.
Fosforescencia: persiste por un tiempo
después que la molécula se expuso a la luz.
 Fotoluminescencia
Relajación no- Luminescencia
Absorbancia radiante

S2 S2

Estados
electrónicos
excitados S1 S1 Nivel
excitado
de
menor
So So
Estado fundamental energía
regla de Kasha
Singlete: Todos los electrones en
la molécula están apareados
Triplete: Un par de electrones
están desapareados singlete singlete* triplete*
 Diagrama de Jablonski
Diagrama parcial de niveles de energía de una
molécula fotoluminiscente
Relajación vibracional (10-12 - 10-15 s)
Conversión interna
S2
Cruce de sistemas
S1

E T1
N
E Conversión
R Absorción F externa
G
(10-8 -
I (10-15 s) P
A 10-9 s)

S0
1 2 3 4
Diagrama de Jablonski
Disociación

A veces, los fotones

absorbidos tienen
energía suficiente para
promover a la molécula
a un estado de alta
energía vibracional que
produce la ruptura del
enlace. La molécula se
disocia y no fluoresce
Diagrama de Jablonski
Pre-disociación

Se alcanza un nivel
vibracional de mucha
energía a través de
conversión interna. El
enlace se rompe y la
molécula disociada
no fluoresce
RESUMEN DE LOS PROCESOS DE RELAJACIÓN

Relajación vibracional
Conversión interna
Relajación no Conversión externa
radiante
Cruce de sistemas
Disociación
Predisociación

Relajación Fluorescencia
radiante Fosforescencia
 Relajación no radiante
Relajación vibracional
Transferencia de exceso de E vibracional de la
molécula al solvente. Se refleja en un ligero incremento
de la temperatura del medio.
Conversión interna
Relaciona 2 estados electrónicos de = multiplicidad
(S2–S1, T2–T1, etc). Se solapan niveles vibracionales de
= E pero distintos niveles electrónicos.
Conversión externa
Choques de moléculas excitadas con moléculas de
solvente o vecinas.
 Relajación no radiante

Cruce de sistemas
Transición entre estados de distinta multiplicidad de
espín.
Disociación
Excitación directa a un estado vibracional alto,
produciendo la ruptura del enlace.
Predisociación
Alcance de un estado vibracional alto a través de
conversión interna.
 Relajación radiante

Fluorescencia
Emisión de radiación electromagnética a
partir del estado excitado singlete S1*

Fosforescencia
Emisión de radiación electromagnética a
partir del estado excitado triplete T1*
 Factores que influyen en la señal
fluorescente
Factores Factores
intrínsecos extrínsecos

tipo de concentración
transición pH
electrónica apagadores
químicos
estructura temperatura
solvente
 Factores que influyen en la señal
fluorescente
Tipo de transición electrónica

Los fluoróforos contienen generalmente un sistema

p conjugado. Las transiciones implicadas son:

p* p p* n
 Factores que influyen en la señal
fluorescente
Estructura

Compuestos aromáticos, estructuras con

dobles enlaces conjugados, anillos
aromáticos fusionados. Rigidez.

C
H2

fluoreno bifenilo
 Factores que influyen en la señal
fluorescente
 Fluorescen los compuestos con alto grado de aromaticidad

Quinina
Triptofano

Clorofila

Fluoresceina
 Factores que influyen en la señal
fluorescente
Estructura: sustituyentes en anillo aromático
 Grupos donores de electrones (amina, hidroxilo,
metoxi, etc) aumentan la fluorescencia
-NH2 -NH-CH3 -OH -O-CH3

 Grupos aceptores de electrones (nitro, carboxilo,

halógenos, etc) disminuyen la fluorescencia
-NO2 -COOH -CH2-COOH -Br -Cl -I
-(CH3)3N+ -NH3+
 Factores que influyen en la señal
fluorescente
Solvente
Efecto general
Influencia colectiva de las
moléculas de solvente
sobre el fluoróforo. Se
relaciona con el índice de
refracción y la constante
dieléctrica del solvente
Efecto específico
Interacción
específica entre
pocas moléculas
de solvente y el
fluoróforo
 Factores que influyen en la señal
fluorescente
Temperatura

Un aumento de temperatura, en general,

aumenta la probabilidad de conversión
externa → disminuye la intensidad de
fluorescencia
 Factores que influyen en la señal
fluorescente
La fluorescencia de compuestos
pH aromáticos con propiedades ácido-
base es generalmente pH-dependiente
H H H H H H H
+ H H
N N N N+

anilina ion anilinio

Apagadores
químicos Apagamiento dinámico y estático
 Bandas del espectro
F
EXCITACIÓN EMISIÓN

