ISO 7218 - Definiçoes Gerais PDF

Padrão ISO
Internacional 7218
Terceira edição
15/08/2007
Microbiologia de alimentos e de
produtos de alimentação animal
– Exigências gerais e
orientações para análises
microbiológicas –
PADRÃO INTERNACIONAL ISO 7218:2007
ii
Sumário Página
Prefácio ................................................................................................................................................................... v
Introdução ............................................................................................................................................................. vi
1. Âmbito de aplicação ....................................................................................................................................... 1
2. Referências normativas .................................................................................................................................. 1
3. Premissas ........................................................................................................................................................ 2
3.1. Geral ......................................................................................................................................................... 2
3.2. Considerações de segurança ................................................................................................................ 2
3.3. Projeto de laboratório ............................................................................................................................. 2
3.4. Áreas laboratoriais .................................................................................................................................. 3
3.5. Disposição e estruturação do local ....................................................................................................... 4
3.6. Limpeza e desinfecção ........................................................................................................................... 5
4. Quadro de funcionários .................................................................................................................................. 5
4.1. Geral ......................................................................................................................................................... 5
4.2. Competências .......................................................................................................................................... 6
4.3. Verificação de competência em curso de funcionários ...................................................................... 6
4.4. Higiene...................................................................................................................................................... 6
5. Utensílios e equipamentos............................................................................................................................. 6
5.1. Geral ...................................................................................................................................................... 6
5.2. Câmaras de proteção .......................................................................................................................... 7
5.3. Balanças e diluidores gravimétricos ................................................................................................. 8
5.4. Homogeneizadores, liquidificadores e misturadores ...................................................................... 9
5.5. pHmetro .............................................................................................................................................. 10
5.6. Autoclave ............................................................................................................................................ 11
5.7. Preparador de meio ........................................................................................................................... 12
5.8. Estufa/incubadora ............................................................................................................................. 12
5.9. Refrigeradores, salas refrigeradas .................................................................................................. 13
5.10. Congeladores e ultracongeladores ................................................................................................. 14
5.11. Banho-maria controlado via termostato ......................................................................................... 15
5.12. Aquecedores a vapor, incluindo banhos-maria de fervura ........................................................... 16
5.13. Forno de esterilização ....................................................................................................................... 17
5.14. Forno de microondas ........................................................................................................................ 17
5.15. Lavadora de vidrarias........................................................................................................................ 18
5.16. Microscópio óptico ............................................................................................................................ 19
5.17. Bico de Bunsen e queimadores ....................................................................................................... 19
5.18. Dispensadores para meios de cultura e reagentes ....................................................................... 20
5.19. Misturador do tipo vórtice ................................................................................................................ 20
5.20. Dispositivo de contagem de colônias ............................................................................................. 21
5.21. Equipamento para cultivo em atmosfera alterada ......................................................................... 22
5.22. Centrífuga ........................................................................................................................................... 22
5.23. Manta e chapa de aquecimento ....................................................................................................... 23
5.24. Semeador helicoidal .......................................................................................................................... 23
5.25. Destiladores, deionizadores e unidades de osmose-reversa ....................................................... 24
5.26. Cronômetros e dispositivos temporizadores ................................................................................. 24
5.27. Pipetas e pipetadores........................................................................................................................ 25
5.28. Termômetros e dispositivos de monitoramento de temperatura, incluindo registradores
automáticos ........................................................................................................................................... 26
5.29. Separador imunomagnético ............................................................................................................. 27
5.30. Sistema de filtração ........................................................................................................................... 27
5.31. Outros equipamentos e programas ................................................................................................. 28
iii
6. Preparação de vidrarias e outros materiais de laboratório ...................................................................... 28

6.1. Preparação ............................................................................................................................................. 28
6.2. Esterilização/descontaminação ........................................................................................................... 28
6.3. Equipamentos e materiais descartáveis ............................................................................................. 28
6.4. Armazenamento de vidrarias e materiais limpos .............................................................................. 28
6.5. Manipulação de vidrarias e materiais estéreis ................................................................................... 29
6.6. Uso de descontaminação e desinfecção ............................................................................................ 29
6.7. Manejo de descarte ............................................................................................................................... 29
6.8. Lavagem ................................................................................................................................................. 30
7. Preparação e esterilização de meios de cultura ........................................................................................ 30
8. Amostras laboratoriais ................................................................................................................................. 30
8.1. Amostragem........................................................................................................................................... 30
8.2. Transporte .............................................................................................................................................. 31
8.3. Recepção................................................................................................................................................ 31
8.4. Armazenamento .................................................................................................................................... 32
8.5. Porção teste ........................................................................................................................................... 32
9. Análise ............................................................................................................................................................ 32
9.1. Cuidados de higiene no decorrer da análise ...................................................................................... 32
9.2. Preparação de suspensão inicial e diluições ..................................................................................... 34
10. Enumeração ................................................................................................................................................... 34
10.1. Geral .................................................................................................................................................... 34
10.2. Enumeração usando meio sólido .................................................................................................... 35
10.3. Cálculo e descrição dos resultados obtidos em meio sólido ....................................................... 37
10.4. Enumeração de bolores e leveduras ............................................................................................... 43
10.5. Enumeração usando meio líquido ................................................................................................... 44
11. Método de detecção (método qualitativo) .................................................................................................. 49
11.1. Geral .................................................................................................................................................... 49
11.2. Princípio ............................................................................................................................................. 50
11.3. Medição de incertezas....................................................................................................................... 50
12. Métodos de confirmação .............................................................................................................................. 50
12.1. Geral .................................................................................................................................................... 50
12.2. Preparação de cultura pura .............................................................................................................. 50
12.3. Coloração de Gram (técnica de Hucker modificada) ..................................................................... 50
12.4. Utilização de galerias bioquímicas para identificação .................................................................. 52
12.5. Utilização de sondas nucléicas para identificação ........................................................................ 52
12.6. Métodos sorológicos ......................................................................................................................... 53
13. Relatório de análise ...................................................................................................................................... 53
14. Validação de métodos microbiológicos ..................................................................................................... 54
14.1. Validação de métodos de referência ............................................................................................... 54
14.2. Validação de métodos alternativos ................................................................................................. 54
14.3. Validação de métodos internos ....................................................................................................... 54
15. Certificação de qualidade de resultados/controle de qualidade de desempenho ................................. 54
15.1. Controle interno de qualidade .......................................................................................................... 54
15.2. Linhagens de referência ................................................................................................................... 54
15.3. Avaliação externa de qualidade (teste de proficiência)................................................................. 55
Anexo A (informativo) Propriedades de alguns desinfetantes ......................................................................... 56
Anexo B (normativo) Determinação de número mais provável (NMP) ............................................................ 57
Bibliografia ........................................................................................................................................................... 64
iv
Prefácio
ISO (Organização Internacional de Normalização) trata-se de uma federação mundial de órgãos nacionais de
normalização (órgãos membros da ISO). O trabalho de preparar Normas Internacionais de padronização é
normalmente realizado por um comitê técnico da ISO. Cada órgão membro interessado em um assunto para o
qual um comitê é estabelecido tem o direto de eleger uma representante neste comitê. Organizações
internacionais, governamentais e não governamentais ligadas à ISO, também participam dos trabalhos. ISO
colabora estreitamente com a Comissão Eletrotécnica Internacional (IEC) em tudo que diz respeito a
normalizações eletrotécnicas.
Os Padrões Internacionais são elaborados de acordo com regras estabelecidas nas Diretivas ISO/IEC, Parte 2.
A principal tarefa dos comitês técnicos é preparar Padrões Internacionais. Projetos internacionais de
normalizações adotados pelos comitês técnicos são submetidos aos órgãos membros para votação. A
publicação de um artigo de Normalização Internacional requer a aprovação de ao menos 75% dos órgãos
membros votantes.
Atentar para a possibilidade de que parte dos elementos constantes neste documento podem ser alvos de
direitos de patentes. A ISO não se responsabiliza por identificar quaisquer direitos de patentes.
A ISO 7218 foi preparada pelo Comitê Técnico ISO/TC 34, Food products, Subcomitê SC 9, Microbiology em
colaboração com o Comitê Técnico CEN/TC 275, Food analysis – Horizontal methods.
Esta terceira edição cancela e substitui a segunda edição (ISO 7218:1996), a qual foi tecnicamente revisada.
Ela ainda incorpora a Emenda ISO 7218:1996/Emenda 1:2001.
v
PADRÃO INTERNACIONAL ISO 7218:2007(E)
Introdução
Quando da realização de análises microbiológicas é especialmente importante que
- Apenas aqueles microrganismos que estão presentes na amostra sejam isolados e enumerados;
- Os microrganismos não contaminem o ambiente.
Para conseguir isto, é necessário prestar atenção à higiene pessoal e usar técnicas de trabalho que garantam,
o tanto quanto possível, exclusão de contaminação exógena.
Uma vez que, neste Padrão Internacional, é possível fornecer apenas alguns exemplos de cuidados a serem
tomados durante as análises microbiológicas, um conhecimento meticuloso das técnicas microbiológicas
aplicadas e dos microrganismos envolvidos é essencial. É importante que as análises sejam conduzidas o mais
precisamente possível, incluindo o monitoramento e registro de aspectos que podem influenciar os resultados e
cálculos de número de microrganismos e a incerteza dos resultados.
Em última análise, é de responsabilidade do chefe de laboratório julgar se as manipulações são seguras e

podem ser consideradas como boas práticas laboratoriais.
Um grande número de manipulações podem, por exemplo, não intencionalmente levar á contaminação
cruzada, e o analista deveria sempre verificar a precisão dos resultados fornecidos pela técnica dele(a).
Para conduzir as análises corretamente, é necessário tomar certas precauções quando construindo e
equipando um laboratório.
Alguns cuidados devem ser tomados, não somente por razões de higiene, mas também para garantir a boa
reprodutibilidade dos resultados. Não é possível determinar todos os cuidados a serem tomados em todas as
circunstâncias, mas este Padrão Internacional ao menos fornece as principais medidas a serem tomadas
quando do preparo, esterilização, armazenamento de meio e uso do equipamento.
Se as orientações fornecidas neste Padrão Internacional forem seguidas, isto contribuirá para a manutenção da
saúde e segurança pessoal. Informações adicionais a respeito deste tema podem ser encontradas na literatura
fornecida na Bibliografia.
vi
Microbiologia de alimentos e de produtos de alimentação animal
– Exigências gerais e orientações para análises microbiológicas
1. Âmbito de aplicação
Este Padrão Internacional apresenta exigências gerais e orientações/opções destinadas a três principais usos:
- Implementação dos padrões ISO/TC 34/SC 9 ou ISO/TC 34/SC5 para detecção ou enumeração de
microrganismos, chamados a seguir “padrões específicos”;
- Boas práticas de laboratório para laboratórios de análises microbiológicas (o objetivo não é tratar disto
neste Padrão Internacional, há manuais disponíveis sobre isto);
- Orientações para credenciamento de laboratórios de análises microbiológicas de alimentos (este

Padrão Internacional descreve exigências técnicas de acordo com o Anexo B da ISO/IEC 17025:2005
para credenciamento de laboratórios microbiológicos por órgãos nacionais).
As exigências deste Padrão Internacional substitui às correspondentes por padrões específicos pré-existentes.
Instruções adicionais no campo das análises de biologia molecular estão especificadas na ISO 22174.
Este Padrão Internacional cobre a análise de bactérias, fungos e leveduras e pode ser utilizado, se
suplementado com as orientações específicas, para príons, parasitas e vírus. Ele não cobre a análise de
toxinas e outros metabólitos (e.g. aminas) advindos de microrganismos.
Este Padrão Internacional aplica-se à microbiologia de alimentos, produtos de alimentação animal, ambientes
de produção de alimentos e ambientes de produção primária.
O propósito deste Padrão Internacional é ajudar a garantir da validade das análises microbiológicas dos
alimentos, ajudar na garantia de que as técnicas gerais utilizadas na condução destas análises são as mesmas
em todos os laboratórios, ajudar a alcançar a homogeneidade de resultados entre laboratórios, e contribuir para
a segurança dos analistas evitando riscos de contaminação.
2. Referências normativas
As referências normativas citadas são indispensáveis para a aplicação deste documento. Para referências
datadas, apenas a edição citada se aplica. Para referências não datadas a edição mais recente da publicação
referenciada se aplica (incluindo quaisquer emendas).
ISO 835 (todas as partes), Vidrarias laboratoriais – Pipetas graduadas
ISO 6887 (todas as partes), Microbiologia de alimentos e de produtos de alimentação animal – Preparação de
amostras-teste, suspensão inicial e diluições decimais para análises microbiológicas.
ISO 8199, Qualidade de água – Orientações gerais para a enumeração de microrganismos por meio de cultivo
ISO 8261, Leite e produtos derivados – Orientações gerais para a preparação de amostras teste, suspensão
inicial e diluições decimais para análise microbiológica.
ISO 8655-1, Dispositivos volumétricos operados por pistão – Parte 1: terminologia, exigências gerais e
recomendações ao usuário
1
ISO/TS 11133 (Todas as partes) Microbiologia de alimentos e de produtos alimentação animal – Diretrizes
para preparação e produção de meio de cultura
ISO 16140, Microbiologia de alimentos e produtos de alimentação animal – Protocolo para validação de
métodos alternativos
ISO/TS 19036, Microbiologia de alimentos e produtos de alimentação animal – Orientações para a estimativa
de medição de incertezas para determinações quantitativas
ISO 22174, Microbiologia de alimentos e produtos de alimentação animal – Reação em cadeia da polimerase
(PCR) para detecção de patógenos transmitidos por alimentos – Exigências gerais e definições
3. Premissas
3.1. Geral
Este item apresenta exigências gerais, e.g. os princípios de planejamento e organização, para a disposição de
um laboratório microbiológico.
Análises de amostras do estágio de produção primária (especialmente de recepção e preparo de amostras)

devem ser separadas de análises de outras amostras para reduzir o risco de contaminação cruzada.
3.2. Considerações de segurança
O projeto de laboratório deve cumprir com exigências de segurança as quais dependerão do tipo de
microrganismo. Para este fim, os microrganismos são classificados em quatro categorias de risco:
- Categoria de risco 1 (nenhum ou risco muito baixo individual e para comunidade);
Um microrganismo que é improvável de causar doença em humanos e animais.
- Categoria de risco 2 (risco moderado individual, baixo risco à comunidade).
Um patógeno que pode causar doença em humanos e animais, mas dificilmente apresente perigo biológico
sério aos trabalhadores do laboratório, a comunidade ou ao ambiente. Exposições podem causar infecção
humana séria, mas tratamentos efetivos e medidas preventivas estão disponíveis e o risco de disseminação da
infecção é limitado.
- Categoria de risco 3 (alto risco individual, baixo risco à comunidade)
Um patógeno que geralmente causa doença humana ou animal séria, mas normalmente não disseminada de
um individuo para outro. Tratamento efetivo e medidas preventivas estão disponíveis.
- Categoria de risco 4 (alto risco individual e à comunidade)
Um patógeno que geralmente causa doença séria em humano ou animal e que pode ser prontamente
transmitida de um indivíduo para outro, direta ou indiretamente. Tratamentos efetivos e medidas preventivas
não estão disponíveis.
ATENÇÃO – Consultar os regulamentos e leis nacionais os quais definem, em particular, a categoria de risco do microrganismo
encontrado no país em questão.
3.3. Projeto de laboratório
As orientações para as disposições laboratoriais descritas abaixo abrangem a detecção de microrganismos

pertencentes às categorias 1, 2 e 3 para microbiologia de alimentos.
Deve-se notar que medidas de segurança adicionais podem ser necessárias dependendo da legislação local.
2
3.4. Áreas do laboratório
3.4.1. Geral
O laboratório constitui-se de áreas associadas a amostras e análises (ver 3.4.2.) e áreas gerais (ver 3.4.3.).
Estas devem ser separadas.
3.4.2. Áreas associadas com amostras e análises
É considerada boa prática a separação de locais, ou clara designação de áreas, para os seguintes propósitos:
- Recepção e armazenamento de amostras;
- Preparação de amostras, particularmente no caso de matéria prima (e.g. produtos em pó contendo um

alto número de microrganismos);
- Análises de amostras (de suspensões iniciais), incluindo incubação de microrganismos;
- Manipulação de patógenos presuntivos;
- Armazenamento de linhagens de referência e outras;
- Preparação e esterilização de meios de cultura e equipamentos;
- Armazenamento de meios de cultura e reagentes;
- Análises de esterilidade de produtos alimentícios;
- Descontaminação;
- Limpeza de vidrarias e outros equipamentos;
- Armazenamento de produtos químicos perigosos, preferencialmente mantidos em câmaras

especialmente desenhadas para isto, armários, salas ou prédios.
3.4.3. Áreas gerais
Devem ser consideradas áreas separadas para as seguintes finalidades:
- Entradas, corredores, escadas, elevadores;
- Áreas administrativas (e.g. secretarias, escritórios, salas de documentação, etc.);
- Vestiários e sanitários;
- Salas de arquivo;
- Lojas e conveniências;
- Salas de descanso.
3
3.5. Disposição e propriedades do local
3.5.1. Objetivos
O objetivo é garantir que o ambiente no qual as análises microbiológicas são realizadas, não afete a
confiabilidade dos resultados dos testes.
Organizar os locais de modo a evitar contaminação cruzada. Maneiras de se evitar isso, são por exemplo:
a) Construir um laboratório de acordo com o princípio do sentido único de fluxo;
b) Realizar os procedimentos de maneira sequencial tomando os devidos cuidados para garantir a

integridade do teste e das amostras (e.g. usar recipientes fechados);
c) Separar atividade espacial e temporalmente.
Evitar condições extremas como excesso de temperatura, pó, humidade, vapor, barulho, vibração, etc.
Os espaços devem ser suficientes para permitir que as áreas de trabalho sejam mantidas limpas e
organizadas. O espaço necessário deve se relacionado ao volume de análises desenvolvidas e à organização
global interna do laboratório. O espaço deve atender às regulamentações nacionais, quando estas existirem.
3.5.2. Estruturação
O ambiente de testes deve ser construído e equipado das seguintes maneiras a fim de evitar o risco de
contaminação por poeira e por consequência por microrganismos (para microrganismos incluídos na categoria
de risco 3, consultar as disposições regulamentais nacionais).
a) As paredes, teto e piso devem ser lisos, fáceis de limpar e resistentes a detergentes e
desinfetantes usados em laboratórios.
b) Pisos devem ser antiderrapantes.
c) A tubulação de passagem de líquidos não deve passar sobre os locais a menos que estejam
hermeticamente fechados. Quaisquer outras estruturas que passem pelo teto tem que estar
cobertas ou ser de fácil acesso para limpeza.
d) Janelas e portas devem ser fecháveis para minimizar a corrente de ar durante a realização das
análises. Além disso, elas devem ser projetadas para evitar o acúmulo de poeira e ser de fácil
limpeza. A temperatura ambiente (18ºC a 27ºC) e a qualidade do ar (composição microbiana, taxa
de espalhamento de poeira, etc.) devem ser compatíveis com a realização de análises. Um sistema
de ventilação com filtragem do ar que entra e sai é recomendado para esta aplicação.
e) Um sistema de extração adequado deve ser instalado para evitar a dispersão no ar de pós de meio
de cultura desidratado e de amostras.
f) Quando os testes estão sendo conduzidos em uma atmosfera de baixa contaminação, a sala deve
ser especialmente equipada com uma cabine de fluxo laminar ou cabine de segurança.
g) Caso necessário, o ambiente laboratorial pode ser protegido da radiação do sol usando-se
persianas ou vidro especialmente tratado. Não é recomendável a utilização de persianas
internamente, uma vez que elas podem dificultar a limpeza e se tornar uma fonte de poeira.
3.5.3. Outros pontos
Os seguintes pontos devem ser considerados:
- A disponibilidade de suprimento de água, de qualidade adequada para o uso desejado;
4
- Disponibilidade de eletricidade;
- Disponibilidade de gás (encanado ou engarrafado);
- Iluminação adequada em todas as seções do laboratório;
- Bancadas e mobiliário lisos, impermeáveis e de fácil limpeza e desinfecção;
- Mobiliário para laboratório que permita a fácil limpeza dos pisos (e.g. mobília móvel);
- Nenhum móvel, documento ou outro item que não seja estritamente necessário para as atividades de
análise devem ser mantidos nas áreas de análise;
- Disponibilidade de armários para manter os documentos usados quando da manipulação de amostras,

meios de cultura, reagentes, etc.;
- Disponibilidade de pias para lavagem das mãos em cada sala de análise e, se necessário, em áreas
gerais, preferencialmente perto das portas;
- Disponibilidade de uma autoclave para destruição de material de descarte e meios de cultura

contaminados, a menos que haja um sistema apropriado de remoção de descarte contaminado para
incineração;
- Disponibilidade de um sistema de segurança que cubra incêndios, emergências elétricas e chuveiro de

emergência e lava-olhos;
- Disponibilidade de instalações de primeiros socorros.
3.6. Limpeza e desinfecção
Os seguintes pontos devem ser checados.
a) Os pisos, paredes, tetos, bancadas do laboratório, mobília e junções entre estes devem ser submetidos
à manutenção e reparo regulares para evitar rachaduras que podem atuar como fonte de contaminação.
b) Limpeza e desinfecção frequente devem ser realizadas para manter os locais em condições adequadas
para a condução dos testes. Superfícies contaminadas ou potencialmente contaminadas devem ser
descontaminadas usando desinfetantes de atividade bactericida e fungicida conhecida.
NOTA 1: Salas e equipamentos podem ser descontaminados por fumegação de vapor de formaldeído, se permitido pelas
disposições de regulamentação nacional.
c) O sistema de ventilação e seus filtros devem ser regularmente submetidos à manutenção e os filtro
trocados sempre que necessário.
d) A qualidade microbiológica das superfícies de trabalho do laboratório, superfícies de contato com a

