C2

Stabilitatea proteinelor și
identificarea interacțiunilor
proteină–proteină.

■ Adrian Onu, Dr. St. Nat.

■ Facultatea de Inginerie Medicală.
■ Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare
Medico-Militara „Cantacuzino”.
2.1. Prezentarea conceptelor pe baza cărora se
caracterizează stabilitatea și interacțiile proteină-
proteină.

2.2. Prezentarea metodelor fizice de caracterizare a

dimensiunilor și structurii proteinelor. (difracție de raze X,
spectroscopie de corelare fotonică, microscopie
electronică, microscopie de forță atomică, etc).
2.3. Metode de analiză a stabilității proteinelor (dicroism
circular, metode de microcalorimetrie).
 2.1. Prezentarea conceptelor pe
baza cărora se caracterizează
stabilitatea și interacțiile proteină-
proteină.
 Stabilitatea
proteinelor
●Stabilitatea proteinelor este rezultanta netă a
interacțiilor care determină conformația lor
nativă sau denaturată.
●Stabilitatea proteinelor se referă, în mod
normal, la stabilitatea fizică (termodinamică),
nu la cea chimică.
 Stabilitatea chimică a
proteinelor
● Stabilitatea chimică implică pierderea integrității
datorită ruperii unei legături
− deaminarea reziduurilor de asparagină sau
glutamină;
− hidroliza legăturii peptidice la asparagină la pH
scăzut;
− oxidarea metioninei la temperatură înaltă;
− eliminarea punților di-sulfurice;
− inter-schimbarea punților di-sulfurice la pH neutru;
● Alte procese cum ar fi: inter-schimbarea și oxidarea
punților di-sulfurice a reziduurilor de cisteina
catalizate de tioli.
 Stabilitatea fizică a
proteinelor
● Studiul stabilității proteinelor este important din mai
multe motive:
− oferă o înțelegere de bază urmând concepte de
termodinamică a procesului de pliere;
− stabilitatea crescută a proteinelor poate implica
miliarde de euro în prelucrarea de substanțe
biofarmaceutice, în special a medicamentelor
bazate pe extracte proteice sau proteine
recombinate.
● Dezvoltări relativ recente au avut un impact major în
studiul termodinamicii proteinelor prin tehnici foarte
sensibile, ca de exemplu calorimetria de scanare
diferențială și mutageneza dirijată.
Noțiuni de termodinamică
● Termodinamica se ocupă cu studiul macroscopic al fenomenelor
de orice natură, în care are loc un transfer de energie sub formă
de căldură și lucru mecanic. Numele a fost creat de lordul Kelvin
care a formulat și prima definiție a termodinamicii.
● Principiul întâi al termodinamicii. Energia unui sistem
termodinamic este egală cu suma tuturor energiilor particulelor
componente. Energia unui sistem se măsoară în raport cu un
sistem de referință solidar cu sistemul termodinamic și cu originea
în centrul de inerție al sistemului.
● Primul principiu al termodinamicii este formă a legii conservării
energiei la procesele în care intervine energia termică a materiei.
Acest principiu a fost enunțat pentru prima dată de către R.J.
Mayer în 1842. La baza enunțului său a stat observația
experimentală că lucrul mecanic se poate transforma în căldură și
invers.
ΔU = ΔQ -ΔL
Noțiuni de termodinamică
● Principiul al doilea al termodinamicii precizează condițiile în
care are loc transformarea energiei termice în energie mecanică.
El arată sensul în care se produc spontan transformările, fără să
se refere la cantitățile de energie schimbate.
● O formulare a acestui principiu este: În orice vecinătate a unei
stări a unui sistem termodinamic în stare de echilibru există stări
care nu pot fi atinse prin procese adiabatice. Aceasta sugerează
existenta unei funcții de stare a cărei valoare este constantă
pentru transformările adiabatice reversibile. Această funcție de
stare se numește entropie S. Entropia se modifică în toate
procesele în care are loc schimb de căldură. Căldura infinitezimală
schimbată de sistem poate fi scrisă sub forma:
ΔQ = ΤΔS
Noțiuni de termodinamică
● Entalpia (H) este o măsură a energiei totale a unui sistem
termodinamic. Aceasta include energia internă (energia necesară
pentru a crea un sistem), cât și cantitatea de energie necesară
pentru deplasare și depinde de volum și presiune. H = U + pV
● Entalpia are rol de potențial termodinamic. Entalpia este expresia
preferată în studiul schimburilor de energie în multe măsurători
chimice, biologice și fizice, deoarece aceasta simplifică anumite
descrieri de transfer de energie. Acest lucru este valabil pentru că
entalpia ține cont de energia transferată la mediu prin
expansiunea sistemului luat în studiu. Ținând cont de primul
principiu al termodinamicii ea poate fi scrisă sub forma:
ΔH(p,S) = ΤΔS+VΔp sau ΔH = ΔQ la presiune constantă
Noțiuni de termodinamică
● Energia liberă Helmholtz este un potențial termodinamic care
indică cantitatea de efort "utilă" ce poate fi obținut de la un sistem
termodinamic închis la temperatură și volum constante. Pentru un
astfel de sistem, variația energiei libere este egală cu lucrul
mecanic maxim ce se poate extrage dintr-un proces termodinamic
în care temperatura și volumul sunt menținute constante. În aceste
condiții, F = U -TS
● În termodinamică, energia liberă Gibbs sau entalpia liberă este
un potențial termodinamic - este lucrul "util" ce poate fi obținut de la
un sistem termodinamic la temperatură și presiune constante.
Energia Gibbs este, de asemenea, potențialul chimic care este
minim atunci când un sistem atinge echilibrul la presiune și
temperatură constante. Derivata sa în raport cu coordonate de
reacție este zero la punctul de echilibru. Ca atare, este o mărime
convenabilă pentru procese chimice și biochimice. Ea poate fi scrisă
sub forma: ΔG = ΔH - ΤΔSint sau ΔG= ΤΔS pentru un sistem izolat.
Noțiuni de termodinamică
● Capacitatea calorica (notată Cp) sau capacitatea termică, este
mărimea fizică măsurabilă care caracterizează cantitatea de
căldură necesară pentru a schimba temperatura unei substanțe cu
o anumită valoare. În sistemul International de unități (SI),
capacitatea calorică este exprimată în joule(s) (J) pe Kelvin .
● Capacitatea calorică pate fi văzută ca o proprietate intensivă,
adică, independentă de dimensiunea eșantionului, fiind
capacitatea calorică molară sau căldura specifică - capacitatea
calorică pe unitate de masă dintr-un material. Ea poate fi scrisă
sub forma:
C = ΔQ/ΔT
care la presiune constantă este:
Cp= ΔH/ΔT.
 Stabilitatea
proteinelor
• Stabilitatea netă a unei proteine este definită ca diferența de
energie liberă între starea nativă și denaturată:
• Energia liberă corespunzătoare ambelor stări GN si GD contribuie
la G.
• Energia liberă poate fi ușor calculată dacă se definește raportul
intre fracția nativă și cea denaturată:
K = [N]/[D] = FN/(1- FN),
• FN = fracția nativă.
ΔG = GN - GD = -RTlnK
• Scăderea energiei libere corespunzătoare stării pliate sau
creșterea energiei libere a stării depliate au același efect asupra
ΔG.
 Stabilitatea
proteinelor