Corrimiento de
Stokes

S1 S1

So So
 Bandas del espectro
F
RAYLEIGH

F
RAYLEIGH
2° orden
RAMAN RAMAN
2° orden

S1

S0
RAYLEIGH RAMAN
Espectrofluorímetro
 Espectrofluorímetro
monocromador
fuente M
atenuador
del haz monocromador

fotomultiplicador
de muestra
fotomultiplicador
de referencia amplificador

dispositivo de lectura
Relación entre intensidad fluorescente y
concentración
Análisis cuantitativo

 = No fotones emitidos/No fotones absorbidos

 = IF/IA
IF =  IA =
=  (Io – IT) =
=  Io (1– IT/Io) =
=  Io (1 – e-2.303bC) =  Io (1 – e-kbC)
Relación entre intensidad fluorescente y
concentración

IF =  Io (1 – e-kbC)
Recordando que:

- +…
x x2 x3
e-x = 1- +
1! 2! 3!
si x es muy pequeño: e-x = 1-x

IF =  Io (1– 1 + kbC) = Io kbC IF = KC

K
 Relación entre intensidad fluorescente y
concentración
IF vs C (a bajas concentraciones de analito)
F
IF = KC

C
Análisis cuantitativo directo: se determina la cc de
una especie a partir de la señal que ella produce.
Análisis cuantitativo indirecto: se determina la cc de
una especie a partir del apagamiento que produce
en otro compuesto fluorescente (gráfico de Stern-
Volmer)
¿Porqué los métodos de fluorescencia son más
sensibles que los métodos basados en absorción?
En fluorescencia la sensibilidad aumenta al aumentar
la energía del haz de excitación (Io ) o amplificando la
señal del detector.

Recordar → IF = IokbC

En absorción → -log Io/It = abC

al aumentar Io se incrementa proporcionalmente It y

no afecta la sensibilidad. Amplificar la señal del
detector también influye en ambas magnitudes de
forma idéntica y no se logra ganancia.
 Causas de desvío de linealidad
IF =  Io (1 – e-kbC)
Si kbC es grande (absorbancia  0.05) → alta C
(kbC)2 (kbC)3 ... ]
IF =  Io [kbC – + –
2 6
F
Término lineal
Lineal+cuadrático+cúbico
Lineal+cuadrático
Conclusión: Este desvío
C surge de la relación
no-lineal entre F y C
 Causas de desvío de linealidad
Otras causas:
 Efectos de filtro interno (primario y
secundario) producido por el propio analito a
alta concentración
 Efectos de filtro interno (primario y
secundario) producido por otro compuesto de
la muestra
 Autoapagamiento
 Causas de desvío de linealidad
Efecto de filtro interno primario

Atenuación del haz de excitación antes de

alcanzar la zona central de la celda de lectura
debido a la absorción de luz de excitación por
parte de la muestra.
La intensidad de la luz de excitación no es
constante a través de la solución.
 Causas de desvío de linealidad
Efecto de filtro interno primario
Baja Alta
concentración concentración

Excitación Excitación

Emisión Emisión

Excitación y emisión La emisión decrece

homogéneas porque la excitación
decrece conforme la luz
incidente atraviesa la celda
 Causas de desvío de linealidad
Efecto de filtro interno secundario
F Excitación Emisión


I I I
400 500 600

Si el corrimiento de Stokes es chico, la

fluorescencia emitida por el analito es
reabsorbida por él mismo, y la señal resultante
disminuye → autoabsorción
 Filtro interno primario y secundario
producido por otra especie
Una especie distinta del analito puede absorber
radiación incidente de la lámpara (FI primario) o
fluorescencia del analito (FI secundario) → el
interferente absorbe en la región de longitudes de
onda de excitación y/o emisión del analito.
Espectros del analito
F
EXC EM
↓ Io ↓F

250 350 450 550


Absorbancia interferente
 Efectos de filtro interno

Los efectos de filtro interno producidos

por el propio analito a alta concentración
o producidos por otro compuesto afectan
la linealidad de la curva de calibración
y/o los perfiles de los espectros de
excitación y/o emisión del analito
Otra causa de desvío de la linealidad
por altas concentraciones de analito
Autoapagamiento
Resultado de colisiones entre moléculas
excitadas del analito. Ocurre transferencia
no radiante de energía, posiblemente de
manera similar que la transferencia de
energía a moléculas de solvente en la
conversión externa. A mayor
concentración, mayor probabilidad de
colisiones.