equipe de analistas, e o ar devem ser monitorados regularmente (a frequência depende dos resultados
de testes anteriores).
e) A contaminação de superfícies pode ser estimada pela aplicação direta de uma placa contendo
neutralizadores de agentes sanitizantes (e.g. lecitina, tiossulfato de sódio). A qualidade do ar pode ser
analisada pela exposição por 15 min de uma placa de Petri aberta contendo meio ágar não seletivo (e.g.
placa de ágar de contagem – PAC) ou um ágar seletivo apropriado para os microrganismos alvo da
análise (e.g. bolores).
NOTA 2: Outros métodos podem também ser utilizados para estimar a contaminação de superfícies e do ar. Ver ISO 18593.
4. Quadro de funcionários
4.1. Geral
Exigências gerais de competências do quadro de funcionários podem ser encontradas na ISO/IEC 17025.
5
4.2. Competências
Para cada método ou técnica, critérios objetivos devem ser definidos para a determinação da competência
apropriada, ambos inicialmente e durante o processo.
As competências podem ser estabelecidas no laboratório por controles internos de qualidade (ver 15.1.2.).
NOTA: Uma das maneiras de averiguar desempenho baixo (pipetagem, pouco homogeneização de suspensões iniciais, contagem, etc.) no
caso de enumerações por contagem de colônias é apresentada na ISO 14461-1.
4.3. Verificação de competências em curso de funcionários
A verificação de competências em curso de funcionários pode ser avaliada regularmente usando parâmetros
objetivos. Isto inclui a participação em programas internos de certificação de qualidade, testes de proficiência
(ver ISO/IEC Manual 43-1), o uso de materiais de referência ou por teste auto-verificação para enumeração de
microrganismos como descrito na ISO 14461-2.
4.4. Higiene
Os seguintes cuidados de higiene pessoal devem ser tomados para evitar a contaminação de amostras e
meios de cultura e evitar o risco de infecção dos funcionários.
a) Usar vestimentas apropriadas ao laboratório, não apertadas, limpas e em boas condições, não
inflamáveis. Esta roupa não deve ser utilizada fora das áreas de trabalho do laboratório e, possivelmente,
vestiários.
b) Usar protetores para cabelo e barba, se necessário para a integridade das amostras.
c) Manter unhas limpas e preferencialmente curtas.
d) Lavar as mãos vigorosamente em água morna, preferencialmente em pias de abertura não manual, antes
e depois das análises microbiológicas e imediatamente após ir ao sanitário. Usar sabão líquido ou em pó,
ou se possível sanitizador, aplicado por dispensador mantido limpo. Para a secagem das mãos, usar
papéis ou toalhas descartáveis. Estas medidas são aplicáveis ao corpo de funcionário e também aos
visitantes do laboratório.
e) Quando trabalhando com amostras expostas, culturas, meios, e quando da inoculação, evitar falar, tossir,
etc.
f) Pessoas com infecções de pele ou doenças devem tomar cuidados de modo que os microrganismos
destas patologias não contaminem as amostras e podem invalidar os resulatdos.
g) Não comer ou beber no laboratório e não colocar alimentos de consumo pessoal nos refrigeradores ou
congeladores.
h) Pipetagem com a boca é terminantemente proibido.
5. Utensílios e equipamentos
5.1. Geral
De acordo com as boas práticas de laboratório, todos os utensílios e equipamentos devem ser mantidos limpos
e em boas condições de funcionamento. Antes do uso, o equipamento deve ser verificado quanto a sua
aplicabilidade a função em questão e seu desempenho monitorado durante o uso, quando apropriado.
Quando necessário, equipamentos e dispositivos de monitoramento devem ser calibrados de acordo com
padrões nacionais vigentes, e a recalibração, quaisquer checagens intermediárias realizadas, procedimento e
resultados devem ser documentados;
6
Os equipamentos devem ser averiguados e submetidos à manutenção frequentemente para garantir a
segurança e adaptabilidade ao uso. Os equipamentos devem ser monitorados de acordo com as condições de
trabalho e acurácia necessário para os resultados.
A frequência de calibração e verificação de cada item do equipamento não está, na maioria dos casos,
especificada neste Padrão Internacional, uma vez que isto deve ser determinado por cada laboratório,
dependendo do tipo de equipamento e do nível de atividade do laboratório, e de acordo com as instruções do
fabricante. Em um pequeno número de casos, uma frequência foi estipulada quando considerado essencial.
Utensílios e aparelhos devem ser construídos e instalados de modo a facilitar a operação e permitir a fácil
manutenção, limpeza, descontaminação e calibração. Quaisquer incertezas de medição indicadas neste item
referem-se aos aparelhos e equipamentos em questão e não ao método de análise.
Neste item são apresentadas exigências de acurácia de medição de equipamentos de medida. Estes são
baseados na tolerância prática necessária para apresentar controles confiáveis dos equipamentos no uso de
rotina. A acurácia estabelecida é relacionada à incerteza metrológica do dispositivo (ver ISO guia 99).
Para equipamento de controle de temperatura, averiguar a estabilidade e homogeneidade da temperatura

antes do uso inicial e após quaisquer reparos ou modificações que possam surtir efeito no controle de
temperatura.
5.2. Cabines de proteção
5.2.1. Descrição
Uma cabine de proteção é um posto de trabalho com fluxo laminar horizontal ou vertical de ar com a finalidade
de remover poeiras e outras partículas, como microrganismos, do ar.
O maior número tolerável de partículas por metro cúbico com um tamanho maior ou igual a 0,5 µm representa
a classe de partículas difundíveis de uma cabine de segurança. Para cabines utilizadas em análises
microbiológicas de alimentos, o número de partículas não deve exceder 4.000 por metro cúbico.
Cabines para uso em laboratórios de microbiologia de alimentos são de quatro tipos.
a) Cabines de segurança classe I são abertas frontalmente, exigem proteção via exaustão e são destinadas a
proteger o operador e o ambiente mas não protegem o produto de contaminação exógena. Aerossóis
potencialmente infectados ficarão retidos nas cabines e nos filtros. O ar filtrado normalmente é ejetado para
a atmosfera; se isso não for feito, o ar deve passar através de filtros 2 HEPA montados em série. Elas não
são recomendadas para trabalhos com microrganismos da com patógenos da categoria 3 por causa da
dificuldade em se manter e assegurar a proteção apropriada do operador.
b) Cabines de segurança classe II protegem o produto, o operador e o ambiente. Elas recirculam um pouco do
ar filtrado, expelindo uma parte para a atmosfera e repondo-o com ar da atmosfera pela abertura de
trabalho, fornecendo proteção ao operador. Elas são adequadas para trabalhos com patógenos da
categoria 3.
c) Cabines de fluxo laminar horizontal protegem o trabalho de contaminação, mas sopram no rosto do
operador quaisquer aerossóis gerados. Elas não são adequadas para manipulação de culturas inoculadas
ou preparações de culturas de tecidos.
d) Cabines de fluxo laminar verticais protegem o produto por meio de fluxo laminar de ar filtrado por filtros
HEPA. Elas também protegem o operador por usar ar recirculado internamente. Elas são particularmente
adequadas por fornecer um ambiente asséptico para a manipulação de produtos estéreis e por proteger o
operador quando manipulando pós.
Usar cabines de proteção para todo trabalho envolvendo a manipulação de patógenos e produtos
contaminados, caso seja exigido por disposições regulamentais nacionais.
7
O uso de bicos de Bunsen ou queimadores de alças não é recomendado nas cabines de proteção. Caso o uso
seja necessário, o bico de Bunsen deve ter uma chama pequena de modo que o fluxo de ar não seja
perturbado. O uso de equipamentos descartáveis (alças, pipetas, etc.) é uma alternativa adequada.
5.2.2. Uso
As cabines devem ser mantidas sem equipamentos na medida do possível.
Quando praticável, colocar tudo que for necessário dentro da cabine antes de iniciar o trabalho para minimizar
o número de movimentos do braço dentro e fora da abertura de trabalho. Posicionar os equipamentos e
materiais de modo a minimizar a perturbação do fluxo de ar na abertura de trabalho.
Os operadores devem ser treinados adequadamente para usar corretamente as cabines e garantir sua
segurança e a integridade do produto ou cultura.
5.2.3. Limpeza e desinfecção
Limpar e desinfetar as áreas de trabalho após o uso com desinfetante apropriado e não corrosivo de acordo
com as instruções do fabricante. Examinar regularmente as grades que protegem os filtros e limpá-las com
uma gaze embebida em desinfetante.
Para cabines de fluxo laminar, a frente do filtro deve ser limpa com um aspirador regularmente, tomando
cuidado para não danificar o meio do filtro.
Cabines de segurança devem ser fumegadas antes da troca do filtro ou de serviços.
Após a limpeza das cabines, lâmpadas UV podem ser utilizadas para a desinfecção. As lâmpadas UV devem
ser regularmente limpas e trocadas de acordo com as instruções do fabricante.
5.2.4. Manutenção e inspeção
Usar cabines de proteção que sejam apropriadas ao uso pretendido e as condições ambientais do laboratório.
A eficiência de uma cabine de proteção deve ser averiguada por uma pessoa qualificada no momento da
chegada do equipamento e após intervalos regulares de tempo como recomendado pelo fabricante, bem como
após quaisquer reparos ou modificações.
Verificações periódicas de ausência de contaminação por microrganismos devem ser realizadas analisando as
superfícies de trabalho e paredes das cabines.
Uma verificação periódica do número de microrganismos transportados pelo ar deve ser realizada durante o
funcionamento dos filtros quando do uso do equipamento. Por exemplo, expor muitas placas de Petri contendo
meio de cultura de ágar não seletivo (e.g. ACP) em cada cabine por 30 minutos. Outros métodos podem ser
utilizados.
5.3. Balanças e diluidores gravimétricos
5.3.1. Uso e medição de incertezas
Balanças são principalmente utilizadas para pesagem de porções teste de amostras a serem analisadas e dos
componentes do meio de cultura e reagentes. Além disso, elas podem ser utilizadas para realizar medidas de
diluição de líquidos por massa.
Diluidores gravimétricos são instrumentos eletrônicos que consistem de uma balança e um dispensador
programável de líquidos e usados durante a preparação de suspensões iniciais de amostras; eles funcionam
adicionando diluente a uma amostra ajustado a uma razão. A subamostra é então pesada a uma tolerância
8
especificada na aplicação, e o diluidor é ajustado para adicionar diluente suficiente para atingir a razão
desejada (e.g. 9 para 1 para diluições decimais).
Um laboratório de análise microbiológica de alimentos deve estar equipado com balanças de intervalos e
incertezas de medição adequados aos diferentes produtos a serem pesados.
A menos que determinado o contrário, o erro máximo aceitável deve ser de 1% ou melhor quando pesando
amostras teste.
Colocar o equipamento sobre uma superfície horizontal estável, ajustada adequadamente para garantir sua
nivelação e protegê-la de vibração.
O equipamento deve ser limpo e desinfetado, após o uso ou após o derramamento durante a pesagem, com
desinfetantes apropriados e não corrosivos.
5.3.3. Avaliação de desempenho e calibração
O desempenho do sistema de balança deve ser regularmente verificado durante o uso e após a limpeza com
pesos calibrados por uma pessoa treinada. A calibração deve ser averiguada ao longo de todo intervalo de
peso mensurável por uma pessoa qualificada a uma frequência dependente do uso.
Averiguação de pesos pode ser realizada imediatamente após a calibração da balança.
5.4. Homogeneizadores, liquidificadores e misturadores
5.4.1. Descrição
Este equipamento é utilizado para preparar a suspensão inicial de uma amostra teste de produtos não líquidos.
Os seguintes aparelhos podem ser utilizados:
- Um misturador peristáltico (stomacher) com sacolas estéreis, possivelmente com um dispositivo para
ajuste de velocidade e tempo; ou
- Um homogeneizador rotacional (liquidificador), com velocidade entre 8.000 r/min e 45.000 r/min
inclusive, com recipientes de vidro ou metal esterilizáveis e tampáveis; ou
- Um misturador vibracional (pulsifier) com sacolas estéreis; ou
- Outro sistema de homogeneização com eficiência equivalente.
Em alguns casos, a homogeneização manual pode ser realizada usando-se esferas de vidro de diâmetro
apropriado (aproximadamente 6 mm; ver ISO 6887-2 a ISO 6887-4 e ISO 8261).
5.4.2. Uso
O tempo comum de funcionamento do homogeneizador peristáltico é de 1 min a 3 min (ver ISO 6887-2 a 6887-
4 e ISO 8261 para alimentos específicos).
Não usar este tipo de aparelho para alimentos do tipo:
- Produtos propensos a perfurar as sacolas (presença de partes cortantes, duras ou secas);
- Produtos difíceis de misturar por causa de sua textura (e.g. salames).
9
O liquidificador deve operar por um tempo de modo que o número total de rotações esteja entre 15.000 r/min e
20.000 r/min. Mesmo em homogeneizadores mais lentos, este tempo não deve exceder 2,5 minutos.
O misturador vibracional pode ser utilizado para a maioria dos alimentos, incluindo-se produtos duros e secos.
O tempo de funcionamento usual é de 0,5 a 1 minuto. Caso os microrganismos estejam dentro de estruturas
bastante internas, as amostras podem ser cortadas em pequenos pedaços antes do processamento.
Esferas de vidro podem ser utilizadas para a preparação, por agitação, da suspensão inicial de certos produtos
viscosos e espessos, em particular para certos produtos lácteos (ver padrões específicos).
Limpar e desinfetar homogeneizadores peristálticos e vibracionais regularmente e após vazamentos ou

perfurações de qualquer sacola.
Para homogeneizadores rotacionais, limpar e esterilizar os recipientes de vidro ou metal após cada uso.
5.4.4. Manutenção
Inspecionar e manter o equipamento de acordo com as instruções do fabricante.
5.5. pHmetro
5.5.1. Descrição
Um pHmetro é utilizado para medir a diferença potencial, a uma determinada temperatura, entre a medição de
um eletrodo de medição e um de referência, ambos os eletrodos introduzidos no produto. Este deve ser capaz
de medir com uma acurácia de ± 0,05 unidades de pH e com uma resolução de 0,01 unidade de pH. O
pHmetro deve ser provido com compensação manual ou automática de temperatura.
NOTA: O eletrodo de medição e o de referência são normalmente unidos em um sistema único de eletrodo.
5.5.2. Uso
Um pHmetro é utilizado para medir o valor de pH de meios de cultura e reagentes para verificar se ajustes são
necessários durante o preparo e como verificação de qualidade após a esterilização.
Ele pode ser utilizado para medir o valor de pH de amostras e suspensões de amostra. O uso de um pHmetro é
discutido no padrão específico para o produto a ser analisado, no qual a condição de determinação de valor de
pH e o valor de pH a ser ajustado são especificados.
Ajustar o pHmetro como indicado nas orientações do fabricante e medir o valor de pH a uma temperatura
padronizada, e.g. 25ºC. Ler o valor de pH após a estabilização da leitura pelo eletrodo. Tomar nota do valor de
pH com duas casas decimais.
NOTA: A leitura pode ser considerada estável com o valor de pH medido após um período de 5 segundos varia não mais que 0,02
unidades de pH. Usando eletrodos em boas condições, o equilíbrio é atingido normalmente em 30 segundos.
5.5.3. Verificação e calibração
Verificar o pHmetro de acordo com as instruções do fabricante, usando ao menos dois, mas preferencialmente
três, soluções tampão padrão diariamente antes de utilizá-lo. Definir o máximo erro permitido para esta
verificação, dependendo do uso.
As soluções padrão devem ter valores de pH especificado com duas casas decimais a uma determinada
temperatura (em geral, pH 7,00 e pH 4,00 e/ou pH 9,0 a 25ºC, de acordo com as instruções do fabricante). Os
padrões utilizados devem abranger os valores de pH a serem medidos.
Após a verificação do pHmetro com duas soluções tampão padrão, o pH deve ser verificado usando o terceiro
tampão, como tampão controle, e.g. pH 5 ou 8.
10
Calibrar o pH quando as medições apresentarem-se além dos erros máximos permitidos e de acordo com as
instruções do fabricante.
Este aferimento pode se sucedido por uma calibração que permite a medida estimada da incerteza do
pHmetro.
5.5.4. Manutenção
Verificar e manter os eletrodos de acordo com as instruções do fabricante. Se necessário, particularmente,

monitorar regularmente:
- a condição do eletrodo quanto ao desgaste e condição de limpeza, e
- o tempo de resposta e estabilidade.
Enxaguar os eletrodos com água destilada ou deionizada após a utilização. Levando em consideração o
desgaste e condição de limpeza dos eletrodos, limpá-los regularmente de acordo com as instruções do
fabricante.
Guardar os eletrodos de acordo com as orientações do fabricante.
5.6. Autoclave
5.6.1. Descrição
Uma autoclave faz com que uma câmara chegue a determinada temperatura graças a vapor de água e é
utilizada para a destruição de microrganismos.
Uma autoclave deve ser equipada com:

- ao menos uma válvula de segurança,
- uma torneira de drenagem,
- um dispositivo de regulagem permitindo a manutenção da temperatura no interior da câmara com intervalo
de variação de ± 3°C da temperatura alvo (levando em consideração a incerteza da medição do par
termoelétrico de medição), e
- uma sonda de temperatura ou um par termoelétrico de registro,
Ela deve ser também equipada com um temporizador e um medidor de temperatura.
5.6.2. Uso
Com esterilização por vapor, todo ar é expelido antes da pressurização. Se a autoclave não estiver equipada
com um dispositivo de expulsão de ar para pressurização, torna-se necessária a remoção do ar até que um jato
contínuo de vapor seja emitido.
Para a destruição de microrganismos, a câmara saturada com vapor deve estar a uma temperatura de ao
menos 121°C.
Não use a autoclave concomitantemente para esterilizar equipamentos limpos (e/ou meios de cultura) e para
descontaminar equipamentos utilizados (e/ou meios de cultura usados).
É preferível utilizar autoclaves separadas para materiais contaminados e materiais limpos. Após a esterilização
em autoclave, todos os materiais e equipamentos devem ser resfriados dentro da autoclave antes da remoção.
Por razões de segurança, não retirar os materiais autoclavados antes quee a temperatura tenha caído até 80°C
aproximadamente.
11
5.6.3. Manutenção
Limpar a câmara, secar filtros e selamento de portas regularmente. Verificar se as portar selam por completo.
Providenciar a drenagem de descalcificação, se necessário, a intervalos regulares de tempo. Seguir as
instruções do fabricante.
5.6.4. Verificação e calibração
A autoclave deve ser mantida em boas condições de funcionamento e deve ser inspecionada regularmente por
pessoal qualificado para tal função de acordo com as instruções do fabricante.
Manter os instrumentos de monitoramento em boas condições de funcionamento e verifica-los com

regularidade.
A validação inicial deve conter estudos de desempenho para cada ciclo de operação e cada configuração
utilizada na prática. Este processo deve ser repetido após modificação e reparo significante. Um número
suficiente de sensores de temperatura deve ser colocado junto do material introduzido de modo a demonstrar a
penetração adequada do calor em todos os pontos. Validações e revalidações devem considerar a adequação
dos tempos de aquecimento e resfriamento, bem como das temperaturas de esterilização.
Para cada carregamento, no mínimo, um indicador de processo deve ser adicionado ao centro do material para
verificar o aquecimento durante o processo, quando não há disponível um registro rastreável da eficiência do
processo.
5.7. Preparador de meios
5.7.1. Descrição
O preparador de meio é projetado principalmente para a esterilização de grandes volumes de meio (>1litro).
Ele consiste em um recipiente de aquecimento, uma câmara de água e um dispositivo de homogeneização. O
equipamento deve também ser provido de um dispositivo de controle de temperatura, pressão, temporizador e
válvula de segurança.
Além disso, a unidade deve possuir uma trava de segurança que evita a abertura até que a temperatura esteja
inferior a 80°C.
5.7.2. Uso
Sempre seguir as orientações do fabricante.
O processo inteiro de produção ocorre dentro do aparelho. Após a adição de todos os ingredientes, estes são
dissolvidos por mistura e aquecimento. Isto é seguido por esterilização.
5.7.3. Manutenção
Lavar o preparador e enxaguar bem com água pura entre cada lote de meio.
5.7.4. Verificação
O preparador deve ser mantido em boas condições de funcionamento e ser inspecionado regularmente por
pessoal qualificado de acordo com as instruções do fabricante.
Manter os instrumentos de monitoramento em bom estado de funcionamento e verificar o seu desempenho

regularmente.
A validação inicial deve conter estudos de desempenho para cada ciclo de operação e cada configuração
utilizada na prática. Este processo deve ser repetido após modificação e reparo significante. Duas sondas de
temperatura, uma ao lado da sonda controle e outra longe desta, podem ser utilizadas para demonstrar a
uniformidade do aquecimento. A temperatura e duração de cada ciclo devem ser verificadas.
12
5.8. Estufa/Incubadora
5.8.1. Descrição
Uma estufa/incubadora consiste em uma câmara com isolamento que permita ser mantida a uma temperatura
estável e uniformemente distribuída dentro dos erros permissíveis de temperatura especificados no método de
análise.
5.8.2. Uso
As estufas devem ser providas de um sistema de regulação que permita manter a temperatura e outros
parâmetros estáveis para todo volume de trabalho. Definir o volume de trabalho de modo a atingir isto.
Se a temperatura ambiente é próxima ou maior que a da estufa/incubadora, esta deve possuir um sistema de
refrigeração.
As paredes da estufa devem ser protegidas do sol.
Se possível, as estufas não devem ser preenchidas de uma única vez, porque isto tornará o alcance e
estabilização da temperatura pelos meios de cultura, bastante mais lento independentemente do tipo de estufa
(por convecção de ar ou outros). Evitar deixar a porta da estufa aberta por longos períodos.
Quando preenchendo a estufa, prestar atenção à circulação do ar (ver 10.2.4.).
5.8.3. Limpeza e sanitização
Limpar e desinfetar regularmente as paredes internas e externas da estufa e, se for o caso, remover a poeira
do sistema de ventilação.
Verificar a estabilidade e homogeneidade de distribuição da temperatura com o volume de trabalho em curso