• Atunci cââ nd proteinele se pliâzâă , îân 81% dintre situâtții câtenele lâterâle nepolâre
(Alâ, Vâl, lle, Leu, Met, Phe, Trp, Cys), îân 63% câtenele lâterâle polâre (Asn, Gln,
Ser, Thr, Tyr) sț i îân 54% din câtenele lâterâle îâncâă rcâte (Arg, Lys, His, Asp, Glu) sunt
îângropâte îân interiorul moleculei evitââ nd contâctului cu âpâ.
• Ulterior se formeâzâă legâă turi intrâmoleculâre specifice, legâă turi de hidrogen câre
stâbilizeâzâă proteinâ.
The FASEB Journal Vol.10, No.1 , pp:75-83,
 Stabilitatea proteinelor în
stare pliată
● Măsurarea stabilității proteinelor presupune
măsurarea diferenței de energie dintre cele
două stări: D (denaturată) și N (pliată).
● Stabilitatea medie a unei proteine monomerice
calculată din considerațiile anterioare sete este
de ordinul a 5-10 kcal/mol.
Plecând de la aceste valoare a energiei în relația
ΔG = GN - GD = -RTlnK
se poate calcula K= e-ΔG/RT raportul pliat/depliat
(denaturat) în soluție apoasă, la temperatura
camerei.
Stabilitatea proteinelor în stare
pliată – abundenta relativa

From: Methods in Molecular Biology, vol. 168: Protein Structure, Stability, and Folding
 Stabilitatea proteinelor în
stare pliată
● Parametrul K constantă de echilibru - reprezintă raportul
dintre cele două constante corespunzătoare celor 2
sensuri de evoluție ale proceselor, direct (d) și invers (i);
K=kd/ki
● Ca urmare, dacă o proteină se pliază spontan cu o rată
constantă de kd = 1 s-1, rata de depliere spontană în
aceleași condiții va fi 10-7 s-1. Jumătate din timpul de viață
este 0.693/10-7 s = 80 zile.
● Acest lucru sugerează ca deplierea proteinelor este
tranzitorie.
● Pentru a perturba echilibrul în scopul măsurării deplierii
(denaturării) proteinelor se folosesc agenți denaturanți -
uree, pH extrem, temperatura, etc.
 Tehnici pentru măsurarea
stabilității
Sunt metode care pot distinge între N și D
● Absorbție UV (de exemplu - cisteina sau triptofan).
● Fluorescența (Trp) - diferența de emisie max &
intensitate.
● Dicroismul circular (în UV lângă banda de
absorbție).
● RMN
● DSC (calorimetrie)
● Geluri în gradient de uree - diferența în ratele de
migrarea N și D.
● Activitate catalitică
● Sonde cromoforice sau fluorometrice
Denaturanți
 Denaturarea proteinelor
la pH extrem
● pH-ul ridicat și cel scăzut poate denatura multe
proteine (unele sunt destul de stabile la un pH
scăzut).
● Ideea de bază este că sarcina netă a proteinelor din
grupările ionizante conduce la interacțiuni
intramoleculare de repulsie, care sunt suficiente
pentru a compensa forțele de atracție (în cea mai
mare parte hidrofobe) din care rezultă deplierea
parțială a proteinelor.
● Uneori prezența ionului de semn contrar duce la
formarea de stări intermediare relativ compacte
favorizate comparativ cu starea nativă.
 Denaturanți
chimici
● Efectele denaturanților chimici cum ar fi ureea (de obicei, 8 M) sau
clorhidratul de guanidinium (de obicei 6 M GuHCl) sunt complexe și, în
prezent, se consideră că implică solvatarea interferând cu formarea
legăturilor de hidrogen și într-o oarecare măsură a interacțiilor hidrofobe.
● Interacția cu grupările hidrofobe îi face sa nu fie buni solvenți știut fiind
că se consideră solvenți buni cei hidrofili și răi cei hidrofobi.
● Ca și în cazul denaturării induse de pH, nu toate proteinele sunt depliate
de acești denaturanți.
● stabilitatea proteinelor este cea mai mica in tiocianatul de guanidină :
GuSCN- < CuCl- < uree < Gu2SO42-
● un exemplu este concentrația de denaturare pentru RNase: GuSCN =
0,3M, GuHCl = 0,8 M şi uree aproape 3 M.
 Denaturanți