usando termômetros ou par termoelétrico de precisão conhecida e intervalo de temperatura adequados.
Usar a informação para determinar âmbito de variação de temperatura de funcionamento e a melhor posição
para o termômetro monitorar as temperaturas de funcionamento.
Por exemplo, para uma temperatura alvo de 37°C ± 1°C quando os dados de perfil mostram uma variação de
36,8°C a 37,3°C ao longo da estufa, então o intervalo de funcionamento deve ser reduzido para 36,2°C a
37,7°C para garantir que todas as partes da estufa alcancem a temperatura almejada de 37°C. Este processo
deve ser repetido a cada reparo ou modificação significantes.
A temperatura de funcionamento deve ser verificada com um ou mais termômetros de máxima e mínima ou
pares termoelétricos de registro, por exemplo.
O termômetro ou par termoelétrico de registro utilizados para monitoramentos de rotina da estufa devem ser
fixos em uma posição definida a partir do perfil de dados de modo a atingir a temperatura desejada.
Verificar a temperatura da estufa em todos os dias de trabalho. Por esta razão, cada estufa deve possuir ao
menos um instrumento de medição, com bulbo imerso em glicerol (ou outro líquido de imersão) dentro de um
recipiente vedado.
Outros sistemas de verificação de desempenho equivalente podem ser utilizados.
13
5.9. Refrigeradores, salas refrigeradas
5.9.1. Descrição
Existem câmaras que permitem o armazenamento sob resfriamento. Para a conservação de amostras de
alimentos para análise, a temperatura deve ser 3°C ± 2°C (máximo erro permitido), exceto para usos
específicos. Para outros usos, a temperatura, a menos que especificado de outra maneira, deve ser de 5°C ±
3°C.
5.9.2. Uso
Para evitar contaminação cruzada, usar câmaras diferentes, ou ao menos compartimentos diferentes,
proporcionando separação física durante o armazenamento de:
- meios de cultura não inoculados e reagentes;
- amostras teste, e
- culturas de microrganismo e meio incubado.
Preencher refrigeradores, resfriadores e salas refrigeradas de modo a manter a circulação apropriada e

diminuir o risco de contaminação cruzada.
Verificar a temperatura de cada câmara de trabalho usando um termômetro ou sonda permanentemente

instalada. A precisão necessária do dispositivo de monitoramento de temperatura depende do propósito ao
qual a unidade se destina.
5.9.4. Manutenção e limpeza
Realizar os seguintes procedimentos de manutenção em intervalos regulares para garantir o funcionamento

adequado:
- remoção da poeira das pás do motor e da parte externa das placas de troca de calor;
- descongelamento;
- limpeza e desinfecção do interior das câmaras.
5.10. Congeladores e ultracongeladores
5.10.1. Descrição
Um congelador é uma câmara que permite o armazenamento de artigos congelados. A temperatura, a menos
que especificada de maneira diferente, deve ser abaixo de -15°C, preferencialmente, abaixo de -18°C para
amostras de alimentos.
Um ultracongelador é uma câmara que permite o armazenamento de artigos profundamente congelados. A

temperatura, a menos que especificada de maneira diferente, deve ser abaixo de -70°C.
5.10.2. Uso
5.10.2.1.Congelador
Diferentes câmaras, ou ao menos diferentes compartimentos, devem estar disponíveis para separar
fisicamente durante o armazenamento:
14
- reagentes não inoculados;
- amostras para análise, e
- culturas de microrganismos.
Preencher o congelador de modo que uma temperatura suficientemente baixa seja mantida, em particular
quando produtos descongelados forem introduzidos.
5.10.2.2.Ultra-congelador
O principal uso é para o armazenamento de microrganismos, culturas de trabalho e/ou referência e reagentes.
Preencher o congelador de modo que uma temperatura suficientemente baixa seja mantida e contaminações
cruzadas entre microrganismos e reagentes sejam evitadas.
Verificar a temperatura de cada câmara regularmente usando um dispositivo de monitoramento de temperatura

adequado.
5.10.4. Manutenção
Realizar as seguintes ações de manutenção:

- remoção da poeira das pás do motor e da parte externa das placas de troca de calor (caso acessível);
- descongelamento;
- limpeza e desinfecção do interior das câmaras.
5.11. Banho-maria controlado via termostato
5.11.1. Descrição
Um banho-maria controlado via termostato, preenchido com líquido (água, etileno glicol, etc.), com ou sem uma
tampa ou outro dispositivo limitante de evaporação, é necessário para a manutenção de uma temperatura
específica. O controle da temperatura é normalmente mais preciso que em uma estufa, permitindo erros
máximos de ± 0,5°C ou melhor. As temperaturas de trabalho e erros máximos permitidos são estipuladas em
cada método individualmente. Um sistema de resfriamento é necessário para manter a temperatura perto ou
abaixo da temperatura ambiente.
5.11.2. Uso
Os principais usos são os seguintes:

- incubação a temperaturas constantes de meios de cultura inoculados;
- manutenção de meio ágar estéril fundido durante a preparação de meios;
- aclimatação de meio ágar estéril fundido para uso em métodos específicos;
- preparação de suspensões iniciais de amostras ou soluções a temperaturas controladas;
- tratamento térmico de suspensões iniciais de amostras a temperatura controlada (e.g. pasteurização).
15
Quando uma temperatura precisa é necessária, o banho-maria deve ser equipado com um sistema de
circulação de água e regulação de temperatura. Toda movimentação de líquido não pode provocar dispersão
de gotas.
Banhos-maria com tampa são recomendados para usos de alta-temperatura. Devem ser utilizadas tampas
convexas que permitam a drenagem da água condensada.
Para a incubação de meio inoculado, manter o nível do líquido do banho de modo que este esteja 2 cm acima
do nível do meio de cultura incubado.
Outros recipientes devem ser acondicionados no banho de modo que seus conteúdos fiquem abaixo da linha
da superfície do líquido.
A profundidade de imersão deve impedir a entrada de água pela abertura do recipiente.
Dispositivos que mantenham a estabilidade dos recipientes podem ser necessários, por exemplo estantes.
Todos os recipientes devem ser secos após a remoção do banho-maria e antes de usos posteriores.
Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura do banho antes do uso inicial e após quaisquer
reparos ou modificações que surtam efeito sobre o controle de temperatura.
Monitorar cada banho com termômetro, par termoelétrico ou dispositivo de registro de um mínimo de
temperatura de medida adequada (ver 5.28.2.), e independentes do sistema automático de regulagem de
temperatura.
Um mostrador digital pode ser utilizado desde que sua precisão e resolução sejam averiguadas.
Monitorar a temperatura do banho durante cada uso e diariamente para períodos de longa duração de
incubação.
Banhos-maria devem ser preenchidos com líquido conforme orientações do fabricante. Para incubação de
culturas deve-se preferir água destilada ou deionizada.
Verificar regularmente o nível de líquido a fim de garantir o correto funcionamento do aparelho e imersão
satisfatória de itens no banho. O nível de liquido deve sempre cobrir o nível do elemento em aquecimento.
Banhos-maria devem ser esvaziados, limpos, desinfetados e preenchidos regularmente e a uma frequência
dependente do uso ou após vazamentos.
5.12. Aquecedores a vapor, incluindo banhos-maria de fervura
5.12.1. Descrição
Aquecedores a vapor e banhos-maria de fervura consistem de elementos de aquecimento circundados por

água em um recipiente com uma tampa. Nos aquecedores a vapor, cria-se vapor a pressão atmosférica; em
banhos-maria de fervura aquece-se a água até próximo à temperatura de ebulição, com ou sem produção de
vapor.
5.12.2. Uso
Os principais usos são:

- fundir meio de cultura com agar;
- preparação de meios termo-instáveis;
16
- redução de contaminação de pequenos itens de equipamentos entre usos.
Um nível adequado e seguro de água deve estar presente no recipiente para garantir que os elementos de
aquecimento estejam permanentemente cobertos.
Uma autoclave com aparato livre de vapor também pode ser utilizada.
Manter os aquecedores a vapor e banhos-maria de fervura limpos.
Se necessário, descalcificação regular pode ser realizada a uma frequência dependente da dureza local da
água.
5.13. Forno de esterilização
5.13.1. Descrição
Um forno de esterilização é uma câmara capaz de manter a temperatura de 160°C a 180°C para a destruição
de microrganismos por calor seco.
5.13.2. Uso
Apenas itens resistentes feitos em vidros ou metal devem ser esterilizados em forno de esterilização; não usar
para plástico e produtos emborrachados.
Antes de esterilizar limpas todos os utensílios de metal ou vidro a serem esterilizados no forno.
No caso de esterilização de vidrarias volumétricas, verificar constantemente a precisão das medições.
A temperatura deve ser uniforme ao longo da câmara. O forno deve ser equipado com um termostato e um
termômetro ou instrumento de registro de temperatura de acurácia adequada.
Ele deve ser equipado com um indicador de duração, temporizador ou programador.
Uma vez atingida a temperatura de funcionamento, o processo de esterilização deve perdurar por 1h a 170°C
ou um binômio tempo/temperatura equivalente.
Após a esterilização, a fim de evitar rachaduras, as vidrarias devem ser mantidas no forno até que se resfriem
antes de serem removidas.
Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura do forno antes do uso inicial e após quaisquer
reparos ou modificações que possam surtir efeito no controle de temperatura.
O forno deve ser provido de um termômetro, par termoelétrico ou instrumento de registro de temperatura,
calibrado e de precisão apropriada independente do sistema automático de regulação da temperatura. O
instrumento de monitoramento deve ter uma resolução de 1°C ou maior na temperatura utilizada pelo forno.
A temperatura do forno deve ser verificada e registrada a cada uso.
Limpar as superfícies internas do forno quando requeridas.
17
5.14. Forno de microondas
5.14.1. Descrição
Um forno de microondas é um instrumento que permite o aquecimento de itens através da energia de

microondas a pressão atmosférica.
5.14.2. Uso
Usar os meios atualmente disponível apenas para aquecer líquidos e fundir meio de cultura com ágar.
ATENÇÃO – Não aquecer mios contendo componentes termolábeis em forno de microondas a menos que tenha sido mostrado
que isto não afeta o desempenho do meio. Nenhum estudo foi feito sobre a eficiência do microondas na esterilização de meio de
cultura e os fornos de microondas não devem ser utilizados para esta finalidade.
O forno deve ser capaz de aquecer líquidos e meios de cultura de uma maneira controlada, via ciclos de
emissão de microondas. A distribuição das microondas deve ser homogênea e evitar zonas de
superaquecimento. Fornos equipados com plataformas giratórias ou agitadores fornecem melhor distribuição
de calor.
Não usar equipamentos metálicos, inclusive selos metálicos. Abrir as tampas das garrafas antes do
aquecimento.
Aquecimentos por períodos maiores a menores potências apresentam melhor distribuição de calor.
ATENÇÃO – manipular os itens aquecidos com cautela. Os conteúdos podem estar superaquecidos e transbordar ou explodir as
garrafas.
Quando fundir meios com ágar, usar uma potência baixa (e.g. ciclo de descongelamento) e um recipiente com
água (e.g. 50 ml a 100 ml de água em um recipiente microondas-resistente) são recomendados para evitar
superaquecimento.
Antes da remoção de dentro do microondas, recomenda-se deixar 5 min em descanso após o aquecimento.
Tempos e potências devem ser adequados a diferentes volumes de líquidos e meios de cultura rotineiramente
utilizados a fim de garantir o melhor desempenho e evitar superaquecimento de produtos sensíveis.
Limpar o forno imediatamente após qualquer derramamento, e também a intervalos regulares dependendo do
uso.
A vedação da porta do forno deve ser averiguada quanto a sua integridade e o forno deve ser avaliado quanto
a eventuais vazamentos de radiação, em intervalos regulares.
5.15. Lavadora de vidrarias
5.15.1. Descrição
Lavadoras de vidrarias são máquinas controladas eletronicamente que se destinam a lavagem de vidrarias em
geral, e podem ser programadas para diferentes ciclos de lavagem e enxague (e.g. água deionizada ou
destilada ou ácido).
Dispositivos de lavagem de pipetas de vidro são lavadoras especiais projetadas para lavar os orifícios estreitos
das pipetas.
18
5.12.2. Uso
Muitos tipos de lavadoras de vidro estão disponíveis, e estas devem em geral ser instaladas e utilizadas
segundo as recomendações do fabricante.
Verificar a eficiência da limpeza por inspeção visual e, para aplicações críticas, realizar testes para garantir que
a vidraria esteja livre de substâncias inibitórias.
Resíduos alcalinos e ácidos podem ser verificados usando-se uma solução indicadora de pH; Um pH entre 6,5
e 7,3 deve ser alcançado.
Programar a manutenção regular de acordo com as especificações do fabricante e a frequência adequada.
Manutenções mais frequentes podem ser necessárias para equipamentos com alta taxa de utilização ou em
regiões com água dura.
5.16. Microscópio óptico
5.16.1. Descrição
Há muitos tipos diferentes de microscópio: monocular, binocular, com um VDU, uma câmera ou equipamento
de fluorescência, etc. e com uma fonte de luz interna ou externa. Para análises bacteriológicas, objetivas com
aumento de 10x (lentes secas) a cerca de 100x (usadas com óleo de imersão) são utilizadas para obter um
aumento geral de 100x a 1000x. Microscopia de contraste de fase também é bastante útil para análises de
“preparações húmidas”.
5.16.2. Uso
Ajustar o microscópio de acordo com as instruções do fabricante. O eixo óptico de luz advindo de uma lâmpada
de luz de alta intensidade deve passar pelo centro do condensador, pela lâmina e pelas lentes objetivas
atingindo os olhos de modo a impedir distorções esféricas e cromáticas.
Seguir as recomendações do fabricante no que diz respeito à limpeza, armazenamento e manutenção. Impedir
a condensação que ocorre quando há alta umidade do ar, uma vez que isto pode levar à deterioração das
lentes.
Todos os dias ou após o uso, retirar o óleo de imersão das lentes e partes relacionadas utilizando um tecido
próprio para tal função. Usar o solvente recomendado pelo fabricante. Remover regularmente a gordura
depositada pelos cílios e sobrancelhas na lente ocular.
O sistema óptico pode ser facilmente danificado e, a manutenção deve ser preferencialmente por uma
assistência técnica autorizada.
5.17. Bico de Bunsen ou queimadores
5.17.1. Descrição
Bicos de Bunsen produzem uma chama estreita. Variando a quantidade de ar a ser misturado ao gás, pode-se
modular a intensidade do calor da chama.
Queimadores utilizam gás ou eletricidade para produzir calor vermelho sem chama para esterilizar alças e
bastões retos usados na manipulação de culturas.
19
5.17.2. Uso
Um queimador a gás é utilizado principalmente para a esterilização de alças de metal e bastões aquecendo-os
até a incandescência e para flambagem e esterilização de pequenas partes de equipamentos resistentes.
O queimador é utilizado para esterilização de alças de metal, bastões retos e agulhas de inoculação e é
preferível quando da manipulação de patógenos por evitar dispersão diminuindo o risco de contaminação
cruzada.
Bicos de Bunsen podem produzir muito calor e perturbar a circulação de ar no laboratório.
Técnicas assépticas podem ser realizadas sem um bico de Bunsen, apenas utilizando materiais descartáveis.
Em cabines de proteção, o uso de bicos de Bunsen deve ser evitado, porque eles podem interferir de maneira
inaceitável no fluxo laminar. Neste caso, o uso de instrumentos descartáveis é recomendado.
Limpar regularmente e desinfetar queimadores e bicos de Bunsen, particularmente se culturas de

microrganismos tiverem espirrado nos dispositivos.
5.18. Dispensadores para meios de cultura e reagentes
5.18.1. Descrição
Um dispensador é um instrumento ou dispositivo utilizado para distribuir meios de cultura ou reagentes em

tubos de ensaio, garrafas ou placas de Petri. Estes dispositivos variam desde simples cilindros, pipetas e
seringas manuais a seringas automáticas e bombas peristálticas programadas e eletronicamente controladas
com distribuição automática.
5.18.2. Uso
O equipamento limpo utilizado para a distribuição de meios de cultura e reagentes deve ser livre de
substâncias inibitórias. Utilizar tubos separados para meios de cultura seletivos de modo a minimizar o
transporte de substâncias inibitórias.
No caso da distribuição precisar ser efetuada assepticamente, as partes do dispensador que entram em
contato com o líquido devem ser esterilizadas.
A medida de incerteza do instrumento ou dispositivo deve ser apropriada para o máximo erro permitido para o
volume distribuído, o qual não deve exceder ± 5%. O máximo erro permitido na distribuição de volumes de
fluidos de diluição decimal é de ± 2%.
Verificar o volume distribuído antes do uso inicial e regularmente de acordo com um planejamento
documentado, e sempre após ajustes que possam surtir efeito no volume distribuído.
5.18.4. Limpeza e manutenção
Limpar a superfície externa do distribuidor após cada uso. Lavar e enxaguar abundantemente todas as partes
do dispensador que entram em contato com o produto e esteriliza-las caso seja necessário para a distribuição
de líquidos estéreis. Não utilizar desinfetantes nas superfícies que entram em contato com o produto a ser
distribuído uma vez que eles podem possuir propriedades inibitórias.
20
Todos os dispensadores automáticos devem ser mantidos em boas condições de funcionamento através de
manutenções regulares, de acordo com as orientações do fabricante.
5.19. Misturador do tipo vórtice
5.19.1. Descrição
Este instrumento facilita a mistura homogênea de meios líquidos (e.g. diluições decimais e amostras de líquido
para teste) ou suspensões de células bacterianas em um líquido.
A mistura é provocada por movimentos rotacionais excêntricos do conteúdo de um tubo ou recipiente

(produzindo um vórtice).
5.19.2. Uso
Pressionar a base do tubo ou recipiente contendo o líquido contra o misturador. A velocidade de mistura é
controlada variando a velocidade do motor ou o ângulo de contato com o misturador.
O analista deve garantir que não haja espirramento ajustando a velocidade adequadamente e segurando o
tubo a uma distância do topo de aproximadamente um terço de seu comprimento para garantir o melhor
controle do tubo evitando a subida do líquido.
Cuidados adequados devem ser tomados para minimizar a liberação de aerossóis quando da utilização de
misturadores do tipo vórtice.
A mistura adequada é evidenciada pela formação de um vórtice no interior do líquido durante o funcionamento
do aparelho.
Manter o aparelho limpo. No caso de espirramento, descontaminar o equipamento usando o desinfetante

apropriado.
5.20. Dispositivo de contagem de colônias
5.20.1. Descrição
Instrumentos manuais de contagem de colônias usam um dispositivo dependente de pressão e normalmente

emitem uma indicação sonora a cada contagem e um visor digital totalizando a contagem. Eles podem ser
dispositivos simples como canetas ou consistir em uma plataforma iluminada com grades calibradas e lupa de
aumento para auxiliar a contagem de colônias. Contadores eletrônicos automatizados incorporam analisadores
de imagens e funcionam através de combinações de sistemas de hardware e software fazendo-se uso de
câmeras e monitores.
5.20.2. Uso
Seguir as recomendações do fabricante. Ajustar a sensibilidade do contador automático para garantir que todas
as colônias alvo sem contabilizadas. Contadores eletrônicos automatizados precisam de programas separados
quando utilizados para contar colônias obtidas em diferentes tipos de ágar e matérias-primas, e para contagens
de superfície e de colônias em métodos pour plate para garantir a discriminação adequada das colônias alvo.
21
A verificação deve ser feita manual e regularmente de modo a garantir que contagens precisas sejam obtidas
utilizando o contador de colônias.
Além disso, contadores de colônias automatizados devem ser verificados todos os dias com placas de
calibração contendo um número conhecido de partículas ou colônias contáveis.
Manter o equipamento limpo e livre de pó; evitar arranhões nas superfícies essenciais para a contagem.
Programar manutenções regulares dos contadores eletrônicos que possuam analisadores de imagens como
especificado pelo fabricante, a uma frequência adequada.
5.21. Equipamento para cultivo em atmosfera modificada
5.21.1. Descrição
Este pode ser uma jarra hermeticamente fechada ou outro qualquer equipamento apropriado que permita a
formação de atmosfera modificada (e.g. para anaerobiose) ao longo de todo o tempo de incubação do meio de
cultura. Outros sistemas de desempenho equivalente, como câmaras de anaerobiose, podem ser utilizados.
Seguir as recomendações do fabricante quanto à instalação e manutenção.
5.21.2. Uso
A composição da atmosfera desejada pode ser atingida pela adição de uma mistura de gás (e.g. advindo de
cilindros de gás) após a retirada do ar da jarra, pelo deslocamento da atmosfera em uma cabine ou por outro
meio apropriado (como pacotes de gás disponíveis comercialmente).
Em geral, a incubação anaeróbica requer uma atmosfera com menos de 1% de oxigênio, 9% a 13% de dióxido
de carbono e a incubação microaeróbica requer de 5% a 7% de oxigênio e aproximadamente 10% de dióxido
de carbono.
As condições podem exigir modificação dependendo do microrganismo a ser cultivado.
Colocar um indicador químico ou biológico em cada câmara para monitorar a natureza da atmosfera durante
cada uso. O crescimento de um microrganismo controle ou a mudança de cor de um indicador químico indicam
que as condições apropriadas de incubação foram alcançadas.
No caso de um catalisador ser utilizado, regenerá-lo de acordo com as instruções do fabricante. Na presença
de válvulas, limpá-las e lubrifica-las para garantir o funcionamento adequado substituindo-as caso necessário.
Limpar e desinfetar o equipamento regularmente.
5.22. Centrífugas
5.22.1. Descrição
Centrífugas são dispositivos eletrônicos ou mecânicos que se utilizam da força centrípeta para separar
partículas em suspensão, incluindo microrganismos, de fluidos.
22
5.22.2. Uso
Em alguns casos, a concentração de microrganismos alvos é atingida pela centrifugação de amostras líquidas
a fim de formar um precipitado, que pode ser ressuspendido em líquido e sujeito à análise subsequente.
Tomar as providências necessárias para evitar a formação de aerossóis e de contaminação cruzada, usando o
equipamento adequadamente e utilizando tubos ou potes próprios para centrifugação, vedados e estéreis.
Quando a velocidade de centrifugação é crítica ou especificada para alguma aplicação, o indicador de

velocidade ou parâmetros devem ser verificados regularmente usando-se tacômetro independente e calibrado,
e após quaisquer modificações substanciais.
Limpar e desinfetar as centrífugas regularmente ou após quaisquer derramamentos de culturas de

microrganismos ou de amostras potencialmente contaminadas.
As centrífugas devem ser submetidas à manutenção regularmente.
5.23. Manta e chapa de aquecimento
5.23.1. Descrição
Mantas ou chapas de aquecimento são dispositivos de aquecimento controlados por termostato. Algumas
mantas ou chapas de aquecimento compõe sistemas de agitação.
5.23.2. Uso
Mantas ou chapas de aquecimento possuem equipadas com sistemas de agitação magnética são utilizadas
para aquecer grandes volumes de líquido como meios de cultura.
Não usar mantas ou chapas de aquecimento sem sistemas de agitação para preparar meios de cultura.
Limpar quaisquer derramamentos assim que a unidade for resfriada.
5.24. Semeador helicoidal
5.24.1. Descrição
Um semeador helicoidal é um dispensador que distribui um volume predeterminado de líquido sobre uma
superfície de uma placa de ágar em rotação. O braço de distribuição move-se do centro de uma placa para as
bordas externas em um espiral de Arquimedes. O volume aplicado diminui gradativamente com a
movimentação do braço do centro para as bordas da placa, de modo que haja uma relação inversa entre o
volume depositado e o radio da espiral. O volume total de amostra distribuída é conhecido e constante. Uma
bomba de vácuo é necessária para o carregamento de distribuição de líquidos.
5.24.2. Uso
O equipamento é utilizado para distribuir uma amostra liquida, amostra homogeneizada ou diluição sobre a
superfície de uma placa de ágar para determinar a contagem de colônias. Após a incubação, as colônias se
desenvolvem ao longo da linha onde o líquido foi depositado. O número de colônias é contado usando uma
grade de contagem fornecida junto com o equipamento e o cálculo é efetuado.
23
A superfície das placas de ágar a serem utilizadas com o semeador deve estar livre de bolhas de ar e
niveladas.
As placas devem ser pré-secas antes do uso para evitar que elas tenham excesso de umidade.
Os sistemas de distribuição devem ser desinfetados e enxaguados antes de cada amostra e após cada uso.
Verificar o ângulo do bico de aplicação diariamente utilizando vácuo para segurar uma tampa de placa. A
tampa da placa deve estar paralela e a 1 mm da superfície do ágar.
O padrão de distribuição deve ser verificado usando-se uma tinta lavável de distribuição. O padrão do espiral
deve ser mais denso no centro onde a deposição se inicia e tonar-se menos densa à medida que o bico
dispensador se afasta. A zona limpa da placa deve ser central e de aproximadamente 2,0 cm de diâmetro.
Uma verificação diária deve ser realizada para garantir que o bico dispensador está no ângulo correto em
relação à superfície do ágar, através da utilização da tampa da placa e de um nível fornecido junto com o
aparelho.
A esterilidade do semeador helicoidal deve ser verificada semeando-se água estéril a cada série de amostras.
Uma verificação gravimétrica do volume distribuído deve ser realizada regularmente com água destilada. A
massa obtida deve ter o erro máximo permitido de 5% da massa esperada para o volume distribuído.
A desinfecção dos tubos e bicos de distribuição pode ser realizada lavando-os com uma solução de 0,5% a 1%
de cloro e, deve ser seguida de enxague com água destilada ou deionizada estéril.
Entupimentos podem ser evitados, se a amostra for reservada por alguns minutos permitindo a decantação e
partículas em suspensão, e usando uma porção do líquido sobrenadante.
Quaisquer derramamentos devem ser limpos de imediato, além da limpeza deve ser regular.
O equipamento deve ser submetido à manutenção e verificação de acordo com o uso.
5.25. Destiladores, deionizadores e unidades de osmose-reversa
5.25.1. Descrição
Estes equipamentos são utilizados para produzir água destilada ou deionizada/desmineralizada de qualidade
necessária (ver ISO/TS 11133) para preparações de meios de cultura microbiológicos e reagentes e para
outras aplicações laboratoriais.
5.25.2. Uso
Instalar, colocar em uso e utilizar o equipamento de acordo com as instruções do fabricante, levando em
consideração a localização da água no laboratório, descarte e instalações elétricas.
A condutividade da água pode ser verificada regularmente ou após armazenamento e deve ser menor que 25
µS/cm (equivalente a resistividade ≥ 40.000 Ωcm) para preparação de meios e reagentes.
24
Caso a água seja armazenada antes do uso ou produzida por troca iônica, verificações adequadas de
contaminação microbiana devem ser realizadas de acordo com a ISO/TS 11133.
Destiladores devem ser limpos e descalcificados a uma frequência dependente da dureza da água fornecida.
Deionizadores e unidades de osmose-reversa devem ser mantidos de acordo com as instruções do fabricante.
5.26. Cronômetros e dispositivos temporizadores
5.26.1. Descrição
Dispositivos de cronometragem e temporizadores são instrumentos que permitem o monitoramento de

períodos de tempo necessários para muitas práticas laboratoriais nas quais a duração é especificada e critica.
5.26.2. Uso
Temporizadores portáteis ou de bancada, analógicos ou digitais, podem ser utilizados para monitorar a duração
de procedimentos laboratoriais (e.g. aplicação de microrganismos a filmes, homogeneização de amostras) e
devem estar em boas condições de uso e apresentar precisão necessária.
Manusear os temporizadores pertencentes a equipamentos (e.g. autoclaves, centrífugas, homogeneizadores)

de acordo com as instruções do fabricante. Estes temporizadores devem apresentar precisão necessária.
Verificar todos os temporizadores utilizados nos procedimentos laboratoriais nos quais a duração mostra-se
crítica ao resultado regularmente e após quaisquer reparos significativos.
Limpar regularmente e verificar o correto funcionamento.
Os temporizadores pertencentes a equipamentos devem ser verificados e submetidos à manutenção

juntamente com os aparelhos aos quais pertencem.
5.27. Pipetas e pipetadores
5.27.1. Descrição
Pipetas são dispositivos de vidro ou de plástico descartáveis usados para distribuir volumes de líquido ou
material viscoso; pipetas graduadas distribuem volumes medidos com uma precisão que é dependente de
especificações.
Pipetadores automáticos (mecânicos) com pontas de plástico são dispositivos que distribuem volumes fixos ou
ajustáveis de líquidos, manualmente ou por ação elétrica de um pistão.
5.27.2. Uso
Descartar pipetas quebradas ou danificadas.
Pipetas graduadas ou Pasteurs estéreis e ponteiras de pipetadores devem possuir um tampão de algodão
hidrofóbico para evitar a contaminação quando da manipulação de culturas.
Não pipetar com a boca em instalações microbiológicas, exceto para líquidos não contaminados.
25
Bulbos em pipetas graduadas e de Pasteur e ponteiras de pipetadores devem ser dos tamanhos adequados a
fim de evitar vazamentos e garantir um funcionamento eficiente.
Verificar as pipetas graduadas para confirmar os volumes distribuídos caso o fabricante não garanta a precisão
(confiança e precisão).
A calibração de pipetas/pipetadores está descrita na ISO 835 (todas as partes) e ISO 8655-1.
Testar novos pipetadores antes do uso e a intervalos regulares dependendo da frequência e natureza do uso,
para confirmar que eles respeitam os limites máximos de erros permitidos definidos na ISO 8655-1. Realizar
verificações gravimétricas usando água destilada ou deionizada para garantir que os volumes distribuídos
continuam dentro dos limites máximos de erro permitidos.
Verificar novos lotes de pipetas graduadas.
Descontaminar e limpar/esterilizar pipetas não descartáveis e pipetadores automáticos apropriadamente após

cada uso.
No caso de tambores e pistões de pipetadores automáticos serem contaminados durante o uso, desmontá-los
para descontaminação e limpeza. Após a remontagem, recalibrá-los. Quando isto não é possível no laboratório,
enviar os pipetadores para o fabricante para serem remontados e calibrados.
5.28. Termômetros e dispositivos de monitoramento de temperatura, incluindo registradores

automáticos
5.28.1. Descrição
Termômetros são dispositivos contendo álcool ou mercúrio contidos em um vidro e são utilizados para medir
temperaturas dentro de um intervalo para as atividades laboratoriais.
Outros dispositivos de monitoramento de temperatura incluem termômetros de resistência de platina e

instrumentos que utilizam par termoelétricos para medir a temperatura e fornecer indicação visual, por escrito
ou registro eletrônico da variação de temperatura ao longo do tempo.
Termômetros de referência e outros dispositivos de monitoramento de temperatura devem ser calibrados e

certificados de acordo com padrões internacionais. Eles devem ser utilizados apenas para referência e não
para atividades de rotina.
Termômetros de trabalho e outros dispositivos de monitoramento de temperatura devem ser calibrados de

modo a permitir a rastreabilidade de acordo com padrões nacionais ou internacionais.
Dispositivos com a precisão adequada de acordo com o especificado no padrão nacional ou internacional
apropriado podem também ser utilizados como termômetros de trabalho após a verificação de seu
desempenho.
5.28.2. Uso
Termômetros e outros dispositivos de monitoramento de temperatura devem ser capazes de medir a

temperatura necessária para uma aplicação apresentando-se dentro dos limites máximos de erro permitidos.
A medida da incerteza de um dispositivo de monitoramento de temperatura deve ser quatro vezes menor que o
intervalo máximo de erro permitido. Por exemplo, para um erro máximo permitido de ± 1°C para determinada
aplicação, a incerteza de medição deve ser de ± 0,25°C; para um erro máximo permitido de ± 0,5°C para
determinada aplicação, a incerteza de medição deve ser de ± 0,125°C. A incerteza de medição de um
26
termômetro de referência deve ser levada em consideração para a determinação da temperatura de
funcionamento.
Termômetros ou par termoelétrico colocados em estufas devem estar imersos em recipientes contendo glicerol,
parafina líquida ou propileno glicol para evitar a variação de calor quando da abertura da porta da estufa.
Manter somente o bulbo dos termômetros de imersão totalmente imersos.
Termômetros colocados em banhos-maria devem ser imersos de acordo com as especificações individuais,
e.g. termômetros de imersão parcial devem ser mantidos imersos a profundidade especificada, por exemplo, 76
mm ou 100 mm.
Não usar termômetros que apresentem quebras na coluna de álcool ou mercúrio.
Termômetros de mercúrio são frágeis e, quando há risco de quebra, devem ser colocados dentro de estruturas
que os protejam sem interferir na medição da temperatura.
ATENÇÃO – Mercúrio é prejudicial à saúde. Remover derramamentos de acordo com a legislação

nacional.
Termômetros de referência devem ser calibrados ao longo de todo intervalo de temperatura que medem de
acordo com padrões nacionais ou internacionais antes do uso inicial e pelo menos a cada 5 anos. A calibração
de pontos intermediários únicos (e.g. ponto de fusão) deve ser realizada para verificar o desempenho.
Pares termoelétricos de referência devem ser calibrados cuidadosamente de acordo com padrões nacionais ou
internacionais antes do uso inicial e de acordo com as instruções do fabricante. Verificações intermediárias
devem ser realizadas comparando-se com o termômetro de referência.
Outros dispositivos de monitoramento de temperatura (como receptores de ondas de rádio) devem ser
calibrados de acordo com o determinado em padrões nacionais ou internacionais e seguindo as orientações do
fabricante.
Termômetros ou par termoelétricos de trabalho devem ser verificados quanto ao ponto de fusão em relação a
termômetros de referência.
Manter os termômetros e pares termoelétricos limpos e em perfeitas condições.
Manter outros dispositivos de monitoramento de temperatura de acordo com as orientações do fabricante.
5.29. Separador imunomagnético
5.29.1. Descrição
Este dispositivo serve para separar e concentrar microrganismos de uma cultura líquida usando esferas
paramagnéticas circundadas pelo anticorpo específico.
Separadores manuais consistem em misturadores rotacionais capazes de funcionar a 12 r/min a 20 r/min e

uma porção concentradora com uma barra magnética removível.
Separadores automáticos utilizam arranjos de barras magnéticas e estantes de tubos similares a dentes de um
pente. As partículas são transferidas de tubo para tubo permitindo um processo de separação completo,
incluindo etapas de lavagem, ocorra automaticamente em um ambiente isolado.
5.29.2. Uso e verificação
27
Seguir a recomendações de uso fornecidas pelo fabricante e pelos padrões internacionais específicos (e.g.
para E. coli O157).
Para sistemas manuais, verificar a velocidade de rotação do agitador.
Para sistemas manuais e automáticos, verificar se o sistema é capaz de isolar baixas concentrações de
microrganismos antes de coloca-lo em uso de rotina.
É importante levar em consideração que as separações manuais possuem risco de contaminação cruzada e as
devidas precauções devem ser tomadas para evitar seu acontecimento.
Inspecionar e manter o equipamento de acordo com as especificações do fabricante.
5.30. Sistemas de filtração
Os sistemas de filtração devem ser como descritos na ISO 8199.
5.31. Outros equipamentos e programas
Outros equipamentos e programas associados devem ser capazes de atingir a precisão necessária e atender
às especificações relevantes aos testes em questão. Programas de calibração devem ser estabelecidos para
quantidades e valores-chave quando estas propriedades surtirem efeitos nos resultados. Antes do uso
rotineiro, calibrar ou verificar o equipamento para assegurar que este atende às necessidades do laboratório e
às especificações do Padrão relevante. Quaisquer reconfigurações ou modificações feitas pelo laboratório ao
software devem ser verificadas para garantir que com tais modificações forneçam os resultados corretos.
6. Preparação de vidrarias e outros materiais de laboratório
6.1. Preparação
Vidrarias e outros materiais de laboratório utilizados em microbiologia devem ser de formato apropriado,
utilizados adequadamente e preparados de modo a garantir sua limpeza e/ou esterilidade até o momento do
uso. Estes devem ser projetados para evitar ou limitar o contanto do manipulador com o material infectante.
Tubos e garrafas devem ser tampados da maneira apropriada. Se necessário, a vidraria a ser esterilizada (e.g.
pipetas) deve ser acondicionada em recipientes específicos ou embrulhados em material apropriado (papel
especial, folhas de alumínio, etc.) As vidrarias a serem esterilizadas vazias devem estar limpas, livres de
excesso de humidade, o que pode interferir no processo.
6.2. Esterilização/descontaminação
6.2.1. Geral
A temperatura e duração da esterilização/descontaminação devem ser registradas. Indicadores de esterilização

podem ser utilizados para distinguir materiais esterilizados de não esterilizados.
6.2.2. Esterilização por calor seco
Aquecer vidrarias, etc., em um forno de esterilização por pelo menor 1h a 170°C ou equivalente.
6.2.3. Esterilização por calor úmido
Vapor de água sobre pressão é o melhor método de esterilização de vidrarias e materiais de laboratório. A
temperatura da câmara da autoclave deve ser mantida a 121°C por no mínimo 15 min (ver 5.6.).
28
6.2.4. Descontaminação com compostos químicos
Usar produtos químicos (e.g. produtos a base de cloro, compostos de quaternário de amônio) nas
concentrações apropriadas e pelo tempo de contato adequado.
Garantir que os resíduos químicos não afetarão o crescimento microbiano.
6.3. Equipamentos e materiais descartáveis
Equipamentos e materiais descartáveis podem ser utilizados ao invés de equipamentos e materiais reutilizáveis
(vidrarias, placas de Petri, pipetas, garrafas, tubos, alças, espalhadores, etc.) caso as especificações sejam
similares.
É aconselhável verificar se os equipamentos são apropriados para o uso em microbiologia (em particular no
que diz respeito à esterilidade) e que os materiais não contenham substâncias que inibam o crescimento
microbiano (ver ISO 9998).
6.4. Armazenamento de vidrarias e materiais limpos
Proteger vidrarias e materiais limpos contra pó durante a estocagem e, em condições que mantenham a
limpeza.
6.5. Manuseio de vidrarias e materiais estéreis
Armazenar vidrarias e materiais estéreis de modo a garantir que continuem estéreis. Armazenar equipamentos
de uso único de acordo com as instruções do fabricante, sem deterioração da embalagem. Armazenar limpos
os equipamentos preparados.
Quando da esterilização de materiais para uso microbiológico, fornecer uma data de validade para o
procedimento (ou data de fabricação) em cada embalagem.
6.6. Uso de descontaminação e desinfecção
6.6.1. Descontaminação de equipamentos descartáveis
Descontaminar equipamentos descartáveis antes do descarte.
Além dos métodos contidos neste item, a incineração pode ser utilizada. Caso haja um incinerador nas
dependências, descontaminação e descarte podem ser efetuados no mesmo procedimento.
6.6.2. Descontaminação de vidrarias e materiais antes do uso
Em geral, a esterilização de equipamentos deve ser feita por calor úmido (ver 6.2.3.) ou calor seco (ver 6.2.2.).
Em certas situações (e.g. amostragem de campo), a descontaminação química pode ser necessária. Após o
tratamento, o equipamento deve ser isento de substâncias inibitórias.
6.6.3. Descontaminação de vidrarias e materiais de uso
Materiais para descontaminação e descarte devem ser colocados em recipientes, e.g. sacolas plásticas
autoclaváveis. A esterilização em autoclave é o método preferível para a maioria dos processos de
descontaminação (por pelo menos 30 min a 121°C). A autoclave deve ser carregada de modo a favorecer a
penetração do calor, (e.g. sem sobrecarregamento) e tomando-se o cuidado de manter tampas e sacolas
frouxas ou abertas.
Métodos alternativos à autoclavação podem ser utilizados se a legislação nacional permitir.
Autoclavar todos os equipamentos que tenham entrado em contato com culturas microbianas (meios de cultura
sólidos ou líquidos), incluindo recipientes reutilizáveis antes de terem o conteúdo descartado e serem limpos.
29
Durante a análise a descontaminação por imersão de pequenos equipamentos resistentes à corrosão em
desinfetantes diluídos pode ser realizada (ex. pipetas).
Usar as pipetas Pasteur apenas uma única vez.
A maioria dos desinfetantes (ver Anexo A) tem algum efeito tóxico. Usar luvas e protetores oculares quando da
manipulação de desinfetantes concentrados.
6.7. Manejo de descarte
O correto descarte de materiais contaminados não afeta diretamente a qualidade da análise, mas é um aspecto
de boa prática de manejos laboratoriais.
Este deve estar de acordo com a legislação nacional ambiental e de saúde específicas.
Um sistema de identificação de separação de materiais contaminados e seus recipientes podem se

estabelecidos por:
- Descarte não contaminado (e.g. amostras de alimentos não cultivados) e que possam ser descartados
em lixo comum;
- Bisturis, agulhas, facas, vidros quebrados;
- Material contaminado para autoclavação e reutilização;
- Material contaminado para autoclavação e descarte, ou apenas para descarte caso o material seja
incinerado (ver baixo, entretanto, as exigências especiais para a categoria de risco 3 de
microrganismos).
A incineração de materiais contaminados e seus recipientes deve ser realizada de acordo com a legislação
nacional ambiental e de saúde específicas.
Materiais contaminados com microrganismos da categoria de risco 3 e seus recipientes devem ser
autoclavados antes de serem incinerados.
6.8. Lavagem
Lavar materiais reutilizáveis apenas após a sua descontaminação. Após a lavagem enxaguar todos os
equipamentos com água deionizada.
Equipamentos especializados podem ser utilizados para facilitar o procedimento de limpeza (e.g. lavador de
pipetas, lavadora de louças, câmara de ultrassom).
Após a lavagem os materiais reutilizáveis devem estar livres de resíduos que possam afetar o crescimento
microbiano.
7. Preparação e esterilização de meios de cultura
Preparar e esterilizar os meios de cultura de acordo com a ISO/TS 11133-1 e ISO/TS 11133-2.
8. Amostras laboratoriais
8.1. Amostragem
8.1.1. Geral
Embora extremamente importantes para a interpretação dos resultados a amostragem e os planos de