Pentru a modela denaturarea, o metoda obișnuită este de a

extrapola datele de tranziție, în funcție de concentrația
agentului denaturant la 0 M pentru a oferi valoarea
corespunzătoare stării nedenaturate în apă (ΔGH2O).
ΔG D-N = ΔG H20D-N - m D-N [concentrația de agent denaturant]

ΔG H20D-N de ordinul 5 -10 kcal/mol

Parametrii – m și Cm
● Parametrul m reflectă dependența de energie liberă de denaturare
concentrare
● Valori
− uree ~ 1 kcal/mol
− GuHCl ~ 3 kcal/mol
● Variația pantei (m) depinde de accesibilitatea solventului la
reziduurile hidrofobe. Valoarea lui m depinde, de asemenea, de
interacții cooperative la denaturare, de timpul în care structura
rămâne în stare denaturată, de cât de mult agent de denaturare
leagă, etc.
● Este important, de asemenea, parametrul Cm ce reprezintă
concentrația denaturantului la care 50% din moleculele sunt
depliate.
● În funcție de cei doi parametri se evaluează denaturarea. Pe baza
parametrului Cm o substanța poate părea mai stabilă, dar uneori
concluzia opusă se obține pe baza m si ΔG H20D-N .
Modele de studiu - Barnase
● Barnaza (numita asa de la
BActerial" "RiboNucleASE") este o
proteină bacteriană formata din 110
aminoacizi şi care are activitate de
ribonuclează (distruge ARN).
Aceasta este sintetizată și secretată
de bacteria Bacillus
amyloliquefaciens.
● Proteina nu este letală atunci când
este exprimată cu inhibitorul său ce
previne deteriorarea RNA celular
imediat după ce acesta a fost
sintetizată, dar înainte de a fi
secretată. Complexul este celebru
pentru afinate si rata de asociere de
10 8 s−1M−1.
● Proteina nu are punți disulfurice fiind
un model ideal pentru studiul
denaturării și plierii.
 Deplierea barnazei în uree

Pâce, C. Nick, ând Kevin L. Shâw. "Lineâr extrâpolâtion method of ânâlyzing solvent denâturâtion curves." Proteins: Structure, Function, ând Bioinformâtics 41.S4 (2000): 1-7.
Denaturarea termică

● Efectul temperaturii asupra structurii proteinelor este

oarecum controversat, deoarece la cele mai multe proteine
poate apărea fenomenul de denaturare și la rece, în condiții
adecvate.
● Fenomenul se bazează pe ruperea legăturilor de hidrogen și
creșterea probabilității de formare a legăturilor hidrofobe la
temperaturi mari.
● În general, se consideră că Cp este constantă în raport cu
temperatura. Cu toate acestea, Privalov a observat că Cp a
crescut în cazul denaturării adică capacitatea termică Cp
este mai mare pentru starea depliata decât pentru cea pliată.
● Aceasta se datorează probabil expunerii mai mari la apă a
moleculelor care explică cel puțin parțial schimbarea Cp.
Denaturarea termică

● În general, se consideră că Cp este constantă în raport

cu temperatura. Cu toate acestea, Privalov a observat
că Cp a crescut în cazul denaturării adică capacitatea
termică Cp este mai mare pentru starea depliata decât
pentru cea pliată.
● Aceasta se datorează probabil expunerii mai mari la
apă a moleculelor care explică cel puțin parțial
schimbarea Cp.
 Denaturarea termică
• Ecuația Van't Hoff este folosită pentru a descrie relația dintre
temperatura T si constanta de echilibru K, pe baza variației de entalpie
în cursul procesului:
• dlnK/d(1/T) = ∆H/R
• Dacă Ecuația Van't Hoff, (lnK vs 1/T) este neliniară la denaturarea
termică a proteinelor indicând modul de variație a lui H cu temperatura.
• Capacitatea calorică a proteinelor pliate și denaturate e diferită.
Diferența se scrie :
ΔH/ΔT = Cp = (CpD - CpN)
cu H = Ho + Cp(T-To), S = So + Cp ln(T/To)
si G(T) = Ho - T So + Cp [(T - To) – T ln(T/To )]
unde T0 este o temperatura de referință (uzual tempratura le care jumătate dintre
molecule sunt depliate Tm).