amostragem não fazem parte deste Padrão Internacional. É importante que o laboratório receba uma amostra
representativa do lote que não tenha sido danificada ou modificada durante o transporte ou armazenamento.
30
A amostra deve ser protegida de contaminação externa advinda do ar, do recipiente onde está contida, dos
dispositivos de amostragem e de manipulação inadequada. Um recipiente de amostra não deve ter mais que
três quartos do volume preenchido para evitar vazamentos e possibilitar a homogeneização no laboratório.
Identificar as amostras clara e completamente, e registrar as informações da amostra.
Frequentemente, a temperatura do momento da coleta e após a recepção da amostra mostram-se úteis para a
interpretação dos resultados.
A amostra deve ser entregue na embalagem original e selada.
Caso o produto ou o recipiente que o contém sejam muito grandes para serem recebidos no laboratório, tomar
uma amostra assepticamente e acondicionar em recipiente estéril.
O recipiente estéril de amostra deve permanecer aberto apenas durante a transferência da amostra para seu
interior sendo imediatamente fechado após o processo.
8.1.2. Plano de amostragem
Amostragem não é parte deste Padrão Internacional. Ver o Padrão Internacional específico que lide com o
produto em questão, se disponível.
8.2. Transporte
O modo de transporte das amostras para o laboratório deve garantir que sejam mantidas condições que
minimizem quaisquer alterações no número de microrganismos presentes.
Entregar as amostras ao laboratório mantendo tanto quanto possíveis as condições originais de

armazenamento.
A amostra deve ser embalada de modo a evitar quebras e vazamentos.
A etiqueta do produto deve indicar se é necessária refrigeração.
Amostras que não necessitem refrigeração ou congelamento podem ser embaladas utilizando material
apropriado para evitar danos durante o transporte.
Não utilizar gelo livre uma vez que isto pode causar contaminação do produto no caso de avarias ou
vazamentos no recipiente.
A menos que contrariamente exigido em padrão específico (e.g. ISO 6887 e ISO 8261), as seguintes
temperaturas durante o transporte são recomendadas:
- produtos estáveis: temperatura ambiente (abaixo de 40°C);
- produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15°C, preferencialmente abaixo de -18°C;
- outros produtos não estáveis a temperatura ambiente: 1°C a 8°C;
- amostras de esfregaços de ambiente: ver ISO 18593 e ISO 17604.
Quando nenhuma condição é especificada, recomenda-se que as partes envolvidas entrem em comum acordo
quanto à temperatura e duração do transporte.
8.3. Recepção
Verificar as condições da amostra no momento de sua recepção.
No caso de condição insatisfatória ou quantidade insuficiente, o laboratório deve recusar a recepção.
Em circunstâncias especiais, elas podem ser analisadas, após discussão e acordo com o cliente.
31
Entretanto, o relatório de análise deve conter ressalvas sobre a validade dos resultados.
Documentar as amostras de modo que seu progresso ao longo da análise e elaboração do relatório possa ser
monitorado. A identificação e codificação da amostra deve garantir a sua rastreabilidade ao longo de todas as
etapas no laboratório.
Se necessário, as superfícies exteriores dos recipientes podem ser desinfetadas utilizando-se desinfetantes
apropriados.
Analisar o recipiente de amostra em busca de defeitos físicos evidentes.
Anotar as seguintes informações:
- Data (e hora, se relevante) de recepção;
- Detalhes de amostragem (data e hora da amostragem, se relevantes e conhecidas, condições da

amostra);
- Nome e endereço do cliente.
No momento da recepção de amostras perecíveis, registrar a temperatura de transporte ou a temperatura de

uma amostra simulada incluída para esta finalidade.
Analisar as amostras assim que possível após a recepção, preferencialmente dentro de 24h, ou como
acordado entre as partes envolvidas.
Para produtos altamente perecíveis (como mariscos), a análise deve começar dentro de 24h após a
amostragem. Para produtos perecíveis (como peixe e leite cru), a análise deve ser realizada dentro de 36h.
Caso o limite de tempo descrito acima não possa ser respeitado, as amostras devem ser congeladas a
temperaturas inferiores a 15ºC, preferencialmente a -18ºC, uma vez que já foi demonstrado que a recuperação
de microrganismos nestas condições neste tipo de matéria prima não é afetada.
8.4. Armazenamento
Armazenar as amostras a espera de análise em condições que minimizem quaisquer alterações no número de
microrganismos presentes.
As seguintes temperaturas de armazenamento são recomendadas:

- Produtos estáveis: temperatura ambiente (18ºC a 27ºC);
- Produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15ºC, preferencialmente abaixo de -18ºC;
- Outros produtos não estáveis à temperatura ambiente, incluindo alimentos estragados: 3ºC ± 2ºC (ver
ISO 6887-2 a ISO 6887-4 ou ISO 8261);
- Amostras de esfregaço de ambiente: ver ISO 18593 e ISO 17604.
8.5. Porção teste
8.5.1. Regras específicas para a tomada de porções teste
Consultar a parte relevante da ISO 6887, ou ISO 8261, para regras de tomada de porção teste e preparação de
suspensão inicial e sua homogeneização.
32
8.5.2. Conservação e destruição de amostras laboratoriais
Exceto em casos especiais, manter as amostras laboratoriais até que todos os resultados tenham sido obtidos,
ou por mais tempo, se necessário, acondicionando-as em recipiente estéril (e.g. sacola plástica) e retornando-
as a temperatura de armazenamento original.
Produtos perecíveis devem ser congelados.
NOTA: Não é uma pratica normalmente aceita o reteste de amostra devido à possibilidade de alteração da microbiota.
9. Análise
9.1. Cuidados de higiene do decorrer da análise
Para evitar a contaminação do ambiente e de amostras teste, manipular produtos em pó (desidratados) em

uma área ou sala separada ou em uma cabine de proteção.
Antes da abertura das amostras comuns, esfregar ao redor do ponto de pretendido de abertura uma gaze
embebida em álcool 70% (por volume) ou outro produto equivalente e esperar a evaporação. Antes da abertura
de embalagens estéreis, imergir a área a ser aberta em uma solução contendo 100 a 200 ppm de cloro (ou
outro esterilizante adequado) por pelo menos 10 min para destruir microrganismos que possam contaminar a
amostra.
Quaisquer instrumentos utilizados na abertura da embalagem ou remoção de toda ou parte da amostra

(abridores de lata, tesouras, colheres, pinças, pipetas, etc.) devem ser estéreis.
A área de trabalho circundante deve ser limpa e desinfetada com o desinfetante apropriado antes do início das
análises.
As mãos devem ser lavadas imediatamente antes e durante as análises caso sejam contaminadas.
Todos os equipamentos utilizados devem ser estéreis e protegidos de contaminação antes e durante o uso.
Todos os equipamentos e ferramentas utilizados devem ser colocados em recipientes adequados para
posteriores descarte ou esterilização.
Tomar cuidados de modo a conduzir os trabalhos assepticamente. Por exemplo:
a) Assegurar-se que a área de trabalho está limpa, que todas as possíveis fontes de contaminação foram
removidas ou reduzidas ao mínimo e que não haja corrente de ar (i.e. portas e janelas estejam fechadas),
e evitar movimentos desnecessários de pessoas durante as análises;
b) Antes e após o trabalho, descontaminar a superfície da área de trabalho com o desinfetante apropriado;
c) Antes do início, garantir que tudo que for necessário para a análise encontra-se disponível;
d) Realizar os testes sem demorar;
e) Separar atividades “limpas” e “sujas” temporal e espacialmente (isto é particularmente importante para
amostras de alto risco como carnes e ovos crus);
f) Usar equipamentos descartáveis;
g) Caso não seja utilizado todo o conteúdo de embalagens de pipetas e placas de Petri descartáveis, garantir
que esta foi apropriadamente vedada após a remoção das unidades a serem utilizadas;
33
h) Limpar imediatamente qualquer espirramento de amostra com algodão ou outro material embebido com
1
etanol 70% ou qualquer outro desinfetante apropriado, e então limpar e desinfetar a área de trabalho
antes de continuar;
i) Utilizar cabines de segurança quando da manipulação de produtos que possam conter bactérias
patogênicas, se for especificado pela legislação nacional;
j) Quando da retirada de pipetas dos recipientes onde ficam acondicionadas, evitar tocar a superfície externa
do recipiente das demais com a ponta da pipeta, uma vez que estas são susceptíveis a contaminação;
k) Não encostar as pipetas nas bordas ou gargalos de garrafas de diluição.
Aerossóis são a maior causa de contaminação ambiental e infecções. Aerossóis podem ser formados, por
exemplo:
- Quando da abertura de placas de Petri, tubos ou garrafas;
- Quando da utilização de agitadores, seringas, centrífugas e etc.;
- No momento do esvaziamento de pipetas;

- No momento da esterilização de alças ou agulhas inoculadas;
- Quando da abertura de ampolas contendo culturas congeladas e liofilizadas.
A formação destes deve ser minimizada.
Para métodos moleculares, tomar cuidados adicionais de acordo com a ISO 22174.
9.2. Preparação de suspensão inicial e diluições
9.2.1. Geral
Preparar suspensões iniciais e diluições de acordo com as partes relevantes das ISO 6887 ou ISO 8261. O
tempo decorrido entre o término da preparação da suspensão inicial e o momento em que o inóculo entra em
contato com o meio de cultura não deve exceder os 45 min, a menos que seja especificado diferentemente no
Padrão Internacional relevante.
Os passos de suspensão inicial e diluições podem ser seguidos de uma etapa de enriquecimento como
descrito nos padrões específicos.
9.2.2. Concentração
9.2.2.1. Centrifugação ou filtração em membrana
Caso a enumeração de baixos números de microrganismos seja necessária, esta pode ser melhorada, quanto
à precisão e sensibilidade, introduzindo-se um passo de concentração de amostra. Esta concentração pode ser
alcançada por centrifugação ou filtração em membrana.
Quando da centrifugação, ressuspender o precipitado em um volume conhecido de diluente e proceder com as

análises.
Para cada combinação (alimento+microrganismo) considerada, um estudo (ver e.g. referência [23]) deve ser
previamente realizado para demonstrar se a adição de um passo de concentração é necessário e válido. A
filtrabilidade de uma suspensão alimentícia deve ser avaliada..
1
Quando outros desinfetantes que não o etanol 70% (em volume) forem utilizados, outros tempos de contato, de acordo com as instruções
do fabricante, podem ser necessário para a descontaminação.
34
O desempenho do método em geral, em termos de sensibilidade, seletividade, linearidade e repetibilidade,
devem ser verificados. Caso o nível de contaminação não seja conhecido, o método padrão (sem filtração)
deve ser realizado em paralelo.
9.2.2.2. Imunoseparação
Caso um baixo número de microrganismos alvos esteja presente na amostra, a separação e concentração
podem ser realizadas com esferas imunomagnéticas revestidas com os anticorpos apropriados.
Espalhar as esferas juntamente com os microrganismos capturados, direta ou indiretamente, no meio de

cultura sólido de acordo com o padrão específico. Entretanto, verificar se as esferas imunomagnéticas
revestidas com o anticorpo específico utilizadas neste passo de concentração são adequadas, de acordo com
evidencias em estudos de avaliação publicados na literatura científica específica, preferencialmente
relacionada à microbiologia de alimentos. Esta verificação é especialmente importante caso este procedimento
não tenha sido validado de acordo com a ISO 16140.
10. Enumeração
10.1. Geral
Quando verificando a qualidade microbiológica e/ou segurança de alimentos e produtos de alimentação,

normalmente não é suficiente saber quais microrganismos estão presentes. Na maioria dos casos, o aspecto
quantitativo é igualmente importante, surgindo a necessidade da enumeração dos microrganismos. Isto pode
ser feito de várias maneiras: via análise direta (microscopia), por inoculação de meio sólido ou líquido, com
citometria, por Real-Time PCR, etc. Entretanto, este padrão Internacional apenas irá discorrer sobre a
enumeração usando meios sólidos e líquidos.
A enumeração em meio sólido é baseada na capacidade de muitos microrganismos de produzir colônias sobre
ou dentro de meio ágar de modo a serem reconhecidas a olho nu ou com uso de lupas. Entretanto, caso a
matéria prima contenha muitas partículas que possam interferir na detecção de colônias, ou se a quantidade de
bactérias for muito baixa, este princípio não pode ser utilizado sem a anterior separação dos microrganismos
da matéria-prima (por exemplo por filtração ou imunoseparação). Nestes casos, a enumeração em meio líquido
é uma alternativa adequada.
10.2. Enumeração usando um meio sólido
10.2.1. Geral
A placa de Petri deve ser etiquetada com o número da amostra, diluição, data e quaisquer outras informações
desejadas.
As diluições devem ser selecionadas de modo que as placas contenham o número apropriado de colônias (ver
10.3.1.) e sobrepor qualquer propriedade inibitória.
Usar uma nova pipeta estéril para a transferência de cada diluição, a menos que se trabalhe da mais diluída
para a menos diluída.
10.2.2. Número de placas de Petri por diluição
Para técnicas de enumeração em microbiologia de alimentos, uma placa por diluição deve ser utilizada com
pelo menos duas diluições sucessivas, para laboratórios que operem com controle de qualidade de acordo com
os princípios da ISO 17025. Caso apenas uma diluição seja feita ou se o laboratório não operar com controle
de qualidade, então duas placas devem ser utilizadas de acordo com a ISO 8199.
35
10.2.3. Técnicas de derramamento (Pour plate)
10.2.3.1. Geral
Retirar o volume necessário de diluição a ser analisado, encostando a ponta da pipeta na lateral do tubo para
remover o excesso de líquido aderido ao exterior. Abrir a placa de Petri de modo a permitir a inserção da pipeta
2
e despejar o conteúdo desta. Despejar o meio ágar fundido a 44-47ºC em cada placa de Petri .Evitar adicionar
o meio fundido diretamente no inóculo. Misturar imediatamente o meio fundido com o inóculo de modo a obter
uma distribuição uniforme de microrganismos no meio. Esperar esfriar e solidificar deixando a placa sobre uma
superfície horizontal fria (o tempo de solidificação não deve ultrapassar 10 min).
Após a remoção do ágar fundido do banho-maria, secar a garrafa com uma toalha limpa de modo a evitar que
a água contamine as placas de Petri. Evitar deixar escorrer meio por fora da garrafa ou na tampa da placa de
Petri.
Pode ser necessário manter a garrafa na horizontal, sem assentá-la novamente entre cada derramamento.
Caso a presença de colônias que se espalhem (e.g. Proteus spp.) seja esperada no produto analisado,
sobrepor as placas solidificadas com uma camada de ágar não-nutriente ou ágar idêntico ao meio utilizado no
3
teste , para evitar ou minimizar esse espalhamento.
10.2.4. Inoculação de superfície
10.2.4.1. Geral
Métodos desenvolvidos para produzir crescimento de colônias apenas na superfície do ágar têm certas
vantagens sobre os métodos de derramamento. A morfologia de colônias de superfície é facilmente observada,
melhorando a habilidade do analista em distinguir entre diferentes tipos de colônias.
Microrganismos não são expostos ao calor do ágar fundido, resultando em maiores contagens.
Usar placas pré-preparadas com ao menos 3 mm de espessura de ágar que estejam sem bolhas de ar e
umidade na superfície.
Para facilitar o espalhamento uniforme a superfície deve ser seca de acordo com a ISO/TS 11133 ou com o
especificado no Padrão Internacional relevante de modo que o inóculo seja absorvido em 15 min.
10.2.4.2. Método de espalhamento com espátula
Usando uma pipeta estéril, transferir o inóculo (geralmente 0,1 ml ou 0,5 ml) de uma amostra teste líquida ou
de uma suspensão inicial no caso de outras amostras para uma placa de ágar (de 90 a 140 mm de diâmetro,
respectivamente). Repetir este passo para a próxima diluição decimal (as colônias a serem contadas estão
-1 -2
presentes na diluição 10 no caso de amostras líquidas de material e 10 no caso de outros materiais) e, se
necessário, repetir para as diluições decimais subsequentes.
Caso necessária a detecção de baixas cargas microbianas no caso de certos produtos, o limite de detecção
pode ser aumentado na ordem de 10 vezes analisando-se 1,0 ml de amostra no caso de produtos líquidos e
1,0 ml de suspensão inicial no caso de outros produtos. Para esta finalidade, 1,0 ml de inóculo é espalhado
sobre a superfície de uma placa de Petri grande (140 mm de diâmetro) ou sobre a superfície de três pequenas
placas de Petri (90 mm de diâmetro).
Usando uma espátula de espalhamento feita de vidro, plástico ou metal (por exemplo feita de vidro e com
formato de bastão de hockey de cerca de 3,5 mm de diâmetro e 20 cm de comprimento, dobrada em ângulos
retos a cerca de 3 cm de uma extremidade e achatadas nas pontas por aquecimento), espalhar o inóculo o
2
Geralmente 18 a 20 ml de ágar em 90 ml de placas de Petri, para obter ao menos 3 mm de espessura.
3
Geralmente 5 ml de ágar em placas de Petri de 90 mm.
36
mais rápido possível uniformemente sobre o ágar sem tocar as bordas da placa de Petri. Esperar o ágar
absorver o inóculo com as placas tampadas por cerca de 15 min a temperatura ambiente.
Em certos casos (como descrito no Padrão Internacional relevante), O inóculo pode ser depositado sobre uma
membrana e depois ser espalhado como descrito anteriormente.
10.2.4.3. Método de plaqueamento helicoidal
10.2.4.3.1. Geral
O método de plaqueamento helicoidal para determinação da carga microbiana foi testado em testes
interlaboratoriais com leite e derivados e para outros produtos.
O equipamento utilizado – um semeador helicoidal – está descrito no item 5.24.
10.2.4.3.2. Preparação das placas de ágar
Um dispensador automático com um sistema de distribuição é recomendado para a preparação de placas de

ágar, para garantir que elas estejam niveladas.
Colocar a mesma quantidade de ágar em todas as placas de modo que a mesma altura de ágar esteja
presente em todas as placas submetidas ao bico dosador do semeador helicoidal mantendo o ângulo de
contato correto.
Alternativamente, placas preparadas e disponíveis comercialmente podem ser utilizadas.
10.2.4.3.3. Procedimentos de plaqueamento e contagem
Descontaminar a ponteira e os tubos por imersão em solução de hipoclorito de sódio (ver 5.24.4) e então
enxaguar o sistema com água estéril antes do uso.
Colocar uma placa de Petri com ágar na mesa giratória e baixar a ponteira. A amostra é diferencialmente
distribuída com o subir da ponteira e girar da placa. Retirar a placa inoculada e retornar a ponteira para a
posição inicial. Descontaminar a ponteira e carregar o inóculo para outra placa.
Após a incubação, colocar a grade de contagem em espiral centralizada na placa. Usar a régua de contagem
20 para determinar a contagem. Escolher uma região e começar a contagem de fora para dentro do primeiro
segmento até atingir 20 colônias. Completar a contagem das colônias remanescente deste segmento. Contar
uma área correspondente do outro lado da placa e dividir o número de colônias contadas em ambos os lados
pelo volume depositado nestas áreas. Os volumes de amostra associados com cada porção da grade de
contagem são fornecidos no manual de instruções que acompanha o equipamento.
10.2.5. Incubação
A menos que determinado o contrário em padrão específico, inverter as placas imediatamente após a
inoculação, e colocá-las rapidamente em, uma estufa ajustada para a temperatura adequada. Caso ocorra
desidratação excessiva (e.g. a 55ºC ou em forte circulação de ar), embalar frouxamente as placas em sacolas
antes da incubação ou usar sistema de eficiência similar.
Durante o período de incubação, variações menores na temperatura de incubação podem ser inevitáveis e
aceitáveis, por exemplo, durante o preenchimento ou esvaziamento das estufas, mas é importante que estes
períodos sejam restritos. A duração destas variações deve ser monitorada para garantir que elas não surtem
efeitos nos resultados.
NOTA: Em certos casos, pode ser útil manter placas inoculadas a 3ºC ± 2ºC para serem usadas em comparação com as inoculadas e
incubadas; isto durante a contagem pode evitar a confusão de partículas de produto com colônias. Uma lupa binocular de aumento
também pode ser utilizada para distinguir partículas de produto de colônias.
37
Em certas circunstâncias, pode ser desejável para a organização do trabalho no laboratório refrigerar as placas
inoculadas por no máximo 24h antes da incubação. Caso isto seja feito, o laboratório deve garantir que esta
prática não afeta o resultado de contagem.
Geralmente, placas de Petri não devem ser empilhadas em mais de 6 unidades para incubação anaeróbica e
devem ser separadas umas das outras e das paredes da estufa por no mínimo 25 mm. Entretanto,
empilhamentos maiores com menores espaçamentos são aceitáveis em estufas equipadas com sistemas de
circulação de ar; neste caso, a distribuição da temperatura deve ser verificada.
Após a incubação, as placas devem ser imediatamente analisadas. Elas podem, entretanto, ser armazenadas,
exceto se o contrário seja determinado em padrão específico, por até 48h em refrigerador. Armazenamentos
por períodos de tempo maiores são aceitáveis apenas tiver sido mostrado que isto não afeta o número, a
aparência e subsequente confirmação de colônias. Para certos meios que contém corantes indicadores, as
placas refrigeradas devem ser mantidas a temperatura ambiente até o equilíbrio antes da análise, para garantir
que a correta coloração tenha retornado.
10.3. Cálculo e descrição dos resultados obtidos em meio sólido
10.3.1. Contagem de colônias
Após o período de incubação estabelecido no padrão específico, contar as colônias (colônias totais, típicas ou
presumidas) para cada placa de Petri contendo menos que 300 colônias (ou qualquer outro número
estabelecido no padrão específico).
Quando da contagem de colônias típicas ou presumidas, a descrição das colônias deve ser como a fornecida
no padrão específico.
Em certos casos pode ser difícil contar as colônias (quando, por exemplo, microrganismos que se espalham
estão presentes). Considerar colônias espalhadas como únicas. Caso menos de um quarto da placa apresente
supercrescimento por espalhamento, contar as colônias da parte não afetada da placa e calcular a partir dela o
número total de colônias na placa. Deduzir por extrapolação o número teórico que deve corresponder à placa
inteira. Caso mais de um quarto da placa apresente supercrescimento, descartá-la. Considerar colônias
espalhadas em cadeia como única colônia.
Nos vários métodos de cálculo mostrados em 10.3.2., devem ser consideradas placas sem colônias, quando
estas forem mantidas.
Quando um semeador helicoidal for utilizado, a contagem de colônias será como descrito em 10.2.4.3.3.
10.3.2. Descrição dos resultados
10.3.2.1. Geral
10.3.2.1.1. Casos incluídos neste subitem são casos gerais:
- inoculação de uma placa de Petri de 90 mm por diluição;
- número máximo de colônias para o total de colônias presentes: 300 por placa;
- número máximo total de colônias (típicas e atípicas) presentes na placa quando da contagem de
colônias típicas ou presuntivas: preferencialmente 300 por placa;
- número máximo de contagem de colônias típicas ou presuntivas: 150 por placa;
- número de colônias típicas ou presuntivas inoculadas para identificação ou confirmação (ver 10.3.2.3.)
em cada placa considerada: em geral 5.
Estas situações são definidas em padrões específicos.
38
Quando placas com diâmetro diferente de 90 mm são utilizadas, o número de colônias deve ser aumentado ou
diminuído na proporção da área de superfície das placas (ou membranas).
10.3.2.1.2. Os métodos de cálculo fornecidos abaixo são para casos que ocorrem mais frequentemente quando
os testes são realizados de acordo com as boas práticas laboratoriais. Casos especiais podem eventualmente
ocorrer (por exemplo, a razão de diluição de duas diluições sucessivas serem muito diferentes), então os
resultados de contagem obtidos devem ser analisados por um microbiologista qualificado e, se necessário,
rejeitados.
10.3.2.2. Métodos de cálculo: casos gerais (contagem total de colônias ou de colônias típicas)
Para um resultado ser válido, é necessário contar as colônias em pelo menos uma placa contendo mais de 10
colônias [total de colônias, colônias típicas ou colônias de acordo com os critérios de identificação (ver
10.3.2.3.)].
Calcular o número N de microrganismos presente na amostra teste como uma média ponderada de duas
sucessivas diluições usando a equação (1):
∑
(1)
Onde:
∑C é a soma das colônias contadas nas duas placas selecionadas de duas diluições consecutivas, com ao
menos uma contendo um mínimo de 10 colônias;
V é o volume de inóculo em cada placa, em mililitros;
d é a diluição correspondente à primeira diluição selecionada [d =1 quando o produto líquido não diluído é
selecionado (amostra teste)].
Arredondar os valores calculados para dois algarismos significativos. Sendo assim, caso o terceiro algarismo
seja menor que 5, não modificar a algarismo anterior, mas caso este seja maior que 5, aumentar o algarismo
anterior em uma unidade.
Descrever o resultado preferencialmente como um número entre 1,0 e 9,9 multiplicado pela potência de 10
apropriada, ou como um número completo com dois algarismos significativos.
Descrever os resultados como o número N de microrganismos por mililitro (produtos líquidos) ou por grama
(outros produtos).
EXEMPLO: A contagem produziu os seguintes resultados:

-2
- Na primeira diluição selecionada (10 ): 168 colônias;
-3
- Na segunda diluição selecionada (10 ): 14 colônias.
4
Arredondando o resultado acima, o número de microrganismos é 17.000 ou 1,7 x 10 por mililitro ou por grama
de produto.
10.3.2.3. Método de cálculo: após a identificação
Quando o método utilizado faz uso de identificação, um dado número A (geralmente 5) de colônias presumidas
é identificados de cada placa selecionada para contagem. Após a identificação, calcular para cada placa, o
número a de colônias que atendam ao critério de identificação, usando a equação (2):
39
(2)
Onde:
b é o número de colônias que atendem aos critérios de identificação dentre as colônias identificadas A;
C é o número total de colônias presumidas contadas na placa.
Arredondar os valores calculados para dois algarismos de significativos. Sendo assim, caso o terceiro
algarismo seja menor que 5, não modificar a algarismo anterior, mas caso este seja maior que 5, aumentar o
algarismo anterior em uma unidade.
Calcular o valor N de microrganismos presentes na amostra teste substituindo ∑C por ∑a na equação fornecida
em 10.3.2.2.
Arredondar os resultados como especificado em 10.3.2.2.
Descrever os resultados como especificado em 10.3.2.2.
EXEMPLO: A contagem forneceu os seguintes resultados:

-3
- Na primeira diluição selecionada (10 ): 66 colônias;
-4
- Na segunda diluição selecionada (10 ): 4 colônias.
O teste das colônias selecionadas apresentou os seguintes resultados:
- Das 66 colônias, 8 foram testadas, 6 das quais se apresentaram dentro dos critérios de identificação,
então a = 50;
- Das 4 colônias, todas as 4 apresentaram-se dentro dos critérios de identificação, então a = 4;
4
Arredondando o resultado como especificado em 10.3.2.2., o número de microrganismos é 49.000 ou 4,9 x 10
por mililitro ou por grama de produto.
10.3.2.4. Método de cálculo: Baixas contagens
10.3.2.4.1. Caso em que uma placa contém menos de 10 colônias (de amostra teste ou suspensão inicial
ou primeira diluição)
Contagens de 10 até o limite possível (prático) de colônias de cada método são o intervalo de precisão
excelente. A precisão cai rapidamente à medida que as contagens de colônias ficam abaixo das 10 colônias
por placa. Dependendo do propósito do teste, limites inferiores de determinação podem ser estabelecidos
como descrito abaixo para contagens inferiores a 10.
De acordo com a ISO/TR 13843, a definição de limite de determinação é: “Menor concentração média de
partículas x por porção analítica na qual a incerteza relativa padrão iguala-se a um valor especificado (RSD)”.
O RSD é o desvio padrão relativo, que é calculado pela divisão do desvio padrão estimado s para uma
população de uma amostra pela média ̅ desta amostra. Ao invés de RSD, o símbolo w será utilizado para o
desvio padrão relativo. Então, ⁄ ̅.
No caso de uma distribuição de Poisson, x é calculado pela equação:
(3)
( )
40
Se w é fixado em 50% como limite de precisão relativa aceitável (que parece razoável em microbiologia), o
menor limite de determinação será fornecido pelo número de colônias
( )
Portanto, resultados baseados em contagens menores que 4 devem ser considerados apenas como
indicadores qualitativos de presença.
Resumindo:
Se uma placa contém menos de 10 colônias, mas ao menos 4 colônias, calcular o resultado como caso geral
(10.3.2.2.), e descrever os resultados como número estimado x de microrganismos por mililitro (produtos
líquidos) ou por grama (outros produtos).
Caso o total seja entre 1 e 3, a precisão dos resultados é baixa demais e o resultado deve ser descrito como:
“Microrganismos estão presentes mas em quantidades menores que (4 x d) por grama ou ml”
10.3.2.4.2 Caso em que uma placa não contém colônias (amostra teste ou suspensão inicial ou primeira
diluição)
Caso as placas de amostra teste (produtos líquidos) ou suspensão inicial (outros produtos) ou a primeira
diluição inoculada não contiverem colônias, descrever o resultado como a seguir:
“Menos de 1/d microrganismos por mililitro” (produtos líquidos) ou “menos de 1/d microrganismos por grama”
(outros produtos).
0
Onde d é o fator de diluição da suspensão inicial ou da primeira diluição inoculada (d = 10 = 1 quando a
amostra teste for diretamente inoculada e cuja placa for selecionada).
10.3.2.4.3. Casos especiais
10.3.2.4.3.1. Geral
Estes casos dizem respeito à contagem de colônias típicas ou presuntivas.
10.3.2.4.3.2. Caso 1
Se o número de colônias típicas e atípicas da placa contendo a diluição d1 é maior que 300 (ou qualquer outro
número estabelecido no padrão específico), com colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se a placa
contendo a diluição subsequente d2 contém menos de 300 colônias (ou qualquer outro número estabelecido no
padrão específico), e nenhuma colônia típica ou confirmada visível, descrever os resultados como:
“Menos de 1/d2 e mais que 1/d1 microrganismos por mililitro” (produtos líquidos) ou “menos de 1/d2 e mais que
1/d1 microrganismos por grama” (outros produtos).
Onde d1 e d2 são fatores de diluição correspondentes à diluição d1 e d2.

-2
- A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 100 colônias na placa, com típicas ou confirmadas
presentes;
-3
- A segunda diluição selecionada (10 ): 33 colônias, sem colônias típicas ou confirmadas presentes.
O resultado, expresso em microrganismos, é menos de 1.000 e mais de 100 por mililitro ou por grama de
produto.
41
10.3.2.4.3.3. Caso 2
Se o número de colônias típicas e atípicas da placa contendo a diluição d1 é maior que 300 (ou qualquer outro
número estabelecido no padrão específico), sem colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se a placa
contendo a diluição subsequente d2 contém menos de 300 colônias (ou qualquer outro número estabelecido no
padrão específico), e nenhuma colônia típica ou confirmada visível, descrever os resultados como:
“Menos de 1/d2 microrganismos por mililitro” (produtos líquidos) ou “menos de 1/d2 microrganismos por grama”
(outros produtos).
Onde d2 é o fator de diluição correspondente à diluição d2.

-2
- A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 100 colônias na placa, sem típicas ou confirmadas
presentes;
-3
- A segunda diluição selecionada (10 ): 33 colônias, sem colônias típicas ou confirmadas presentes.
O resultado, expresso em microrganismos, é menos de 1.000 por mililitro ou por grama de produto.
10.3.2.5. Método de cálculo: casos especiais
10.3.2.5.1. Quando o número de colónias contadas (colônias totais, típicas ou presuntivas) é maior que 300 (ou
qualquer outro número estabelecido no padrão específico) na placa da primeira diluição d1, com um número de
colônias (colônias totais, típicas ou que atendam aos critérios de identificação) menor que 10 por placa
contendo a diluição subsequente d2:
- Caso o número de colônias da placa contendo a diluição d1 esteja entre o intervalo de 300 e 334 (a
parte superior do limite de confiança para uma média ponderada igual a 300), usar o método de cálculo
para casos gerais (ver 10.3.2.2.);
- Caso o número de colônias da placa contendo a diluição d1 seja maior que 334 (limite superior do
intervalo de confiança para uma média ponderada igual a 300), levar em consideração apenas a
contagem da diluição d2 e calcular uma contagem estimada (ver 10.3.2.4.), exceto quando um máximo
de 300 colônias foi estipulado para a contagem de colônias, se esta estimativa for menor que 8 (limite
inferior do intervalo de confiança para uma média ponderada igual a 10), uma vez que a diferença entre
as duas diluições é inaceitável.
Os algarismos correspondentes aos intervalos de confiança devem ser adaptados ao número máximo
estabelecido na contagem de colônias.
EXEMPLO 1 – A contagem forneceu os seguintes resultados:
-2
- A primeira diluição selecionada (10 ): 310 colônias;
-3
- A segunda diluição selecionada (10 ): 8 colônias.
Usar o método de cálculo para casos gerais usando placas para as duas diluições selecionadas.
EXEMPLO 2 – A contagem forneceu os seguintes resultados:
-2
- A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 334 colônias;
-3
-3
Relatar uma contagem estimada com base nas colônias contadas na placa da diluição 10 .
EXEMPLO 3 – A contagem (quando um máximo de 300 colônias foi estabelecido para a contagem) forneceu
os seguintes resultados:
-2
- A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 334 colônias;
42
-3
O resultado desta contagem é inaceitável.
EXEMPLO 4 – A contagem (quando um máximo de 150 colônias foi estabelecido para a contagem) forneceu
os seguintes resultados:
-2
- A primeira diluição selecionada (10 ): mais de 167 colônias na placa (limite superior de confiança com
média ponderada igual a 150);
-3
-3
Relatar uma contagem estimada com base nas colônias contadas na placa da diluição 10 .
10.3.2.5.2. Quando o número de colónias contadas (colônias totais, típicas ou presumidas) para cada uma das
placas de todas as diluições inoculadas produz um número maior que 300 (ou qualquer outro número
estabelecido no padrão específico), descrever o resultado como a seguir:
“mais de 300/d” (no caso de total de colônias ou colônias típicas) ou “mais que 300 x b/A x 1/d” (no caso de
colônias confirmadas), expressos em microrganismos por mililitro (produtos líquidos) ou microrganismos por
grama (outros produtos).
Onde:
d é a diluição da última diluição inoculada;
b é o número de colônias que atendem aos critérios de identificação dentre as presuntivas A.
10.3.2.5.3. Quando a placa com a última diluição inoculada contém mais que 10 colônias e menos que 300 (ou
qualquer outro número estabelecido no padrão específico), colônias (colônias totais, típicas ou presumidas),
calcular o número N’ de microrganismos presentes usando a equação (4):
Onde
c é o número de colônias contadas na placa;
V é o volume do inóculo usado em cada placa, em mililitros;
d é a diluição correspondente à selecionada.
Arredondar os valores como especificado em 10.3.2.2.
Descrever os resultados como número N’ de microrganismos por mililitro (produtos líquidos) ou por grama
(outros produtos)
EXEMPLO – A contagem forneceu os seguintes resultados:
-4
- A última diluição selecionada (10 ): 120 colônias.
Portanto,
Arredondando o resultado como especificado em 10.3.2.2., o número N’ de microrganismos é 1.200.000, ou 1,2

6
x 10 por mililitro ou por grama de produto.
10.3.2.6. Medição da incerteza
Ver ISO/TS 19036 para determinações quantitativas.
10.4. Enumeração de bolores e leveduras
43
10.4.1. Geral
Bolores e leveduras podem ser enumerados via técnica de derramamento, que permite uma enumeração mais
fácil, ou por espalhamento na superfície de ágar, que possibilita a maior exposição possível ao oxigênio
atmosférico e evita o estresse térmico do ágar fundido. Placas preparadas devem ser secas antes de
inoculadas (ver ISO/TS 11133).
Alguns bolores e leveduras podem ser infeciosos ou provocar respostas alérgicas, em alguns casos até mesmo
em indivíduos saudáveis. Portanto, é importante tomar bastante cuidado quando se lida com estes
microrganismos. Idealmente as placas devem ser mantidas em estufas, não em salas abertas. As tampas
devem ser removidas apenas quando inevitável, apenas por razões essenciais como a preparação de lâminas
de microscopia. Agulhas flambadas devem ser resfriadas antes de efetuar a transferência, para evitar a
dispersão de conídios e outras células. Bancadas e estufas devem ser desinfetadas frequentemente.
As placas de Petri devem ser incubadas sem ser invertidas e deixadas paradas até o momento da contagem,
uma vez que movimentos podem causar liberação de conídios e desenvolver colônias satélites, fornecendo
uma superestimativa da população.
10.4.2. Contagem de colônias de fungos e leveduras
Placas com 10 a 150 colônias são normalmente contadas. Caso a microbiota consista primariamente de
bolores, selecionar placas que contendo as menores contagens; caso a microbiota consista primariamente de
leveduras, selecionar placas que contendo contagem abaixo do limite superior de confiança.
Caso a identidade das colônias seja duvidosa, examinar bolores úmidos ou linhagens de células de ao menos
5 colônias por amostra para confirmar que bactérias não estão presentes.
10.5. Enumeração usando meio líquido
10.5.1. Princípio
As porções teste são inoculadas em meio líquido que é desenvolvido para permitir o crescimento de um
microrganismo em particular ou um grupo de microrganismos, e frequentemente iniba a proliferação de
microrganismos não desejados.
Para determinar se o crescimento do microrganismo alvo ocorreu, vários critérios podem ser utilizados, e.g.
detecção visual de turbidez, produção de gás, mudanças de coloração, subsequente isolamento de
microrganismos em meio ágar seletivo. A composição do meio de cultura e o critério de discriminação entre
resultados positivos e negativos são definidos pelos padrões específicos correspondentes.
Usando esta abordagem apenas um valor qualitativo pode ser atribuído para cada porção teste, i.e. o resultado
é positivo ou negativo. Para obter uma estimativa da quantidade de microrganismos que estão presentes é
necessário analisar muitas porções teste e usar procedimentos estatísticos para determinar o número mais
provável (NMP).
10.5.2. Inoculação
10.5.2.1. Geral
Se um meio de crescimento seletivo é utilizado, a adição da porção teste não deve reduzir estas propriedades
seletivas (o que culminaria com o crescimento de microrganismos não desejados). Na maioria dos padrões,
informações sobre compatibilidade da matéria-prima e o meio líquido utilizado são descritas no âmbito de
aplicação, mas cuidados devem ser tomados com produtos como pimentas, cacau, sopas, etc. uma vez que
eles podem conter substâncias inibitórias que necessitam da adição de compostos neutralizantes, uso de
fatores de diluição maiores, centrifugação, filtração ou separação imunomagnética para separar os
microrganismos da matéria-prima, mesmo que isto não seja especificado nos padrões correspondentes.
Incompatibilidade pode também ser devido à natureza da matéria-prima: amostras ambientais altamente
44
contaminadas, produtos fermentados e produtos com bactérias probióticas representam desafios maiores aos
microbiologistas que amostras com baixas cargas microbianas. Para estas matrizes problemáticas,
experimentos usando microrganismos representativos devem ser realizados para verificar se o método é
compatível com a matriz.
10.5.2.2. Procedimentos
A menos que contrariamente determinado nos padrões correspondentes, porções teste de volumes menores
ou iguais a 1 ml são normalmente adicionados a cinco a dez vezes de volume de meio de concentração
simples. Porções teste entre 1 ml e 100 ml são normalmente adicionados em volumes iguais de meio de dupla
concentração.
Para volumes maiores que 100 ml, meios mais concentrados devem ser utilizados. Para propósitos especiais,
meio desidratado estéril pode ser dissolvido em amostra resfriada (ou pré-aquecida a 30°C) a ser analisada.
A menos que disposto o contrário, o tempo entre a preparação da primeira diluição e a inoculação do último
tubo, placa de múltiplos poços ou garrafa deve ser menor que 15 min.
Uma nova pipeta estéril deve ser utilizada a cada diluição.
10.5.3. Escolha do sistema de inoculação
A essência do método do NMP é a diluição da amostra de modo que os inóculos conterão algumas vezes, mas
não sempre, microrganismos viáveis. O produto, i.e. o número de inóculos que produzem crescimento em cada
diluição fornecerá uma estimativa da concentração inicial da bactéria na amostra. Para obter estimativas em
intervalos grandes de possíveis concentrações, os microbiologistas utilizam diluições seriadas, incubando
muitos tubos (ou placas, etc.) a cada diluição. O número mais provável (NMP) de microrganismos presentes na
amostra original, e a precisão de estimativa, podem ser calculados por procedimentos estatísticos com base
em números de tubos positivos e negativos observados após a incubação.
Escolher um das várias configurações de NMP de acordo com:

- o número esperado de microrganismos na amostra em análise;
- exigências regulamentais;
- a precisão necessária, e
- quaisquer outras considerações de ordem prática.
A medida da incerteza depende, a grosso modo, do número de porções teste positivas observadas como a
medida de incerteza da contagem de colônias depende do número de colônias em placa. A medida da
incerteza aumenta com a raiz quadrada do número de tubos utilizados. O número de tubos tem que ser
quadruplicado para reduzir a incerteza pela metade. Quando sistemas tem baixo número de tubos, a medida
da incerteza é baixa.
Dependendo do tamanho, porções teste podem ser inoculadas em tubos ou garrafas contendo o meio líquido
necessário. Para pequenas porções, placas de múltiplos poços podem ser utilizadas.
10.5.3.1. Sistema de diluição única
Quando a concentração de microrganismo esperada é pequena ou a variabilidade desta é moderada, o

sistema de inoculação mais apropriado é o de séries únicas de porções testes iguais. Quando a razão entre o
máximo e mínimo número de microrganismos esperados é de cerca de 25, dez porções teste paralelas é o
menor número a ser utilizado funcionalmente; com 50 tubos paralelos, uma razão de 200 é o limite. Exemplos
de diluições únicas para NMPs são fornecidos no Anexo B, Tabelas B.1 a B.4.
10.5.3.2. Sistema de múltiplas diluições
Quando a concentração de microrganismo esperada é desconhecida ou espera-se uma grande variação nesta,
pode ser necessária a inoculação de um sistema com muitas séries de diluições. Inocular um número suficiente
45
de tubos para fornecer resultados positivos e negativos. O número de diluições também depende do método de
cálculo de NMP utilizado. Caso precise utilizar tabelas, os resultados destas diluições devem estar disponíveis
e a configuração do sistema restrito aqueles disponíveis nas tabelas. Com programas computacionais, os
números de diluições e tubos paralelos são irrestritos.
10.5.3.3. Sistemas simétrico de diluições
O mais comum sistema simétrico de diluições para NMP utilizado faz uso de três ou cinco tubos em paralelo
por diluição. A precisão obtida com este sistema cai rapidamente com a diminuição do número de tubos por
diluição. Resultados de um sistema de três tubos são quase que não mais que indicadores da ordem de
grandeza da concentração de microrganismos. Caso uma maior precisão seja necessária, recomenda-se que
cinco ou mais tubos em paralelo sejam utilizados. Exemplos de NMP com três e cinco tubos são fornecidos no
Anexo B, Tabelas B.5 e B.7, respectivamente.
10.5.3.4. Sistemas não simétricos de diluições
Em sistemas não simétricos, os diferentes níveis de diluição não possuem o mesmo número de tubos. Usar
este sistema apenas para estimar número de microrganismos dentro de um intervalo bem definido de
concentrações possíveis. Para exemplo, consultar a ISO 8199.
10.5.4. Incubação
Incubar os tubos, frascos e garrafas inoculadas em uma estufa ou banho-maria. Colocar placas de múltiplos
poços em estufa.
Escolher a duração e temperatura de incubação após consultar o método em padrão específico, uma vez que
este binômio depende do microrganismo ou grupo de microrganismos analisados.
Para alguns microrganismos, um procedimento de incubação de duas etapas e/ou um passo confirmatório
podem ser necessários. Consultar o padrão específico para detalhes.
10.5.5. Interpretação dos resultados
Os critérios que distinguem resultados positivos de negativos variam de acordo com o microrganismo ou grupo
de microrganismos e são definidos nos padrões correspondentes. Usando estes critérios contar e registrar o
número de resultados positivos obtidos com todas as porções teste advindas de uma amostra.
10.5.6. Determinação dos valores de NMP
Há três diferentes possibilidades para determinar o valor de NMP: cálculo com fórmula matemática, consulta de
tabelas de NMP ou utilização de programas de computador específicos. Uma vez que estes são baseados nas
mesmas considerações estatísticas, eles são igualmente válidos. Estes três métodos são detalhados abaixo.
10.5.6.1. Fórmulas matemáticas
O valor aproximado NMP para quaisquer números de diluição e tubos em paralelo são derivados da aplicação
da seguinte equação (adaptada da referência [36]):
Onde:
Zp é o número de tubos positivos;
mr é a massa da amostra de referência, em gramas;
46
ms é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos com reações negativas;
mt é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos.
O NMP é expresso por massa da amostra de referência em gramas (geralmente 1g, algumas vezes 100g).
10.5.6.1.2. Solução “exata” para séries únicas de tubos
O valor NMP para séries únicas de tubos é derivado da fórmula:
[ ]
Onde:
ms é a massa da amostra, em gramas, em cada tubo da série;
ln é o logaritmo natural
n é o número de tubos na série;
zp é o número de tubos com reação positiva.
10.5.6.1.3. Estimativas de precisão para ensaios de diluição única
O limite de confiança de 95% da estimativa do NMP pode ser calculado aproximadamente com a equação:
√ ( )
[ ]
Onde:
x é o limite superior ou inferior de 95% de confiança;
mm é a massa da amostra, em gramas, em cada tubo da série;
ln é o logaritmo natural
n é o número de tubos na série;
zn é o número de tubos com reação negativa.
O sinal de positivo é referente ao limite inferior e o sinal negativo é referente ao limite superior de confiança. A
aproximação não é muito boa quando a maior parte dos tubos é negativa, mas aumenta conforme aumenta a
proporção de tubos positivos.
10.5.6.1.4. Estimativas de precisão para ensaios de múltiplas diluições simétricas
O log10 da incerteza padrão do sistema de NMP de múltiplas diluições pode ser obtido da equação aproximada
[28]
de Cochran :
47
√
Onde:
SE é o erro padrão do log10NMP;
é o fator de diluição entre diluições consecutivas (principalmente 10);
n é o número de tubos por diluição.
Os limites superior e inferior de 95% de confiança podem ser aproximados respectivamente pela multiplicação
e divisão do NMP estimado pelo antilogaritmo de 2 x SE. Este procedimento tende a exagerar o limite superior
de confiança.
10.5.6.2. Tabelas de NMP
10.5.5.2.1. Tabelas para sistemas de diluições únicas
As tabelas B.1. a B.4 (Anexo B) apresentam valores de NMP e de intervalos de confiança de 95% por porção
teste para 10, 15, 20 e 25 tubos paralelos cada tubo é inoculado com a mesma diluição (única)].
Para expressar os resultados por massa de amostra de referência (ou volume para amostras líquidas),
multiplicar o NMP e os valores limites de 95% pela razão (massa de referência)/(massa da porção teste). Não
multiplicar a incerteza padrão logarítmica. A massa de referência em microbiologia de alimentos é normalmente
1 g. A massa de porção teste corresponde à quantidade de amostra (em gramas) que está presente em um
-1
volume usado para inocular os tubos, e.g. 0,1 g se foi utilizado 1 ml de homogeneizado a 10 .
EXEMPLO (Referência [30])
Vinte tubos com caldo de concentração dupla foram inoculados com alíquotas de 5 ml de amostra diluída dez
vezes (0,1 g/ml). Após a incubação, 16 dos tubos apresentaram crescimento visível. Qual foi a densidade
bacteriana mais provável (organismos por grama) na amostra? A Tabela B.3 apresenta 1,61 como o número
mais provável de microrganismos por tubo, com o limite inferior de 0,93 e superior de 2,77 com a confiança de
95%.
Cada tubo recebeu uma porção teste de 5 ml, que corresponde a 0,5 g de amostra. Então, o número mais
provável de microrganismos em 1 g de amostra é dado por:
por grama = 3,2 por grama
Com o intervalo de confiança de 95% variando de:
10.5.6.2.2. Tabelas para sistemas de múltiplas diluições: três diluições sucessivas
Com sistemas simétricos, é uma prática comum utilizar três diluições sucessivas com réplicas de três tubos
(Tabela B.5.) ou cinco tubos (Tabela B.7.) cada uma. Registrar o número de resultados positivos para cada
grupo de tubos e, a partir da tabela de NMP para o sistema utilizado, ler o número mais provável de
microrganismos presentes no volume de referência da amostra.
48
Algumas combinações de tubos positivos são mais comuns de ocorrer que outras. Por exemplo, a combinação
de resultados positivos 0, 0, 3 é muito menos comum de ocorrer que a 3, 2, 1. Para quantificar esta
probabilidade, foi atribuída uma categoria a todos as combinações possíveis de resultados positivos, variando
de 0 a 3. A categoria 1 de resultado é um resultado com maior probabilidade, enquanto a categoria 3 de
resultado é rara e pode ser de difícil reprodução. Os piores casos são os da categoria 0 de resultados; eles
devem ser considerados suspeitos. Assumindo que os resultados de análise estejam corretos, seria de se
esperar que 95% dos resultados fossem incluídos na categoria 1, 4% na categoria 2, 0,9% na categoria 3 e
apenas 0,1% na categoria 0. As categorias são posteriormente explicadas na Tabela B.6.
Nos casos em que mais de 3 diluições são feitas, a seleção da combinação correta de 3 diluições consecutivas
não é sempre muito clara. Entretanto, isto pode ser facilmente feito registrando-se todas as possíveis
combinações de tubos positivos e lendo a categoria correspondente na Tabela B.5.
Então, aplicar as seguintes regras:
1) Selecionar a combinação de três diluições consecutivas tendo o perfil de categoria 1 para obter o
índice NMP. Caso mais de uma combinação pertencente à categoria 1 seja obtido, usar o que possui o
maior número de tubos positivos.
2) Caso não haja combinações pertencentes à categoria 1, usar uma tendo o perfil de categoria 2. Caso
mais de uma combinação pertencente à categoria 2 seja obtido, usar o que possui o maior número de
tubos positivos.
3) Caso não haja combinações pertencentes à categoria 2, usar uma tendo o perfil de categoria 3. Caso
mais de uma combinação pertencente à categoria 3 seja obtido, usar o que possui o maior número de
tubos positivos.
Alguns exemplos são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1 – Exemplos de seleção de resultados positivos para cálculo de NMP

NMPb
Número de tubos positivos obtidos em três tubos incubados para as seguintes
Amostra Produto Outros
quantidades de amostra inoculada por tubo a
líquido (ml-1) produtos (g-1)
Produto líquido: 10 ml 1 ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml
Outros produtos: 1g 10-1 g 10-2 g 10-3 g 10-4 g
1 3 3 2 1 0 1,1 x 101 1,1 x 102
2 3 3 3 0 2,4 x 101 2,4 x 102
3 2 2 1 1 0 7,4 7,4 x 101
4 3 3 0 0 0 2,4 2,4 x 101
-1
5 2 2 0 1 0 2,1 x 10 2,1
a
Sublinhados indicam as combinações selecionadas
b
Calculado usando o índice NMP (ver Tabela B.5.)
10.5.6.3. Programas de computador
Os programas mais versáteis de computador não aplicam restrições referentes a número de diluições e tubos
paralelos ou simetria dos sistemas NMP. NPM Assay Analyzer é um programa disponível baseado em
programas prévios (ver Referência [29]).
10.5.7. Descrição dos resultados
49
A partir do índice NMP mostrado na tabela B.5. [de acordo com a combinação de três (ou cinco) diluições
consecutivas selecionadas], determinar o número mais provável de microrganismos em um volume de
referência.
Relatar os resultados como número mais provável de microrganismos (ou grupo específico de microrganismos)
por grama ou mililitro. A massa ou volume de referência pode ser diferente de g ou ml (por exemplo 100 g ou
100 ml).
11. Método de detecção (método qualitativo)
11.1. Geral
O método de detecção é um método que determina a presença ou ausência de um microrganismo em

particular em uma dada quantidade de produto.
11.2. Princípio
A menos que o contrário seja determinado em Padrão Internacional específico, misturar (produtos líquidos) ou
homogeneizar (outros produtos) uma quantidade P de produto a ser analisado em 9 x P ml ou 9 x P g de um
caldo seletivo e/ou eletivo.
Para facilitar a recuperação de microrganismos estressados em alimentos, amostras são normalmente pré-
enriquecidas em caldo seletivo seguido por enriquecimento seletivo e isolamento em meio ágar
seletivo/diferencial. O uso de dois diferentes caldos de enriquecimento, assim como dois ou mais meios ágar
seletivos, aumenta a sensibilidade do método.
Após a incubação espalhar uma alça de meio de cultura obtido sobre a superfície de um meio ágar seletivo de
modo a obter colônias isoladas. A menos que o contrário seja determinado, os caldos de enriquecimento
podem ser refrigerados apenas se o impacto da refrigeração sobre os resultados tenha sido avaliado devendo
ser claramente descrito em relatório de análise.
Um número (geralmente cinco por placa) de colônias obtidas após a incubação é então identificado usando as
técnicas de confirmação apropriadas.
A seleção de colônias para confirmação deve cobrir colônias suspeitas.
11.3. Medição de incertezas
A estimativa da incerteza de medição em determinações qualitativas encontra-se em estudo pela ISO/TC

34/SC 9.
12. Métodos de confirmação
12.1. Geral
Usar apenas culturas puras para confirmação bioquímicas e sorológicas.
Os testes confirmatórios de referência são descritos nos Padrões específicos. Como alternativa para testes
bioquímicos descritos nestes padrões específicos, métodos de confirmação descritos neste item (galerias
bioquímicas, sondas de ácidos nucléicos) podem ser utilizados nas condições descritas neste item, a menos
que o contrário seja determinado em Padrão Internacional específico.
12.2. Preparação de cultura pura
50
Começar a seleção de uma cultura pura pela seleção de uma colônia única sobre ou dentro do ágar. Inocular
então a colônia selecionada em um ágar não seletivo. Após a incubação, selecionar uma colônia bem isolada
para testes subsequentes de confirmação. Repetir a operação caso necessário.
Se possível, os testes de confirmação devem ser realizados usando uma única colônia. Caso não haja material
celular suficiente em uma colônia, ela deve ser subcultivada em meio líquido ou em ágar inclinado, após a qual
os testes confirmatórios podem ser utilizados.
12.3. Coloração de Gram (técnica de Hucker modificada)
12.3.1. Geral
Este meio de coloração de células bacterianas permite a descrição da morfologia da bactéria e classificação
delas em dois grupos em função de capacidade de reter o corante cristal violeta (Gram +) nas condições de
teste. Esta divisão de resultados baseia-se principalmente nas diferenças estruturais das paredes celulares dos
dois grupos e isto coincide com outras grandes diferenças entre os grupos.
Uma alternativa satisfatória à coloração de Gram é a utilização de 3% de solução de hidróxido de potássio

(KOH). Uma alçada cheia de bactéria é misturada com duas gotas de solução de KOH. Bactérias Gram-
negativas tornaram a solução viscosa e mucoide em 30 segundos, a ponto de formar fio quando do
afastamento da alça.
Há diversas maneiras de realizar a coloração de Gram, mas todas seguem a mesma sequencia abaixo.
12.3.2. Soluções
12.3.2.1. Geral
Soluções comercialmente disponíveis podem ser utilizadas.
Neste caso, seguir as recomendações do fabricante.
12.3.2.2. Solução de cristal violeta
12.3.2.2.1. Composição
Cristal violeta 2,0 g
Etanol (95%) 20 ml
Oxalato de amônio (C2H8N2O4) 0,8 g
Água 80 ml
12.3.2.2.2. Preparação
Dissolver o cristal violeta em etanol, e oxalato de amônio em água destilada. Misturar as duas soluções e
reservar a mistura por 24 antes do uso.
12.3.2.3. Solução de lugol
Iodo 1,0 g
Iodeto de potássio (KI) 2,0 g
Água 100 ml
51
Dissolver o iodeto de potássio em 10 ml de água e adicionar o iodo em frações. Após a dissolução, completar
para 100 ml em um recipiente volumétrico.
12.3.2.4. Solução de safranina
Safranina 0,25 g
Etanol (95%) 10 ml
Água 100 ml
Dissolver a safranina em etanol e então misturar com água destilada.
12.3.3. Técnica de coloração
Após a fixação por calor de um filme bacteriano em uma lâmina de microscopia preparada com uma cultura de
18h a 24h ou quando o caldo está turvo, cobrir o filme com cristal violeta. Deixar por 1 min.
Enxaguar gentilmente a lâmina inclinada com água por alguns segundos.
Cobrir a lâmina com solução de lugol. Deixar por 1 min.
Enxaguar gentilmente a lâmina inclinada com água por alguns segundos.
Despejar gentil e continuamente um filme de etanol 95% sobre a lâmina inclinada por não mais que 30
segundos até que não seja mais vista a coloração violeta.
Gentilmente enxaguar a lâmina inclinada com água para eliminar o etanol. Cobrir a lâmina com a solução de
safranina por 10 segundos. Enxaguar gentilmente a lâmina inclinada com água.
Secar a lâmina.
12.3.4. Interpretação
Observar a lâmina com uma objetiva imersão de alto poder em microscópio. As células bacterianas que
aparecerem azuis ou violetas são chamadas Gram-positivas, enquanto aquelas coradas em rosa escuro ou
vermelho são chamadas Gram-negativas.
Para culturas puras de certas bactérias, células Gram-negativas e Gram-positivas podem estar presentes no
mesmo campo.
NOTA: Culturas densas de células podem fornecer repostas não características.
12.4. Uso de galerias bioquímicas para identificação
Galerias bioquímicas disponíveis podem ser utilizadas para identificação de colônias isoladas.
Verificar se as galerias são adequadas, de acordo com estudos de avaliação publicados na literatura científica
4
internacional, preferencialmente relacionadas a microbiologia de alimentos . Esta verificação é especialmente
importante caso o fabricante não tenha dados de validação destas galerias.
4
Pedidos de informação devem ser enviados ao centro de referência nacional, regional ou internacional indicado para cada microrganismo.
52
O laboratório deve obter o certificado de controle para cada lote, com a identificação das linhagens testadas.
O fabricante deve também especificar a linhagem controle que o laboratório pode usar para verificar a
preservação do desempenho das galerias.
As galerias devem incluir, minimamente, testes bioquímicos descritos em padrões específicos ou

suplementados por outros testes.
12.5. Uso de sondas nucléicas para identificação
Sondas nucléicas atualmente disponíveis podem ser utilizadas para identificação de colônias isoladas.
Entretanto, verificar se as sondas nucleicas são adequadas, de acordo com estudos de avaliação publicados
na literatura científica internacional, preferencialmente relacionadas a microbiologia de alimentos (ver e.g.
Referência [23]). Esta verificação é especialmente importante caso o fabricante não tenha dados de validação
destas galerias.
O fabricante deve também especificar a linhagem controle que o laboratório pode utilizar para verificar a
manutenção do desempenho da sonda.
12.6. Métodos sorológicos
12.6.1. Geral
Quando a confirmação sorológica é necessária, realiza-la após a identificação bioquímica de colônias isoladas.
12.6.2. Testes de aglutinação em lâmina
Reações antígeno-anticorpo aglutinam células produzindo massas de flocos ou grânulos densos. No caso de
bactérias da família Enterobacteriaceae, a reação entre antígeno “H” (i.e. flagelar) e este antissoro homólogo
resulta em floculação, enquanto a reação envolvendo o antígeno “O” (i.e. somático) resulta em grânulo mais
denso.
Antes da aglutinação com o antissoro, um teste deve ser realizado para determinar se as células da bactéria
aglutinam em solução de cloreto de sódio [3%(em massa)]. Caso as células bacterianas aglutinem, a linhagem
é auto-agregativa e não deve ser aglutinada com antissoro.
Antissoros comercialmente disponíveis são de dois tipos: antissoros polivalentes que reagem com
microrganismos de um gênero em particular ou com um grupo de sorovares e que são adequados para uma
varredura preliminar, e anticorpos monoclonais específicos, os quais permitem a identificação de sorovares
particulares.
O laboratório deve obter o certificado de controle para cada lote de antissoro, com a identificação das linhagens
testadas.
Verificar se o teste de aglutinação em lâmina é adequado, de acordo com estudos de avaliação publicados na
5
literatura científica internacional, preferencialmente relacionadas a microbiologia de alimentos .
Quando da utilização dos reagentes, controles positivos e negativos adequados devem ser utilizados.
12.6.3. Teste de aglutinação com látex
5
Pedidos de informação devem ser enviados ao centro de referência nacional, regional ou internacional indicado para cada microrganismo.
53
Um método mais rápido e comercialmente disponível, empregando partículas de látex encapadas com
anticorpos grupo-específicos (e.g. Escherichia coli O157, ver o padrão específico ISO 16654, ou
Staphylococcus aureus na ISO 6888). O antígeno no extrato é testado contra diversos reagentes em látex.
Verificar se o teste de aglutinação com látex é adequado, de acordo com estudos de avaliação publicados na
5
literatura científica internacional, preferencialmente relacionadas a microbiologia de alimentos .
Quando da utilização dos reagentes, controles positivos e negativos adequados devem ser utilizados.
13. Relatório de análise
O relatório de análise deve especificar o método utilizado, a temperatura de incubação, se necessário, e o

resultado obtido. Ele deve mencionar também quaisquer detalhes operacionais não especificados neste Padrão
Internacional, bem como aqueles considerados opcionais, junto de detalhes de eventuais incidentes que
possam surtir efeito sobre os resultados.
Determinar no relatório se análises posteriores devem ser realizadas por laboratórios de referência ou, no caso
destes testes terem sido realizados, fora, de onde vieram esses resultados.
O relatório de análise deve incluir toda informação para a identificação completa da amostra. Também é
apropriado incluir toda informação necessária para a interpretação do resultado das análises.
Se necessária, a medição de incerteza, determinada de acordo com a ISO/TS 19036, deve ser incluída no
relatório de análise.
14. Validação dos métodos microbiológicos
14.1. Validação de métodos de referência
A validação dos métodos de referência está sendo realizada pela ISO/TC 34/SC 9.
14.2. Validação de métodos alternativos
Consultar a ISO 16140 para protocolos técnicos de validação de métodos alternativos em relação aos métodos
de referência.
14.3. Validação de métodos internos
A validação dos métodos internos está sendo realizada pela ISO/TC 34/SC 9.
15. Certificação de qualidade de resultados/controle de qualidade de desempenho
15.1. Controle interno de qualidade
15.1.1. O controle interno de qualidade consiste em todos os procedimentos tomados pelo laboratório para a
avaliação contínua de seu trabalho. O objetivo principal é garantir a consistência dos resultados no dia-a-dia e
sua conformidade com critérios bem definidos.
15.1.2. Um programa de verificações periódicas é necessário para demonstrar que a variabilidade (entre
análises, equipamentos e materiais) está sob controle. Todas as análises do âmbito de atividades do
laboratório precisam ser englobadas.
O programa pode envolver:
54
- o uso de amostras enriquecidas, com variáveis níveis de contaminação, incluindo microbiota alvo e
acompanhante;
- o uso de amostras enriquecidas ou naturalmente contaminadas de diferentes tipos de matrizes;
- o uso de materiais de referência (incluindo materiais esquemáticos de testes de proficiência);
- testes repetidos;
- avaliações repetidas de resultados de testes.
O intervalo entre estas averiguações é influenciado pela natureza dos testes realizados pelo laboratório e
frequência em que estes testes são realizados.
Recomenda-se que, se possível, os testes devem incluir controles para monitorar o desempenho.
15.1.3. Em casos especiais, um laboratório pode realizar um teste em particular apenas ocasionalmente. É
reconhecido que, em tais casos, um programa interno contínuo de controle de qualidade pode não ser
apropriado e que um projeto para demonstração de desempenho satisfatório realizado em paralelo com o teste
pode ser mais adequado.
15.2. Linhagens de referência
Consultar a ISO 11133 para a manutenção de linhagens de referência.
15.3. Avaliação externa de qualidade (teste de proficiência)
Os laboratórios devem participar regularmente de testes de proficiência que são relevantes para suas
atividades. Deve-se dar preferência a testes de proficiência que utilizem as matrizes apropriadas.
Os laboratórios devem utilizar avaliação externas de controle de qualidade não apenas para verificar os
desvios do laboratório, mas também para verificar a validade global de seu sistema de qualidade.
55
ANEXO A
(Informativo)
Propriedades de alguns desinfetantes
Tabela A.1. – Propriedades de alguns desinfetantes