• Ecuația Gibbs-Helmholz devine:

G(T) = Hm (1-T/Tm) - Cp[(Tm - T) + T ln(T/Tm)]
ceea ce permite calcul G.
● Exemplu de plot ΔG versus
temperatura a nucleazei
stafilococice de tip sălbatic și cinci
mutante reprezentative. Mutantul
23I / 25I / 66L / 72L a fost aleas
deoarece are un ΔCp scăzut fitare
proastă. Mutantul 23L / 25I / 66I /
72V are o stabilitate semnificativ mai
mică decât de tip sălbatic, dar are un
ΔCp, apropiat și fitare bună. Mutanții
66I / 72V / 92V / 99I și 66I / 72V /
92V / 99L sunt cu ΔCp ridicată.
Mutanul 23L / 25I / 66I / 72L are o
ΔCp scăzută și o fitare bună. Liniile
ecuației Gibbs-Helmholtz sunt obținut
prin regresie neliniară pentru toate
temperaturile măsurate definind Tm
și ∆H ca valorile obținute din
experimentele de denaturare termică.
Punctele indică datele experimentale
obținute la diferite temperaturi.
Deviația standard în determinările
repetate de stabilitate pentru proteina
de tip sălbatic, la 20 ° C este de ± 0,1
kcal / mol.
 Denaturarea termică
• Entalpia de reacție este cel mai adesea
determinată prin una din cele două mijloace, direct
prin calorimetrie (aria de sub vârful curbei de
denaturare) sau indirect, prin măsurarea
dependenței de temperatură a constantei de
echilibru (pe baza ecuației,Van't Hoff ).
• În cazul în care acestea sunt egale, înseamnă ca
nu există nici o stare intermediară a tranziției și ca
urmare, tranziția are două stări.
• Pentru cele mai multe proteine ΔHVan't Hoff/ΔΗcal =
1.05 ± 0,03 ceea ce implică două stări.
 Denaturarea termică a barnasei

Creighton, T. E., ed. 1997. Protein Structure: A Prâcticâl Approâch. Second Edition. Prâcticâl Approâch Series. Oxford, New York: Oxford University Press.
 Stări multiple ale deplierii
proteinelor
• Keq=[N]/[D]= ( [θ]obs- [θ]D)/( [θ]N- [θ]D) = FN/(1- FN)
FN = fracția nativă
 Proteine termofile
● Organismele vii pot fi găsite în cele mai neașteptate locuri, inclusiv la
adâncime și la presiuni foarte mari, în izvoare termale la temperaturi de
peste 1000C.
● Proteinele găsite în specii termofile sunt mult mai stabile decât omologii
lor mezofilici (deşi acest lucru corespunde doar la 3-8 kcal/mol de
energie liberă).
● În general structura tridimensională este în esență aceeași pentru
ambele proteine termofile şi mezofile.
● Este nevoie doar de stabilitatea legăturilor de H care fac ca, deși
diferențele de structură sunt relativ mici între proteinele termofile şi
mezofile, stabilitatea energetică să conteze substanțial în final.
● Limita superioară a temperaturii de creștere la bacterii termofile atinge
110 ° C.
 Proteine termofile vs proteine
mezofile
● Proteinele termofile au cantități crescute de Arg ce duc la
creșterea numărului de punți de sare, apariții mai frecvente ale Ala
în lanțurile helix și substituții Gly/Ala ce duc la reducerea
flexibilității.
● Cu toate că contribuția individuală este mică, toate aceste
modificări luate în ansamblul lor sunt de ajuns pentru a asigura
stabilitatea. În general, se pare că nu există nici un singur factor
determinant în creșterea stabilității termice; fiecare proteina este
un caz unic, care implică de obicei variații în interacțiuni hidrofobe,
legături de hidrogen, interacțiuni electrostatice implicând și cationi
divalenți (e.g. Ca2 +) şi punți disulfurice. Există unele referințe
care consideră că în acest caz o pliere mai compactă poate, de
asemenea, juca un rol în stabilitate.
Stabilitate versus activitate

● Unele enzime termofile care sunt foarte stabile la temperaturi

normale, au activități foarte scăzute la temperaturi mai mici.
● Există un compromis între stabilitate şi activitate în structura situs-
ului activ al unei proteine.
● Există mai multe poziții în situsul activ care pot fi mutate pentru a
oferi proteine mai stabile, dar mai puțin active.
● Activitatea poate fi apoi crescută, dar în dauna stabilității.
● Situsurile active ale unei enzime sunt o sursă generală de
instabilitate, deoarece conțin grupuri care sunt expuse la solvenți
pentru a prelua substratul sau ligandul, iar dacă nu sunt asociate
cu cele fiziologice nu sunt protejate.
 Denaturarea la rece
∙ Curba energiei libere începe să scadă la temperaturi mai
mici, ceea ce face ca denaturarea să pară mai puțin
probabilă.
∙ Totuși, în ultimii ani, mai multe proteine s-au dovedit a fi
sensibile la temperaturi scăzute, denaturarea la rece fiind
identificată fie la pH scăzut sau concentrație moderată a
unor agenți de denaturare.
∙ În prezent e acceptată explicația - denaturarea la rece este
bazată pe modificări favorabile asociate energiei libere la
contactul dintre apă şi grupuri nepolare la temperaturi
scăzute, care ar slăbi interacțiunile hidrofobe și în cele din
urmă entropia este cea care perturbă structura terțiara a
proteinelor.
Factori ce afectează stabilitatea
proteinelor
● pH: proteinele sunt mai stabile în vecinătatea punctului lor
isoelectric, pI. În general, interacțiunile electrostatice contribuie
în măsură mică la stabilitatea stării native.
● Legarea ligandului: este cunoscut de mult timp că liganzii, ex.
substraturile, inhibitori ai enzimelor, cresc stabilitatea
proteinelor. Aceasta previne afectarea situsului catalitic sau
funcțional ceea ce face ca stabilitatea sa fie accentuată.
● Pot exista excepții în ambele situații în care la pI există și
oarecare tendințe de agregare și precipitare a proteinelor.
Același lucru se întâmplă dacă legarea ligandului sau al
substratului produce modificări alosterice (ale structurii
tridimensionale), ducând la asocieri și precipitare.
Factori care afectează stabilitatea
proteinelor
● Punțile disulfurice: S-a observat că multe proteine extracelulare
conțin punți disulfurice. De obicei, proteinele intracelulare nu au
punți disulfurice. Multe proteine, în cazul când punțile lor
disulfurice sunt rupte se denaturează foarte ușor. Se consideră că
punțile disulfurice cresc stabilitatea prin scăderea entropiei
impunând constrângeri de mișcare.
● Nu toate reziduurile au contribuții egale la stabilitatea proteinei. De
fapt, este logic ca cele interioare, inaccesibile pentru solvent în
status nativ, să aibă o contribuție mult mai mare decât cele de pe
suprafață.
● Proteinele sunt foarte maleabile, adică o modificare a anumitor
reziduuri tinde să catalizeze modificări de structură afectând
reziduuri adiacente, cu șanse de propagare.
2.2. Prezentarea metodelor fizice
de caracterizare a dimensiunilor și
structurii proteinelor. (Difracție de
raze X, spectroscopie de corelare
fotonică, microscopie electronică,
microscopie de forță atomică, etc).
Difracția de raze X

● Pentru a obține date cu raze

X dintr-un cristal, acesta
trebuie să fie plasat într-un
fascicul monocromatic
(singură lungime de undă) de
raze X. Pe fiecare plan a
cristalului proteic are loc o
imagine de difracție imaginea
rezultat constând dintr-o
serie de pete (spot-uri).
Fiecare pată pe imagine este
un fascicul de difractat. Mii
de spoturi de difracție trebuie
să fie colectate pentru a
rezolva o structura de
proteine.
Microscopia de forță atomica (AFM)

● Microscopia de forță atomica

(AFM) este un tip de microscopie
care obține informații indirecte
folosind o sonda de
scanare(cantilever) care care
scanează o zona de măsura.
Lumina reflecta este sesizata și
transformată în informație
topologică. Rezoluția este ordinul
de fracțiuni de nanometri, mai
mare de 1000 de ori decât limita
de difracție optică. Pentru
asemenea rezoluții vibrații
suplimentare sin aplicante sondei
rezultând un profil complex care
este supus analizei
 Imagine AFM a of E. coli D21e7 imobilizate pe o suprafață de sticlă.

Anneta Razatos et al. PNAS 1998;95:11059-11064

©1998 by National Academy of Sciences

 Scanning electron microscopic images of bare silicon nitride tip and silicon nitride tip coated
with E. coli D21.

Anneta Razatos et al. PNAS 1998;95:11059-11064

©1998 by National Academy of Sciences

Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)

● Împrăștierea dinamică a luminii (DLS) este o metodă din ce în ce

mai mult folosită pentru analiza nanoparticulelor. Această metoda
analizează trenurile de unda ce rezultă din interferența dintre
lumina incidentă și cea împrăștiată de particulele în mișcare.
Deoarece prin compunerea dintre mișcarea particulei și a
fotonului corespunzător undei luminoase are loc o modificare de
energie (prin efect Doppler) aceasta este cunoscută si sub
numele de împrăștierea cvasi-elastică a luminii (QELS). Metoda
în sine permite corelarea acestor evenimente individuale de
compunere a undelor împrăștiate de mișcarea moleculelor, cu
undele incidente, semnalul rezultant conținând informația globală
despre tot ansamblul de particule și mișcările acestora. Din acest
motiv aceasta este cunoscută și sub denumirea de
spectroscopie de corelare fotonică (PCS).
 Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
● Molecule mai mari se deplasează mai încet decât cele mai mici, și,
astfel, scara fluctuațiilor (trenurilor de undă) rezultate după
împrăștiere oferă o măsură a dimensiunilor moleculare. Parametrul
estimat prin DLS este dimensiunea hidrodinamică (raza sau
diametrul) unei particule sferice cu același coeficient de difuzie ca
proteinele sau agregatele proteice de studiat. Pentru o detecție
adecvată, intervalul de corelare este de ordinul de marime a
mișcării browniene, timpul de corelare al acestor evenimente este
de la 0.1 μs la 0.1 s. Prin lărgirea sau îngustarea acestei distribuții
pot fi evaluate distribuții de evenimente mai largi sau mai precise.
● De asemenea, modificarea unghiului de observare permite
selectarea altor intervale de timp si implicit altă distribuție de
mărime ale particulelor. La un unghi de 900 vor fi evidențiate
agregatele mari, iar la un unghi mic, de exemplu de 150, cele mici.
Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
 Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
● Avantajele DLS sunt incontestabile, parametrii analizați fiind globali
nu este necesară separarea componentelor prin metode care ar
duce la concluzii eronate din cauza adsorbției nespecifice sau
disocierii reversibile prin diluție a agregatelor. Dincolo de acest
avantaj DLS are și un dezavantaj major. Semnalul DLS,
corelograma, se transformă în distribuție de mase printr-o
abstracțiune matematică.
● Problema este clar definită doar dacă semnalul este achiziționat
fără zgomot. În situația existenței unui zgomot de fond, cum se
întâmplă în toate cazurile, la transformarea matematică soluția nu
este unică. Această categorie de probleme matematice de
transformare inversă, definite ca nefiind bine puse, pot fi totuși
aproximate în condiții definite și permit obținerea de date
consistente.
Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
● Este totuși bine de remarcat că prelucrări diferite pot duce la rezultate
variabile și de aceea este bine ca prelucrările și interpretările rezultatelor
care trebuie comparate să fie făcute în condiții similare.
● O tehnică alternativă de împrăștiere a luminii este cea statică la care
informațiile achiziționate cu privire la dimensiunile particulelor se
bazează pe proporționalitatea dintre unghiul cu care lumina este
împrăștiată și dimensiunea particulelor. Achiziția se face la unul sau mai
multe unghiuri de împrăștiere, iar informațiile pot fi folosite pentru a
măsura în mod direct greutatea moleculară medie a probei.
● Există multe modele de împrăștiere a luminii, una dintre cele mai
cunoscute fiind cea a lui Rayleigh (explicarea efectului Tyndall). Pornind
de la acest model se observă o proporționalitate cu puterea a șasea a
dimensiunii particulei.
Dynamic Light Scattering

From: DLS technical note MRK656-01 Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes-
http://www.malvern.com/common/downloads/campaign/MRK656-01.pdf
 Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
● Altfel spus, marea putere a tehnicilor de împrăștiere a luminii
este aceea că sensibilitatea lor crește foarte puternic cu
greutatea moleculară. Asta înseamnă că metodele de
împrăștiere pot fi foarte sensibile pentru detectarea unor
cantități mici de agregate foarte mari. Totuși, această mare
sensibilitate face ca tehnicile de împrăștiere să fie foarte
vulnerabile la praf sau alte particule mari contaminante. În
plus, în condițiile împrăștierii statice, care este de obicei
realizată prin utilizarea în modul de detector de flux,
particulele trebuie separate în prealabil prin metode
adecvate SEC sau curgere în câmp de forțe (FFF field flow
fractionation).
 Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
● Pentru DLS, nu este necesară o separare fizică, separarea
matematică fiind suficientă pentru a distinge împrăștierile
datorate agregatelor sau altor particule mari din cauza
mișcării browniene, astfel de particule fiind mult mai lente
decât un monomer proteic. Dependența luminii împrăștiate
depinde de dimensiunea particulelor ceea ce face ca, totuși,
contribuția particulelor mari să fie mult mai pregnantă. Ca
urmare ne-am focalizat pe metoda împrăștierii dinamice a
luminii pentru acest tip de analize.
 Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
● Modificarea lungimii de undă a luminii împrăştiate de către
particule aflate în mișcare browniană depinde de coeficientul de
difuzie și, implicit, de mărimea particulelor respective.
● Semnalul rezultat este extras printr-o analiză de autocorelare,
fiind o sumă de exponențiale, fiecare proporțională cu mărimea și
abundența particulelor din lichid. Din analiza acestuia se poate
estima, cu anumite limite, distribuția particulelor din lichid în funcție
de dimensiunea acestora.
● Metodele folosite pentru analiza distribuției se bazează pe modele
matematice avansate precum transformata Laplace inversă cu o
serie de modificări în scopul asigurării robusteții analizei. Deoarece
aceste metode au limitări din cauza faptului că semnalul real este
afectat de zgomot, datele sunt comparate cu metode alternative,
precum analiza componentelor discrete (exponențialelor
componente) sau analiza cumulanților.
Autocorelare in DLS
 Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)

● Dimensiunea unei molecule de anticorp, măsurată pe baza

cristalografiei cu raze X este 14.2nm × 8.5nm × 3.8nm. (The three-
dimensional structure at 6 A resolution of a human gamma Gl immunoglobulin
molecule J Biol Chem. 1971 Jun 10;246(11):3753-9.)
● Anticorpii nu reprezintă sfere ideale și, ca urmare, mișcarea este
mult mai complexa. O figură edificatoare este prezentată în
continuare, reprodus după Pease si colaboratorii.
● Ca urmare, așteptarile sunt ca dimensiunea calculată pe baza
relației Stokes-Einstein să fie în acest interval.
● Având în vedere că vâscozitatea soluției intervine în calculul razei,
rezultatele se pot ajusta pe baza vâscozității, astfel încât diametrul
să se situeze în zona de 12-16nm. Se poate estima și vâscozitatea
în funcție de concentrația de proteine, dar în preparatele de
anticorpi vâscozitățile pot diferi în funcție de tipul de anticorpi.
Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
● După cum se
observă,
distribuția relevă
existența unor
particule de
dimensiuni mai
mari, care
contribuie cu
50% la lumina
împrăștiată.
Aceste particule
au o dimensiune
medie de 62 nm
si reprezintă
agregate de
imunoglobuline.
 Împrăștierea dinamică a luminii (DLS)

Imagine a virusului gripal obținută prin microscopie

electronică
DLS corespunzător virusului gripal obținută
prin microscopie electronică (imagine
anterioară)
Z-Average (± SD) (r.nm):
77,98± 27,94 Polydispersity Index:
0,128

Size Distribution by Intensity Size Distribution by Volume

14 12

12 10

10
Intensity (%)

Volume (%)
8
8
6
6
4
4

2 2

0 0
1 10 100 1000 1 10 100 1000
Size (r.nm) Size (r.nm)

11-FLU-CI-01-3.0 DLS 11-FLU-CI-01-3.0 DLS

Reprezentarea intensității semnalului e relevantă pentru particulele mari

(stânga), iar reprezentarea masică este relevantă pentru particulele mici
(dreapta). Datele sunt în concordanță cu cele obtinute prin microscopie
electronică.
Tehnica de rezonanță plasmonică de
suprafață (SPR)
● În comparaţie cu tehnicile convenționale, tehnica rezonanță
plasmonică de suprafața (SPR) poate fi considerată o metodă
rapidă pentru dezvoltarea de medicamente, controlul de calitate a
reactivilor, studiile de aderență celulară și interacțiunile
biomoleculare.
● SPR este o tehnică utilizată pentru măsurarea interacțiunilor
biomoleculare dintr-un mediu, în timp real. Se bazează pe
rezonanță, oscilații colective ale electronilor de valență într-un solid
stimulat de o lumină incidentă. Ea măsoară modificările de
refracție de la interfața unui senzor (chip), în timp real. Aceste
modificări apar atunci când biomoleculele interacționează cu
liganzi imobilizați sau când înlocuiesc apa (tamponul) din situsurile
de legare de pe suprafața senzorului. Diferențele indicilor de
refracție sunt detectate prin modificarea unghiului luminii reflectate
de la o sursă de tip LED şi sunt direct proporționale cu cantitatea
biomoleculelor legate de suprafața senzorului.
Tehnica de rezonanță plasmonică de
suprafață (SPR)
2.3. Metode de analiză a stabilității
proteinelor (dicroism circular,
metode de microcalorimetrie).
Dicroismul circular (CD)
● Dicroismul circular (CD) caracterizează absorbția diferențială a
luminii de către a moleculelor chirale optic active.
● Aparatul folosește lumina polarizata care ulterior este polizată
circular și modulă printr-un de modulator fotoelastic (PEM) și
urmărită absorbția diferențială. Confientul de absorbție este similar
celui dat de legea Lambe-Beer ∆ A = (εL – εL)C l = ∆ε C l dar în
pratică este folosită elipticitatea molară ѳ = 3298,2 ∆ε.
● Spectrul de dicroism circular (CD) a proteinelor și peptidelor cu structuri secundare
reprezentative. (a) Spectrele de poli-L-lizină în (1) helix (negru) CD (2) sheet
antiparalel (roșu) și (3) conformații dezordonate (verde) și colagen placentar în
triplu elicoidal nativ (albastru) (4) și (5) denaturat (cyan). (b) Ffragment de peptidă
de 33 de reziduuri de collagen tip uman I - (de tip sălbatic, WT), și mutant la care
unde POH este hidroxiprolina și o peptidă care conține mutația G14A la 2 ° C și 60
° C în apă la pH 5,1. Concentrația a fost 0,04 mM WT (linia roșie solidă) la 2 ° C;
WT la 60 ° C ( linia roșie punctată); G14A la 2 ° C (linia cyan solidă) G14A la 60 °
C; (linia cyan punctată) .

Nâture Protocol 1(6):2891-9 · Februâry 2006DOI: 10.1038/nprot.2006.244

Calorimetria cu scanare diferențială (DSC)
● Calorimetria de scanare diferențială (Differential Scanning
Calorimetry (DSC)) este o tehnică de neegalat pentru înțelegerea
stabilității proteinelor. DSC măsoară direct modificări de căldură
care apar în proteine în timpul creșterii sau scăderii temperaturii,
făcând posibil studiul stabilității materialelor.
● DSC măsoară variația entalpiei (∆H) pentru depliere pe baza
căldurii de denaturare. Biomoleculele în soluție sunt în echilibru
între conformația nativă (pliat) şi cea denaturată (desfășurată). Pe
această bază este calculat punctul de tranziție termica mediu (Tm),
definit ca temperatura la care 50% din biomolecule sunt depliate, ca
indicator de stabilitate a moleculei. DSC este, de asemenea, utilizat
pentru a determina modificarea capacității termice (ΔCp) la
denaturare.
Calorimetria cu scanare diferențială
(DSC)
● Calorimetria cu scanare diferențială (Differential Scanning
Calorimetry (DSC)) este o tehnică de neegalat pentru înțelegerea
stabilității proteinelor. DSC măsoară direct modificări de căldură
care apar în proteine în timpul creșterii sau scăderii temperaturii,
făcând posibil studiul stabilității materialelor.
● DSC măsoară variația entalpiei (∆H) pentru depliere pe baza
căldurii de denaturare. Biomoleculele în soluție sunt în echilibru
între conformația nativă (pliat) şi cea denaturată (desfășurată). Pe
această bază este calculat punctul de tranziție termica mediu (Tm),
definit ca temperatura la care 50% din biomolecule sunt depliate, ca
indicator de stabilitate a moleculei. DSC este, de asemenea, utilizat
pentru a determina modificarea capacității termice (ΔCp) la
denaturare.
Calorimetria cu scanare diferențială (DSC)

• DSC măsoară căldura

necesară pentru a ridica
temperatura soluției de
macromolecule față de
cea a tamponului .
• DSC poate fi utilizată
pentru a măsura direct
entalpia şi temperatura
de topire (Tm) (50%
depliat, ΔG = 0, ΔH =
TΔS).
Calorimetria cu scanare diferențială (DSC)
Calorimetria cu scanare diferențială (DSC)

● Tehnica a fost dezvoltata de

E.S. Watson şi MJ O'Neill în
1962 şi a devenit comercială
în 1963. Primul calorimetru
diferențial utilizat în biochimie
a fost dezvoltat de P.L.
Privalov şi Daniel
Proba Refaerinta Monaselidze în 1964.

Metal Metal Metal Metal

1 2 1 2
Temperatura Temperatura
probei referintei
Aplicațiile DSC
● Stabilitate și pliere a proteinelor;
● Formulări produse biofarmaceutice;
● Procese de dezvoltare;
● Ingineria proteinelor;
● Studiul anticorpilor;
● Caracterizarea membranelor, lipidelor, acizilor nucleici şi micelelor;
● Evaluarea efectelor schimbărilor structurale asupra stabilității unei
molecule;
● Măsurare de interacțiuni moleculare foarte slabe;
● Evaluarea biocompatibilității în procesele de fabricație.
Sistem DSC capilar
● Sistemul DSC-capilar este unul
dintre cele mai avansate
sisteme de scanare de
calorimetrie diferențiala.
● Avantajul lui este faptul ca în
capilare proteina nu precipită.
● Funcția pentru screening-ul mai
multor probe pentru tranziție
termică (Tm) permite analiza
integrată a până la 50 de probe
pe zi cu funcţionare continuă.
● Sistemul a revoluționat studiul
de formulări în domeniul
biofarmaceutic prin testarea de
stabilitate.
Calorimetria de titrare izotermică (ITC)

● Calorimetria de titrare izotermică (ITC) este standardul de aur

pentru măsurarea interacțiunilor între biomolecule. ITC este o
tehnica termodinamică, directă a căldurii cedate sau absorbite în
timpul unui experiment de legare biomoleculară.
● ITC stabileşte simultan toţi parametrii de legare (n, K, ∆H şi ΔS)
într-un singur experiment. Aceste informații nu pot fi obținute cu
ușurință prin altă metodă.
● Atunci când moleculele se asociază, este generată sau absorbită
căldură.
Experiment ITC
● Într-un experiment ITC tipic, o
soluție proteică se amestecă cu un
ligand care este titrată în soluție cu
partenerul său de legare.
● Căldură degajată la interacţiunea
lor (ΔH) este monitorizată în
timp. Fiecare vârf reprezintă
schimbul de căldură asociat cu
injectarea de un volum mic de
probă în celula de reacţie ITC.
● Cantitățile succesive de ligand sunt
titrate în celula ITC, cantitatea de
caldură absorbită sau cedată este
direct proporţională cu cantitatea
de legare.
Experiment ITC

● Când sistemul ajunge la

saturație, căldura schimbată se
diminuează până când sunt
realizate condițiile de
saturație. Aria de sub vârfuri dă
entalpia (ΔH)
● Curba de legare este apoi
calculată în funcție de raportul de
ligand şi partener de legare în
celulă. Curba de legare este fitată
pentru a determina Kb, n şi
ΔH. (Kb = 1/Kd.)
● ΔG = -RT lnKb = ΔH-TΔS