Ativo contra Inativado por Toxicidade
Bacteria
Desinfetante Myco- Vírus Vírus não Materiais Materiais Água
Fungi Gram Gram Esporos Proteína Detergente Pele Olhos Pulmões
bacteria envelopados envelopados naturais sintéticos dura
positivas negativas
Hipocloritos + +++ +++ ++ ++ + + +++ + + + C + + +
Álcoois - +++ +++ +++ - + V + + + + - +
Formaldeído +++ +++ +++ +++ +++a + + + + + + - + + +
Glutaraldeído +++ +++ +++ +++ +++b + + NA + + + NA +++ +++ +++
Iodóforos +++ +++ +++ +++ + + + +++ + + + A + + -
+++ Bom
++ Regular
+ Fraco
- Nulo
V Depende do vírus
C Catiônico
A Aniônico
NA Não aplicável
a
Acima de 40°C
b
Acima de 20°C
Fonte: Referência [17]
56
ANEXO B
(Normativo)
Determinação de número mais provável (NMP)
Tabela B.1. – Valores de NMP por porção teste e limites de confiança para 95% para séries de 10 tubos,
calculados de acordo com a Referência [29].
Série de tubos
Número de tubos
Incerteza padrão Limites a 95%
positivos NMP
do log10 NMP Inferior Superior
1 0,11 0,435 0,02 0,75
2 0,22 0,308 0,06 0,89
3 0,36 0,252 0,11 1,11
4 0,51 0,220 0,19 1,38
5 0,69 0,198 0,28 1,69
6 0,92 0,184 0,40 2,10
7 1,20 0,174 0,55 2,64
8 1,61 0,171 0,75 3,48
9 2,30 0,179 1,03 5,16
Série de 15 tubos
Número de tubos
positivos NMP
1 0,07 0,434 0,01 0,49
2 0,14 0,307 0,04 0,57
3 0,22 0,251 0,07 0,69
4 0,31 0,218 0,12 0,83
5 0,41 0,196 0,17 0,98
6 0,51 0,179 0,23 1,15
7 0,63 0,167 0,30 1,33
8 0,76 0,157 0,37 1,55
9 0,92 0,150 0,47 1,80
10 1,10 0,144 0,57 2,11
11 1,32 0,141 0,70 2,49
12 1,61 0,139 0,86 3,02
13 2,01 0,142 1,06 3,82
14 2,71 0,155 1,35 5,45
57
Série de 20 tubos
Número de tubos
positivos NMP
1 0,05 0,434 0,01 0,36
2 0,11 0,307 0,03 0,42
3 0,16 0,251 0,05 0,50
4 0,22 0,218 0,08 0,60
5 0,29 0,195 0,12 0,69
6 0,36 0,178 0,16 0,80
7 0,43 0,165 0,20 0.91
8 0,51 0,155 0,25 1,03
9 0,59 0,147 0,31 1,16
10 0,69 0,140 0,37 1,30
11 0,80 0,134 0,44 1,46
12 0,92 0,130 0,51 1,65
13 1,05 0,126 0,59 1,85
14 1,20 0,123 0,69 2,10
15 1,39 0,121 0,80 2,40
16 1,61 0,121 0,93 2,77
17 1,90 0,122 1,09 3,29
18 2,30 0,127 1,30 4,08
19 3,00 0,141 1,58 5,67
58
Série de 25 tubos
Número de tubos
positivos NMP
1 0,04 0,434 0,01 0,29
2 0,08 0,307 0,02 0,33
3 0,13 0,251 0,04 0,40
4 0,17 0,217 0,07 0,47
5 0,22 0,195 0,09 0,54
6 0,27 0,178 0,12 0,61
7 0,33 0,165 0,16 0,69
8 0,39 0,154 0,19 0,77
9 0,45 0,146 0,23 0,86
10 0,51 0,139 0,27 0,96
11 0,58 0,133 0,32 1,06
12 0,65 0,128 0,37 1,16
13 0,73 0,123 0,42 1,28
14 0,82 0,119 0,48 1,41
15 0,92 0,116 0,54 1,55
16 1,02 0,113 0,61 1,70
17 1,14 0,111 0,69 1,88
18 1,27 0,109 0,78 2,09
19 1,43 0,108 0,88 2,33
20 1,61 0,108 0,99 2,62
21 1,83 0,109 1,12 2,99
22 2,12 0,111 1,29 3,50
23 2,53 0,117 1,49 4,28
24 3,22 0,123 1,77 5,85
59
Tabela B.5. – Índices MNP e limites de confiança (95%) quando três porções testes de 1 g (ml), três de
0,1 g (ml) e três de 0,01 g (ml) são utilizadas.
Limites de confiança (95%)a,c
Número de resultados positivos Índice NMPa Categoriab
Limite inferior Limite superior
0 0 0 < 0,30 0,00 0,94
0 0 1 0,30 3 0,01 0,95
0 1 0 0,30 2 0,01 1
0 1 1 0,61 0 0,12 1,7
0 2 0 0,62 3 0,12 1,7
0 3 0 0,94 0 0,35 3,5
1 0 0 0,36 1 0,02 1,7
1 0 1 0,72 2 0,12 1,7
1 0 2 1,1 0 0,4 3,5
1 1 0 0,74 1 0,13 2
1 1 1 1,1 3 0,4 3,5
1 2 0 1,1 2 0,4 3,5
1 2 1 1,5 3 0,5 3,8
1 3 0 1,6 3 0,5 3,8
2 0 0 0,92 1 0,15 3,5
2 0 1 1,4 2 0,4 3,5
2 0 2 2,0 0 0,5 3,8
2 1 0 1,5 1 0,4 3,8
2 1 1 2,0 2 0,5 3,8
2 1 2 2,7 0 0,9 9,4
2 2 0 2,1 1 0,5 4
2 2 1 2,8 3 0,9 9,4
2 2 2 3,5 0 0,9 9,4
2 3 0 2,9 3 0,9 9,4
2 3 1 3,6 0 0,9 9,4
3 0 0 2,3 1 0,5 9,4
3 0 1 3,8 1 0,9 10,4
3 0 2 6,4 3 1,6 18,1
3 1 0 4,3 1 0,9 18,1
3 1 1 7,5 1 1,7 19,9
3 1 2 12 3 3 36
3 1 3 16 0 3 38
3 2 0 9,3 1 1,8 36
3 2 1 15 1 3 38
3 2 2 21 2 3 40
3 2 3 29 3 9 99
3 3 0 24 1 4 99
3 3 1 46 1 9 198
3 3 2 110 1 20 400
3 3 3 > 110
a
Fonte: Referência [27]
b
Ver Tabela B.6.
c
Os limites de confiança fornecidos nesta tabela são apenas para fornecer alguma ideia da influência de variações estatísticas
nos resultados. Sempre haverá também outras fontes de variação, que podem algumas vezes ser até mesmo mais importantes.
60
Tabela B.6. – Explicação da categoria de resultados
Categoria a Definição
Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um dos que têm grandes
1 probabilidades de ser obtido. Há no máximo 5% de chances de obter um resultado menos provável que a menor
probabilidade nesta categoria.
Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um dos que têm menor
2 probabilidade de ser obtido, menos ainda que o menos provável da categoria 1, mas há no máximo 1% de
probabilidade de se obter um resultado menos provável do que a uma menor probabilidade nesta categoria.
3 probabilidade de ser obtido, menos ainda que o menos provável da categoria 2, mas há no máximo 0,1% de
probabilidade de se obter um resultado menos provável do que a uma menor probabilidade nesta categoria.
0 probabilidade de ser obtido, menos ainda que o menos provável da categoria 3. Há apenas 0,1% de chance de se
obter um resultado nesta categoria, sem que algo esteja errado.
a
Antes de começar o teste, deve ser decidido quais categorias devem ser aceitáveis, isto é, apenas 1, 1 e 2 ou até mesmo 1, 2 e 3.
Quando a decisão a ser tomada com base nos resultados é de grande importância, apenas resultados na a categoria 1, ou no máximo a
categoria 2,devem ser aceitos. Os resultados na categoria 0 devem ser considerados de grande suspeita.
61
Tabela B.7. – Valores de NMP por grama de amostra e limites de confiança de 95% (quando cinco
porções teste de 1 g, cinco de 0,1 g e cinco de 0,01 g são utilizados).
Número de tubos apresentando resultados positivos Limites de confiança de 95%

NMP (por grama)
5 de 1 g 5 de 0,1 g 5 de 0,01 g Inferior Superior
0 0 0 <0,2 < 0,1 0,7
0 1 0 0,2 < 0,1 0,7
0 2 0 0,4 < 0,1 1,1
1 0 0 0,2 < 0,1 0,7
1 0 1 0,4 < 0,1 1,1
1 1 0 0,4 < 0,1 1,1

1 1 1 0,6 < 0,1 1,5
2 0 0 0,5 < 0,1 1,3
2 0 1 0,7 0,1 1,7
2 1 0 0,7 0,1 1,7
2 1 1 0,9 0,2 2,1

2 2 0 0,9 0,2 2,1
2 3 0 1,2 0,3 2,8
3 0 0 0,8 0,1 1,9
3 0 1 1,1 0,2 2,5
3 1 0 1,1 0,2 2,5

3 1 1 1,4 0,4 3,4
3 2 0 1,4 0,4 3,4
3 2 1 1,7 0,5 4,6
3 3 0 1,7 0,5 4,6
4 0 0 1,3 0,3 3,1

4 0 1 1,7 0,5 4,6
4 1 0 1,7 0,5 4,6
4 1 1 2,1 0,7 6,3
4 1 2 2,6 0,9 7,8
4 2 0 2,2 0,7 6,7

4 2 1 2,6 0,9 7,8
4 3 0 2,7 0,9 8
4 3 1 3,3 1,1 9,3
4 4 0 3,4 1,2 9,3
62
Tabela B.7. (Continuação)
Número de tubos apresentando resultados positivos Limites de confiança de 95%
NMP (por grama)
5 de 1 g 5 de 0,1 g 5 de 0,01 g Inferior Superior
5 0 0 2,3 0,7 7
5 0 1 3,1 1,1 8,9
5 0 2 4,3 1,5 11
5 1 0 3,3 1,1 9,3
5 1 1 4,6 1,6 12
5 1 2 6,3 2,1 15
5 2 0 4,9 1,7 13
5 2 1 7 2,3 17
5 2 2 9,4 2,8 22
5 3 0 7,9 2,5 19
5 3 1 11 3,1 25
5 3 2 14 3,7 34
5 3 3 18 4,4 50
5 4 0 13 3,5 30
5 4 1 17 4,3 49
5 4 2 22 5,7 70
5 4 3 28 9 85
5 4 4 35 12 100
5 5 0 24 6,8 75
5 5 1 35 12 100
5 5 2 54 18 140
5 5 3 92 30 320
5 5 4 160 64 580
5 5 5 > 180 - -
63
Bibliografia
[1] BELL, C., NEAVES, P. and WILLIAMS, A. P. Food microbiology and laboratory practice, Blackwell
Science Ltd, Oxford, UK (2005)
[2] ISO 9001, Quality management systems – Requirements
[3] EA-Guidelines for the use of computers and computer systems in accredited laboratories, European
cooperation for Accreditation (1998)
[4] EA-4/10, Accreditation for microbiological laboratories, European cooperation for Accreditation (2002)
[5] Food microbiology program requirements, based upon the FLAWG document United States
accreditation criteria for laboratories performing food microbiological testing, American Association for
Laboratory Accreditation (A2LA) (1998)
[6] AS 1766, Australian standard methods for the microbiological examination of food – Part 1: General
techniques and procedures update
[7] BUTTIAUX, R., BEERENS, H. and TACQUET, A. Manuel de techniques bactériologiques, Éditions
th
Médicales Flammarion (4 edn,)
[8] APHA Technical Committee on Microbiological Methods for Foods. Compendium of methods for the
nd
microbiological examination of foods, 2 edition, Speck, M. L., editor. Intersociety/Agency Committee
on Microbiological Methods for Foods, American Public Health Association, Washington, DC, 1984
th
[9] CRUICKSHANK, et al., Medical microbiology, Vol.2, 12 edn., Churchill-Livingstone, Edinburgh (1975)
[10] D’AOUST, J. Y. Psychrotrophy and foodborne Salmonella. Int. J. Food Microbiol. 1991, 13, pp. 207-16
[11] D’AOUST, J. Y., SEWELL, A. M., and McDONALD, C. Recovery of Salmonella spp. From refrigerated
pre-enrichment cultures of dry food composites, J. AOAC. Int., 78, pp. 1322-7
[12] D’AOUST, J. Y., SEWELL, A. M., and GRECO, P. Detection of Salmonella in dry foods using
refrigerated pre-enrichment and enrichment broth cultures: summary of collaborative study. J. AOAC.
Int., 1994, 77, pp.1490-1
[13] D’AOUST, J. Y., SEWELL, A. M., and GRECO, P. Detection of Salmonella in dry foods using
refrigerated pre-enrichment and enrichment broth cultures – Interlaboratory study, J. AOAC. Int., 1993,
76, pp.814-21.
[14] DALSGAARD, A., GUARDABASSI, L., LUND, C. BAGGE, L. and GRAVESEN, J. Opbevaring af
badevands-og drikkevandsprØver ved 0-5°C I et dØgn medfØrer en significant reduction I antal
Escherichi coli og kimtal, Dansk. Vet. 2002 17, pp. 1-9
[15] HARREWIJIN, G. A. and HARTOG, B. J. Guidelines to perform microbiological analyses of food and
food products (“Good laboratory practice”), De Ware(n)-Chemicus 1979, 9, pp.1-11
[16] MUIR, G. D., ed. Hazards in the chemical laboratory, Royal Institute of Chemistry, London (1971)
[17] Laboratory biosafety manual, WHO, Geneva, 1993
[18] LIGHTFOOT, N. F., MAIER, E. A. (eds). Microbiological analysis of food and water – Guidelines for
quality assurance. Elsevier, Amsterdam, Netherlands (1998)
[19] HARRIGAN, W. F. and McCANCE, M. E. Laboratory methods in food and dairy microbiology, Academic
Press (1976)
64
[20] Laboratory safety at the Centers for Disease Control (CDC), NHEW Publication No. CDC 79-8118,
Atlanta, 1979
[21] Laboratory safety at the Centers for Disease Control (CDC),US Dept of Health, Education and Welfare
(Public Health Service), Atlanta, 1979
[22] GERHARDT, P., MURRAY, R. G. E., COSTILLOW, R. N., NESTER, E. W., KRIEG, N. R. and
PHILLIPS, G. B. eds. Manual of methods for general bacteriology. American Society for Microbiology,
Washington, DC 20006 (1981)
[23] GNANOU BESSE, N., AUDINET, N., BEAUFORT, A., COLIN, P., CORNU, M. and LOMBARD, B. A
contribution to the improvement of Listeria monocytogenes enumeration in cold-smoked salmon. Int. J.
Food Microbiol. 2004, 91, pp. 119-27
[24] Microbiological testing laboratory accommodation guidelines, National Association of Testing

Authorities, Australia
[25] Microorganisms in food – 1: Their significance and methods of enumeration, ICMSF, University of
Toronto Press (1968 update)
[26] SHAPTON, D. A., BOARD, R. G. and HAUSTER, W. J. eds. Safety in microbiology, Society for Applied
Bacteriology Technical Series No. 1 and No. 6, Academic Press (1972)
[27] DE MAN, J. C. MPN tables (corrected), Eur. J. Appl. Biotechnol. 1983, 17, pp. 301-5
[28] COCHRAN, W. G. Estimation of bacterial densities by means of the “Most Probable Number”.
Biometrics 1950, 6, pp. 105-16
[29] HURLERY, M. A. and ROSCOE, M. E. Automated statistical analysis of microbial enumeration by

dilution series, J. Appl. Bacteriol. 1983, 55, pp. 159-64
[30] NIEMELA, S. Statistical evaluation of results from microbiological examinations, Nordic Committee on
nd
Food Analysis (NMKL) Report No. 1, 2 edition (1983)
[31] TAYLOR, J. The estimation of numbers of bacteria by tenfold dilution series, J. Appl. Bacteriol. 1962,
25, pp.54-61
[32] HOLT, J. G., KRIEG, N. R., SNEATH, P. H. A., STALEY, J. T. and WILLIAMS, S. T. Bergey’s manual of
th
determinative bacteriology, 9 edn., Williams & Wilkins, Baltimore, MD, USA (1994)
[33] KRIEG, N. R. and HOLT, J. G. Bergey’s manual of systematic bacteriology – Volume 1, Williams &
Wilkins, Baltimore, MD, USA (1984)
[34] SNEATH, P. H. A. MAIR, N. S., SHARPE, M. E. and HOLT, J. G. Bergey’s manual of systematic
nd
bacteriology – Volume 2, 2 edition, Springer, New York, NY, 2001
rd
[35] KREGER-VAN RIJ, N. J. W. The yeasts – A taxonomic study, 3 edn., North-Holland Publiching Co.,
Amsterdam, Netherlands
[36] THOMAS, H. A. Bacterial densities from fermentation tube tests, J. Am. Water Assoc. 1942, 34, pp.
572-6
[37] ISO/IEC Guide 43-1, Proficiency testing by interlaboratory comparisons – Part 1: Development and
operation of proficiency testing schemes
[38] ISO 6888 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)
65
[39] ISO 9998, Water quality – Practices for evaluating and controlling microbiological colony count media
used in water quality tests
[40] ISO/TR 13843, Water quality – Guidance on validation of microbiological methods
[41] ISO 14461-1, Milk and milk products – Quality control in microbiological laboratories – Part 1: Analyst
performance assessment for colony counts
[42] ISO 14461-2, Milk and milk products – Quality control in microbiological laboratories – Part 2:
Determination of reliability of colony counts of parallel plates and subsequent dilution steps
[43] ISO 16654, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of
Escherichia coli O157
[44] ISO/IEC 17025:2005, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories
[45] EN 12469, Biotechnology – Performance criteria for microbiological safety cabinets
[46] ISO 17604, Microbiology of food and animal feeding stuffs – carcass sampling for microbiological
analysis
[47] ISO 18593, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for sampling techniques
from surface using contact plates and swab methods
[48] ISO Guide 99:1996, International vocabulary of basic and general terms in metrology
[49] ISO/TC 34/SC 9 N852, Supporting document on the change from two to one plate per dilution for
colony-count techniques (revision of ISO 7218), June 2007, Marie Cornu
66

ISO 7218 - Definiçoes Gerais PDF

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

ISO 7218 - Definiçoes Gerais PDF

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Padrão ISO

6. Preparação de vidrarias e outros materiais de laboratório ...................................................................... 28

Quando da realização de análises microbiológicas é especialmente importante que

- Os microrganismos não contaminem o ambiente.

Em última análise, é de responsabilidade do chefe de laboratório julgar se as manipulações são seguras e

- Orientações para credenciamento de laboratórios de análises microbiológicas de alimentos (este

ISO 835 (todas as partes), Vidrarias laboratoriais – Pipetas graduadas

Análises de amostras do estágio de produção primária (especialmente de recepção e preparo de amostras)

3.2. Considerações de segurança

- Categoria de risco 1 (nenhum ou risco muito baixo individual e para comunidade);

Um microrganismo que é improvável de causar doença em humanos e animais.

- Categoria de risco 2 (risco moderado individual, baixo risco à comunidade).

- Categoria de risco 3 (alto risco individual, baixo risco à comunidade)

- Categoria de risco 4 (alto risco individual e à comunidade)

3.3. Projeto de laboratório

As orientações para as disposições laboratoriais descritas abaixo abrangem a detecção de microrganismos

3.4.2. Áreas associadas com amostras e análises

- Recepção e armazenamento de amostras;

- Preparação de amostras, particularmente no caso de matéria prima (e.g. produtos em pó contendo um

- Análises de amostras (de suspensões iniciais), incluindo incubação de microrganismos;

- Manipulação de patógenos presuntivos;

- Armazenamento de linhagens de referência e outras;

- Preparação e esterilização de meios de cultura e equipamentos;

- Armazenamento de meios de cultura e reagentes;

- Análises de esterilidade de produtos alimentícios;

- Limpeza de vidrarias e outros equipamentos;

- Armazenamento de produtos químicos perigosos, preferencialmente mantidos em câmaras

3.4.3. Áreas gerais

Devem ser consideradas áreas separadas para as seguintes finalidades:

- Entradas, corredores, escadas, elevadores;

- Áreas administrativas (e.g. secretarias, escritórios, salas de documentação, etc.);

a) Construir um laboratório de acordo com o princípio do sentido único de fluxo;

b) Realizar os procedimentos de maneira sequencial tomando os devidos cuidados para garantir a

c) Separar atividade espacial e temporalmente.

b) Pisos devem ser antiderrapantes.

3.5.3. Outros pontos

Os seguintes pontos devem ser considerados:

- A disponibilidade de suprimento de água, de qualidade adequada para o uso desejado;

- Disponibilidade de gás (encanado ou engarrafado);

- Iluminação adequada em todas as seções do laboratório;

- Bancadas e mobiliário lisos, impermeáveis e de fácil limpeza e desinfecção;

- Disponibilidade de armários para manter os documentos usados quando da manipulação de amostras,

- Disponibilidade de uma autoclave para destruição de material de descarte e meios de cultura

- Disponibilidade de um sistema de segurança que cubra incêndios, emergências elétricas e chuveiro de

- Disponibilidade de instalações de primeiros socorros.

3.6. Limpeza e desinfecção

Os seguintes pontos devem ser checados.

d) A qualidade microbiológica das superfícies de trabalho do laboratório, superfícies de contato com a

4.3. Verificação de competências em curso de funcionários

Para equipamento de controle de temperatura, averiguar a estabilidade e homogeneidade da temperatura

5.2. Cabines de proteção

Cabines para uso em laboratórios de microbiologia de alimentos são de quatro tipos.

As cabines devem ser mantidas sem equipamentos na medida do possível.

5.2.3. Limpeza e desinfecção

Cabines de segurança devem ser fumegadas antes da troca do filtro ou de serviços.

5.2.4. Manutenção e inspeção

5.3. Balanças e diluidores gravimétricos

5.3.1. Uso e medição de incertezas

5.3.2. Limpeza e desinfecção

5.3.3. Avaliação de desempenho e calibração

Averiguação de pesos pode ser realizada imediatamente após a calibração da balança.

5.4. Homogeneizadores, liquidificadores e misturadores

Os seguintes aparelhos podem ser utilizados: