BAB I

SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

A. DEFINISI SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi
cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002).
Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm,
dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm.
Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang
melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis,
sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis
kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk
pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa
ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu
dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Rohman, 2007).

B. KEGUNAAN SPEKTROFOTMETRI UV-VIS

Spektrometer Uv-Vis dapat digunakan misalnya untuk mengukur kadar
logam. UV / Vis spektroskopi secara rutin digunakan dalam kuantitatif
penentuan larutan dari logam transisi ion dan sangat dikonjugasikan senyawa
organik.
a. Larutan ion logam transisi dapat berwarna (misalnya, menyerap cahaya)
karena elektron dalam atom logam dapat tertarik dari satu negara
elektronik lainnya. Warna larutan ion logam sangat dipengaruhi oleh
kehadiran spesies lain, seperti anion tertentu atau ligan. Sebagai contoh,
warna larutan encertembaga sulfat adalah biru yang sangat terang;
menambahkanamonia meningkat dan perubahan warna panjang
gelombang serapan maksimum (λ m a x ).
b. Senyawa organik, terutama mereka yang memiliki tingkat
tinggi konjugasi, juga menyerap cahaya pada daerah UV atau terlihat
dari spektrum elektromagnetik. Pelarut untuk penentuan ini sering air
untuk senyawa larut dalam air, atau etanol untuk senyawa organik yang

1
 larut. (Pelarut organik mungkin memiliki penyerapan sinar UV yang
signifikan; tidak semua pelarut yang cocok untuk digunakan dalam
spektroskopi UV. Ethanol menyerap sangat lemah di paling panjang
gelombang.).Polaritaspelarut dan pH dapat mempengaruhi penyerapan
spektrum senyawa organik. Tirosin, misalnya, peningkatan penyerapan
maksimum dan koefisien molar kepunahan ketika pH meningkat 6-13 atau
ketika polaritas pelarut berkurang.
c. Sementara kompleks transfer biaya juga menimbulkan warna, warna
sering terlalu kuat untuk digunakan dalam pengukuran kuantitatif. Hukum
Beer-Lambert menyatakan bahwa absorbansi larutan berbanding lurus
dengan konsentrasi spesies menyerap dalam larutan dan panjang jalan.
Jadi, UV / VIS spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan
konsentrasi dalam larutan penyerap dan mengetahui seberapa cepat perubahan
absorbansi dengan konsentrasi.

C. KOMPONEN-KOMPONEN PADA SPEKTROFOTOMETER

Yang pertama adalah sumber cahaya, Sebagai sumber cahaya pada
spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan
intensitasnya tinggi.Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak,
ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan
kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola
lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang ( λ) adalah 350 – 2200
nanometer (nm). Sumber cahaya ini digunakan untuk radiasi kontinyu:
 Untuk daerah UV dan daerah tampak.
 Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan.

2
Panjang gelombang (nm) Warna Warna Komplementer

400 – 435 Lembayung (violet) Kuning-hijau

435 – 480 Biru Kuning

480 – 490 Hijau-biru Jingga

490 – 500 Biru-hijau Merah

500 – 560 Hijau Ungu (purple)

560 – 580 Kuning-hijau Lembayung (violet)

580 – 595 Kuning Biru

595 – 610 Jingga Hijau-biru

610 – 750 Merah Biru-hijau

Tabel 4. Spektrum Tampak dan Warna-warna Komplementer

Warna Intervalλ Intervalν

Red 625 to 740 nm 480 to 405 THz

Orange 590 to 625 nm 510 to 480 THz

Yellow 565 to 590 nm 530 to 510 THz

Green 520 to 565 nm 580 to 530 THz

Cyan 500 to 520 nm 600 to 580 THz

Blue 430 to 500 nm 700 to 600 THz

Violet 380 to 430 nm 790 to 700 THz

3
Tabel 5. Spektrum cahaya tampak (visible
Hal kedua yang diperlukan adalah pembaur cahaya yang disebut
monokromator yang di video memberikan sinar pelangi, karena dari sana
kemudian kita bisa memilih panjang gelombang yang diinginkan/diperlukan.
Pada video yang diperlihatkan sinar tampak atau untuk spektro visible, tapi
untuk UV pun kerjanya sama, hanya saja tidak akan terlihat oleh mata kita.
Hal ketiga adalah tempat sampel atau kuvet, pada praktikum tempat
meletakan kuvet ada dua karena alat yang dipakai tipe double beam,
disanalah kita menyimpan sample dan satu lagi untuk blanko. Pada
pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca dan daerah UV
digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR.
Keempat adalah detektor atau pembaca cahaya yang diteruskan oleh
sampel,terjadi pengubahan data sinar menjadi angka yang akan ditampilkan
pada reader (komputer). Komponen lain yang nampak penting adalah cermin-
cermin dan tentunya slit (celah kecil) untuk membuat sinar terfokus dan tidak
membaur tentunya, jadi satu hal penting dalam pekerjaan dengan
spektrofotometer Uv-Vis adalah harus dihindari adanya cahaya yang masuk
ke dalam alat, biasanya pada saat menutup tempat kuvet, karena bila ada
cahaya lain otomatis jumlah cahaya yang diukur menjadi bertambah.

D. MEKANISME CARA KERJA SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat
polikromatis di teruskan melalui lensa menuju kemonokromator pada
spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator akan
mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal).
Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian dilewatkan pada
sampel yang mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena
itu, terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan.
Cahaya yang dilewatkan ini kemudian di terima oleh detector. Detector
kemudian akan menghitung cahaya yang diterima dan mengetahui cahaya
yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi

4
zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat
dalam sampel secara kuantitatif.

E. METODE PENGGUNAAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

1. Nyalakan PC dan boot sistem operasi PC. Jika printer telah terhubung ke
sistem, maka nyalakan printer.
2. Nyalakan spektrofotometer uv-vis dan tunggu sampai cahaya indikator
spektrofotometer uv-visberwarna hijau. Proses ini meliputi pengujian
spektrofotometer dan mengambil waktu sekitar 1 menit.
3. Letakkan sampel yang telah dimasukkan kedalam kuvet pada sample
compartment. Sebelum sample di ukur, preparasi sample terlebih dahulu.
4. Kita siap untuk menggunakan sistem.
5. Lampu hijau akan berkedip, hal ini bahwa menunjukkan pengukuran
sedang berlangsung.
6. Jika spektrofotometer uv-visberhenti, hal ini menunjukkan bahwa
pengukuran telah siap berlangsung.
7. Data absorbansi dan spektrum akan terbaca di komputer,yang berbentuk
grafik hubungan antara panjang gelombang dengan absorbansi.

5
 BAB II
SPEKTROFLUOROMETRI

A. PENGERTIAN SPEKTROFLUOROMETRI
Metode spektrofluorometri adalah suatu metode pengukuran
berdasarkan sinar yang berfluoresensi. Fluoresensi adalah gejala dari suatu
molekul setelah radiasi cahaya, melepas kembali radiasi tadi dengan
panjang gelombang yang lebih panjang. Fluoresensi akan nampak jelas
apabila penyerapan sinar pada daerah ultraviolet dan melepaskannya
dalam daerah gelombang nampak.

B. KEGUNAAN SPEKTROFLUOROMETRI
Spektrofluorometri dapat digunakan untuk analisa kualitatif dan
analisis kuantitatif. Analisa kualitatif dapat digunakan sebagai
perbandingan spektrumfluoresensi yang dapat membantu pengenalan
senyawa. Sedangkan analisa kuantitatif dapat digunakan untuk mengukur
kadar yang sangat rendah dengan ketepatan, keterulangan dan kepekaan
tinggi. Misalnya pengukuran kadar vitamin E.
Bila panjang gelombang emisi dan eksitasi telah dipilih, maka
dapat dibuat hubungan antara intensitas fluoresensi dengan konsentrasi
senyawa. Intensitas fluoresensi tergantung dari tingkat konsentrasi
senyawa. Hubungan tersebut berupa garis lurus (linear) pada konsentrasi
sangat rendah. Apabila kadarnya terlalu tinggi, larutan tersebut tidak linear
lagi karena akan menyerap sebagian sinar eksitasi.

6
C. KOMPONEN SPEKTROFLUOROMETRI

Komponen pokok spektrofluorometri terdiri dari beberapa komponen,

antara lain :
1. Sumber energi eksitasi
Banyak terdapat sumber radiasi. Lampu merkuri relatif stabil dan
memancarkan energi terutama pada panjang gelombang diskret.
Lampu tungsten memberikan energi kontinyu di daerah tampak.
Lampu pancar xenon bertekanan tinggi seringkali digunakan pada
spektrofluorometer karena alat tersebut merupakan sebuah sumber
dengan intensitas tinggi yang menghasilkan energi kontinyu dengan
intensitas tinggi dari ultraviolet sampai inframerah. Pada filter
fluorometer ( fluorimeter ) digunakan lampu uap raksa sebagai sumber
cahaya dan energi eksitasi diseleksi dengan filter. Pada
spektrofluorimeter biasanya digunakan lampu Xenon ( 150 W ) yang
memancarkan spectrum kontinu dengan panjang gelombang 200-
800nm. Energi eksitasi diseleksi dengan monokromator eksitasi (
grating ).
2. Kuvet Untuk sampel
Sel spesimen yang digunakan dalam pengukuran fluoresensi dapat
berupa tabung bulat atau sel empat persegi panjang (kuvet), sama
seperti yang digunakan pada spektrofotometri resapan, terkecuali
keempat sisi vertikalnya dipoles. Ukuran spesimen uji yang sesuai
adalah 2 ml sampai 3 ml, tetapi beberapa instrumen dapat disesuaikan
dengan sel-sel kecil yang memuat 100 μl hingga 300 μl atau dengan

7
 pipa kapiler yang hanya memerlukan jumlah spesimen yang kecil.
Spektrofotometer harus dioperasikan sesuai dengan petunjuk pabrik
pembuat. Bila panjang gelombang untuk eksitasi di atas 320nm dapat
digunakan kuvet dari gelas, akan tetapi untuk eksitasi pada panjang
gelombang yang lebih pendek digunakan kuvet dari silika. Kuvet tidak
boleh berfluoresensi dan tidak boleh tergores karena dapat
menghamburkan.
3. Detector
Pada umumnya fluorometer menggunakan tabung-tabung
fotomultiplier sebagai detektor, banyak tipe dari jenis tersebut yang
tersedia dan masing - masing mempunyai ciri khusus yang berkenaan
dengan daerah spektral dengan kepekaan maksimum, menguntungkan
dan derau secara elektrik. Arus foto diperbesar dan dibaca pada sebuah
meter atau perekam. Seperti pada spektrofotometri, detektor yang biasa
digunakan adalah ‘fotomultiplier tube’ atau ‘thermocouple’. Pada
umumnya, detektor ditempatkan di atas sebuah poros yang membuat
sudut 90° dengan berkas eksitasi. Geometri sudut siku ini
memungkinkan radiasi eksitasi menembus spesimen uji tanpa
mengkontaminasi sinyal luaran yang diterima oleh detektor
fluoresensi. Akan tetapi tidak dapat dihindarkan detektor menerima
sejumlah radiasi eksitasi sebagai akibat sifat menghamburkan yang ada
pada larutan itu sendiri atau jika adanya debu atau padatan lainnya.
Untuk menghindari hamburan ini maka digunakan instrument yang
bernama filter.
4. Monokromator
Ini menggunakan sepasang monokromator (grating) untuk
menyeleksi radiasi eksitasi dan emisi yang lebih akurat (memberikan
kepekaan yang tinggi) sehingga kesulitan - kesulitan tersebut diatas
dapat diatasi. Monokromator pertama mendispersikan cahaya dari
sumber cahaya sehingga menghasilkan radiasi eksitasi yang
monokromatis. Sample yang tereksitasi kemudian berfluoresensi

8
 sehingga merupakan sumber cahaya bagi monokromator kedua.
Dengan alat ini dapat dibuat spekrum eksitasi maupun emisi.
5. Fluorometer
Filter pertama hanya meneruskan cahaya ultraviolet dari sumber
cahaya yaitu radiasi dengan panjang gelombang yang cocok untuk
eksitasi specimen uji. Filter kedua meloloskan hanya panjang
gelombang yang sesuai dengan fluoresensi maksimum dari zat yang
diperiksa dan menahan setiap cahaya eksitasi yang terhambur. Jenis
filter kedua ini biasanya yang menahan panjang gelombang pendek.
Persoalan yang dihadapi pada pemilihan filter yaitu panjang
gelombang yang lebih panjang yang diteruskan oleh filter pertama juga
lolos pada daerah panjang gelombang yang lebih pendek dari filter
kedua, sehingga menghasilkan blangko yang tinggi. Disamping itu
sukar untuk mendapatkan filter dengan panjang gelombang yang cocok
dengan radiasi eksitasi karakteristik untuk sample.

D. MEKANISME CARA KERJA atau METODE PENGGUNAAN

SPEKTROFLUOROMETRI

Pada fluorometri, larutan zat disinari dengan sinar panjang

gelombangnya disekitar panjang gelombang maksimum penyerapan
maksimum yang berasal dari lampu raksa atau lampu pijar yang telah
disekat dengan filter. Intensitas diukur atau dibandingkan dengan inensitas

9
larutan baku. Sinar fluoresensi dibebaskan dari sinar hambura dengan
melewatkan sinar melalui filter atau monokromator. Cara pengukuran
pada dasarnya sama dengan cara spektrofotometri, karena zat organic yang
berfluorosensi mungkin terurai secara fotokimia, penyinaran harus
dilakukan sesingkat munkin. Oleh karena daerah dimana intensitas
fluorosensi sebanding dengan kadar umumnya sangat sempit, maka
perbandingan (c - d) / (a - b) tidak boleh kurang dari 0,40 dan tidak boleh
lebih dari 2,50.
Keterangan :
a : Pembacaan intensitas fluoresensi larutan baku
b : embacaan intensitas fluoresensi larutan blangko untuk zat baku
c : Pembacaan intensitas fluoresensi larutan uji
d : Pembacaan intensitas fluoresensi larutan blangko untuk zat uji
Prinsip Dasar Fluoresensi
1. Keadaan eksitasi singlet
Elektron pada orbital energi lebih tinggi memiliki arah spin
berlawanan relative terhadap elektron dalam orbital lebih rendah.
2. Keadaan eksitasi triplet
Elektron valence tereksitasi secara spontan berbailk arah spinnya
(spin flip). Proes ini disebut intersystem crossing (perpindahan antar
sistem). Electrons dalam kedua orbital sekarang memiliki arah spin
sama.
Jenis Emisi
1. Fluoresensi
Kembali dari keadaan eksitasi singlet ke keadaan dasar, tidak
memerlukan perubahan arah spin (relaksasi yang lebih lazim, proses
lebih cepat).
2. Fosforesensi
Kembali dari keadaan eksitasi triplet ke keadaan dasar; elektron
perlu perubahan arah spin (proses lebih lama).
• Laju emisi fluoresensi beberapa tingkat lebih cepat daripada fosforesensi
(karena perubahan arah spin perlu waktu).

10
 E. CONTOH ANALISA SPEKTROFLUOROMETRI DALAM
BIDANG FARMASI

VALIDASI METODE SPEKTROFLUOROMETRI UNTUK PENENTUAN

ALFA TOKOFEROL DALAM MINYAK JAGUNG
Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri Ujungpandang, Makassar*
(email: irawatileny@yahoo.co.id)

1. Pendahuluan
Validasi metode adalah suatu proses yang digunakan untuk
mengkonfirmasi bahwa prosedur analisis yang digunakan untuk suatu uji
tertentu telah sesuai peruntukannya.
Parameter yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode
analisis antara lain adalah spesifisitas, akurasi, presisi, limit deteksi, limit
kuantitasi, linearitas, rentang dan ketegaran /robustness.
Untuk menentukan kadar alfa tokoferol dalam makanan dan
produk pangan, beberapa metode telah dilakukan antara lain metode
kolorimetri, spektrofotometri, kromatografi lapis tipis dan metode
fluorometri.
Kemampuan alfa tokoferol untuk berfluoresensi digunakan sebagai
dasar untuk penentuan secara kuantitatif dan diaplikasikan untuk
menentukan alfa tokoferol dalam sampel matriks biologi menggunakan
alat spektrofluorometer. Spektrofluorometer juga telah digunakan untuk
analisis alfa tokoferol dalam suplemen makanan, pada minyak zaitun dan
pada sediaan farmasi.
Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode
spektrofluorometri pada penentuan alfa tokoferol minyak jagung. Manfaat
penelitian ini adalah memperoleh metode baru untuk analisis alfa tokoferol
minyak yang tervalidasi dan dapat digunakan dalam analisis rutin di
laboratorium.

11
2. Alat dan Bahan
Penelitian ini menggunakan instrumen Spektrofluorometer
Shimadzu RF 5301 PC dengan lampu Xenon sebagai sumber cahaya,
kuvet non fluoresensi, Vorteks VM 300 dan seperangkat alat gelas. Bahan
yang digunakan adalah standar murni alfa tokoferol dari Sigma Aldrich
(BM 430,71 g/mol), n- Heksan dari Merck, dan minyak jagung komersial.

3. Cara kerja
a. Pembuatan larutan standar alfa tokoferol
Dibuat larutan standar alfa tokoferol dengan konsentrasi 1000
mg/L dengan pelarut n-heksan yang kemudian diencerkan menjadi
100 mg/L. Larutan standar ini kemudian diencerkan menjadi 0.5, 1, 2,
4, 8, dan, 16 mg/L. kemudian dilakukan pengukuran intensitas
fluoresensi untuk menentukan linearitas, presisi, akurasi, limit
deteksi, dan limit kuantitasi.
b. Penentuan λ eksitasi dan λ emisi
Panjang gelombang eksitasi dan emisi ditentukan dengan membaca
spektrum salah satu standar.
c. Pembuatan kurva standar dan penentuan linieritas
Presisi ditentukan dengan mengukur intensitas fluoresensi
larutan standar 0.5 -16 mg/L secara intra hari dan antar hari. Untuk
intra hari dilakukan pengukuran sebanyak lima kali ulangan pada hari
yang sama, sedangkan untuk antar hari dilakukan lima kali
pengukuran selama lima hari berturut-turut.
d. Penentuan Akurasi
Dilakukan dengan menambahkan 1 mg/L, 8 mg/L dan 16 mg/L
α-tokoferol standar terhadap sampel minyak jagung .
R% = [ ( A – B ) / C ] x 100
A = Konsentrasi spike sampel
B = Konsentrasi sampel
C = Konsentrasi spike

12
 e. Penentuan Limit deteksi dan Limit kuantitasi
Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung berdasarkan standar
deviasi pembacaan blanko atau standar yang paling dekat dengan
blanko.
LOD = X + 3 SD
LOQ= X + 10 SD
f. Pengukuran alfa tokoferol minyak jagung dengan spektrofluorometer
Sebanyak 1.0 mL sampel minyak jagung dilarutkan dengan n-
heksan dalam labu ukur 10 mL, divorteks selama 5 menit, dimasukkan
ke dalam kuvet non fluoresensi, lalu diukur intensitas fluoresensinya
sebanyak 5 kali ulangan.

4. Pembahasan
Pada penelitian ini, konsentrasi alfa tokoferol ditentukan
menggunakan Spektrofluorometer pada panjang gelombang eksitasi 293
nm dan panjang gelombang emisis 352 nm. Berdasarkan perhitungan
statistik regresi linear diperoleh nilai koefisien korelasi untuk alfa
tokoferol yaitu 0,998 dengan persamaan garis y=5,771x+3,082. Hal ini
menunjukkan bahwa metode analisis alfa tokoferol menggunakan
spektrofluorometer memiliki linieritas yang baik. Linieritas adalah
kemampuan ( dalam rentang penggunaan ) dari suatu metode untuk
memberikan hasil uji secara proporsional terhadap kepekatan yang ada.
Linieritas suatu metode harus diuji untuk membuktikan adanya hubungan
yang linier antara konsentrasi analit dan respon alat, selain itu linieritas
juga dapat digunakan untuk mengetahui kemampuan standar dalam
mendeteksi analit dalam contoh. Linieritas yang baik ditunjukan dengan
harga r yang mendekati satu. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi
persyaratan menurut ICH (1995) adalah lebih besar dari 0.9970.
Akurasi merupakan ukuran ketepatan dari suatu metode pengujian,
atau kedekatan antara nilai hasil uji yang diukur dan nilai benar, atau nilai
konvensional atau nilai acuan yang dapat diterima. Intensitas fluoresensi
spike sampel diukur lalu dihitung % recovery. Mean Recovery untuk

13
 konsentrasi bawah sebesar 102.5 %, untuk konsentrasi tengah sebesar
100.5 % dan untuk konsentrasi atas sebesar 99.4 %. Hasil yang diperoleh
masih memenuhi kriteria pengukuran recovery yaitu 95-110%.
spektrofluorometri memiliki sensitifitas yang tinggi. Berbeda dengan
pengukuran absorbsi, emisi foton dideteksi pada saat kembali ke keadaan
dasar mengakibatkan spektroskopi fluoresensi memiliki sensitifitas yang
sangat tinggi, 100-1000 kali lebih tinggi dibandingkan teknik absorbsi
sehingga dapat mengukur konsentrasi rendah hingga ppb.
Dari hasil pengukuran dan perhitungan diketahui bahwa
konsentrasi alfa tokoferol dalam minyak jagung adalah 38.98 ± 0.02 mg/L.

5. Kesimpulan
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa metode
spektrofluorometri untuk penentuan alfa tokoferol minyak jagung telah
tervalidasi dengan baik. Metode ini relatif mudah, sensitif, cepat,
ekonomis sehingga dapat digunakan untuk analisis rutin di laboratorium.

14
 BAB III
POTENSIOMETRI

A. PENGERTIAN POTENSIOMETRI
Potensiometri adalah metode analisa kimia untuk menentukan
potensial listrik dengan menggunakan elektroda, dan alat yang digunakan
dalam potensiometri ini adalah potensiometer. Potensiometri merupakan
aplikasi langsung dari persamaan Nernst dengan cara pengukuran
potensial dua elektroda tidak terpolarisasi pada kondisi arus nol.
Persamaan Nersnt memberikan hubungan antara potensial relative suatu
elektroda dan konsentrasi spesies ioniknya yang sesuai dengan larutan.
Dengan pengukuran potensial reversible suatu elektroda, maka
perhitungan aktivitas atau konsentrasi suatu komponen dapat dilakukuan.
Pengukuran potensial elektroda banyak digunakan untuk dalam ilmu
kefarmasian terutama untuk pengukuran pH. Metode analisis
potensiometri ini didasarkan pada pengukuran potensial sel elektrokimia.

Suatu eksperimen dapat diukur dengan menggunakan dua metode

yaitu, pertama (potensiometri langsung) yaitu pengukuran tunggal terhadap
potensial dari suatu aktivitas ion yang diamati, hal ini terutama diterapkan
dalam pengukuran pH larutan air. Kedua (titrasi langsung), ion dapat dititrasi
dan potensialnya diukur sebagai fungsi volume titran. Potensial sel, diukur
sehingga dapat digunakan untuk menentukan titik ekuivalen. Suatu petensial
sel galvani bergantung pada aktifitas spesies ion tertentu dalam larutan sel,

15
pengukuran potensial sel menjadi penting dalam banyak analisis kimia
(Basset, 1994).

B. KEGUNAAAN POTENSIOMETRI
Metode potensiometri sering digunakan untuk :
1. Mengukur konsentrasi suatu larutan
2. Dibidang industri digunakan untuk analisis klorida pada pul dan kertas
3. Dalam bidang pertanian digunakan untuk analisis nitrat dalam sampel
tanah
4. Dalam bidang kontrol bahan makanan diguanakan untuk analisis NO3-,
F-, Br- , Ca2+ dalam minuman, susu, daging, atau jus buah
5. Dalam bidang analisis digunakan untuk menentukan titik akhir titrasi
pada titrasi asam basa juga titrasi redoks, pengendapan dan
pembentukan kompleks.
6. Dalam bidang farmasi digunakan untuk menganalisis suatu sediaan
atau senyawa obat menggunakan peralatan listrik atau sejenisnya untuk
mengukur harga potensialnya. Dimana dari harga potensial yang
diukur maka konsentrasi ion dalam larutan atau sedian-sediaan farmasi
tersebut dapat dihitung.

C. ALAT YANG DIBUTUHKAN DALAM METODE

POTENSIOMETRI
1. Ph Meter
Pada prinsipnya pengukuran suatu pH adalah didasarkan pada
potensial elektro kimia yang terjadi antara larutan yang terdapat
didalam elektroda gelas (membrane gelas) yang telah diketahui dengan
larutan yang terdapat diluar elektroda gelas yang tidak diketahui. Hal
ini dikarenakan lapisan tipis dari gelembung kaca akan berinteraksi
dengan ion hidrogen yang ukurannya relatif kecil dan aktif, elektroda
gelas tersebut akan mengukur potensial elektrokimia dari ion hidrogen
atau diistilahkan dengan potential of hidrogen.

16
2. Elektroda
Elektroda pada potensiometri meliputi :
 elektrode pembanding (refference electrode)
 elektroda indikator ( indicator electrode )

a. Elektode Pembanding
Suatu elektrode pembanding (refference electrode)
memiliki syarat yaitu harga potensial setengah sel yang diketahui,
konstan, dan sama sekali tidak peka terhadap komposisi larutan
yang sedang selidiki.. Pasangan elektrode pembanding adalah
elektrode indikator (disebut juga working electrode) yang
potensialnya bergantung pada konsentrasi zat yang sedang
diselidiki. Syaratnya antara lain :
 Mematuhi persamaan Nersnt bersifat reversible
 Memiliki potensial elektroda yang konstan oleh waktu
 Segera kembali keharga potensial semula apabila dialiri arus
yang kecil
 Hanya memiliki efek hysterisis yang kecil jika diberi suatu
siklus suhu
 Merupakan elektroda yang bersifat nonpolarisasi secara ideal

17
Elektroda pembanding ada beberapa macam, diantaranya :
 Elektroda Kalomel (Saturated Calomel Electrode)
Elektroda Kalomel merupakan elektrode yang terdiri dari
lapisan Hg yang ditutupi dengan pasta Merkuri (Hg), Merkuri
Klorida /Komel (Hg2Cl2) dan kalium klorida (KCl). Setengah
sel elektrode kalomel dapat ditunjukan sebagai berikut:

KCl || Hg2Cl2 (sat’d), KCI (x M) | Hg

Dengan x menunjukkan konsentrasi KCl didalam larutan. Reaksi

elektroda dapat dituliskan sebagai:
Hg 2CI2 (s) + 2 e¯ è 2 Hg (l) + 2 CI ¯
Potensial sel ini akan bergantung pada konsentrasi klorida x (pada
kalomel yang tidak jenuh), dan harga konsentrasi ini harus
dituliskan untuk menjelaskan elektroda.

Elektroda kalomel terbuat dari tabung gelas atau plastik

dengan panjang 5 – 15 cm dan garis tengah 0,5 – 1 cm. Pasta
Hg/HgCI terdapat di dalam tabung yang lebih dalam,
dihubungkan dengan larutan KCI jenuh melalui lubang kecil.
Kontak elektroda ini dengan larutan dari setengah sel lainnya
melalui penyekat yang terbuat dari porselen atau asbes berpori.

 Elektroda perak / perak klorida

Elektroda perak / perak klorida merupakan electrode yang
terdiri dari suatu elektroda perak yang dicelupkan kedalam
larutan KCI yang dijenuhkan dengan AgCI. Setengah sel
elektroda perak dapat ditulis :
KCl | | AgCI (sat’d), KCI (xM) | Ag

Reaksi setengah selnya adalah :

AgCI (s) + e- è Ag (s) + CI-
Biasanya elektroda ini terbuat dari suatu larutan jenuh atau
3,5 M KCI yang harga potensialnya dalah 0,199 V (jenuh) dan

18
 0.205 V (3,5M) pada 250 C. Kelebihan elektroda ini dapat
digunakan pada suhu yang lebih tinggi sedangkan elektroda
kalomel tidak.

b. Elektrode Indikator (Indicator Elektrode)

Elektroda indikator (elektroda kerja) adalah suatu elektroda
yang potensial elektrodanya bervariasi terhadap konsentrasi
(aktivitas) analit yang diukur. Elektroda indikator harus memenuhi
beberapa syarat antara lain harus memenuhi tingkat kesensitivan
yang terhadap konsentrasi analit. Tanggapannya terhadap
keaktifan teroksidasi dan tereduksi harus sedekat mungkin dengan
yang diramalkan dengan persamaan Nernst. Sehingga adanya
perbedaan yang kecil dari konsentrasi analit, akan memberikan
perbedaan tegangan. Elektroda indikator secara umum
dikelompokkan menjadi 2 bagian yaitu :
 Elektroda indikator logam
Elektroda logam adalah elektroda yang dibuat dengan
menggunakan lempengan logam atau kawat yang dicelupkan
ke dalam larutan elektrolit.
 Elektroda redoks ( inert )
Logam mulia seperti platina, emas, dan paladium bertindak
sebagai elektroda indikator pada reaksi redoks. Fungsi logam
semata-mata untuk membangkitkan kecenderungan system
tersebut dalam mengambil atau melepaskan electron; logam itu
sendiri tidak ikut serta secara nyata dalam reaksi redoks,
potensialnya merupakan fungsi Nersnt dari rasio aktivasi
aFe2+/aFe3+. Tentu saja, inert merupakan ukuran relatif, dan
platina tidak kebal dari serangan-seranga oksidator kuat,
terutama dalam larutan dimana kompleksasi bias menstabilkan
Pt(II) melalui pembentukan spesies.
Platina juga bisa menimbulkan masalah dengan reduktor-
reduktor yang sangat kuat: reduksi H+ (atau H2O) kadang-
kadang berlangsung sedemikian lambat sehingga analit-analit

19
 bias direduksi lebih dahulu dalam larutan air tanpa interfensi
dari pelarutnya, tetapi karena H+ e = ½ Hkek2 dikatalis oleh
platina, keuntungan kinetik ini mungkin hilang.
Contoh potensial elektroda platina di dalam larutan yanfg
mengandung ion-ion Ce3+ dan Ce4+ adalah,
E = E0 – 0,059 log [Ce3+]/[Ce4+]
Dengan demikian elektroda platina dapat bertindak
sebagai elektroda indikator di dalam titrasi cerimetri.

3. Alat pengukur potensial

Pada dasarnya pengukuran potensial baterai biasa tidak sulit untuk
dilakukan dengan menggunakan volt meter, akan tetapi pengukuran
potensial galvani yang digunakan dalam potensiometri tidak
sederhana, karena kapasitasnya sangat rendah yang disebabkan oleh
besarnya tahanan dalam sel tersebut ( 106 – 107 ohm atau lebih untuk
elektroda gelas ), sehingga alat voltmeter elektronik khusus diperlukan
untuk pengukuran potensial elektroda sel tersebut. Alat ukur khusus ini
digunakan sebagai pH meter, voltmeter tahanan tinggi, potensiometer
dan ion meter, alat – alat ini dikocok untuk pengukuran potensial pada
sel galvani yang terdiri dari sebuah elektroda pembanding dan sebuah
elektroda indikator seperti elektroda logam, elektroda selektif – ion
atau elektroda indikator lainnya.

D. MEKANISME CARA KERJA

Potensiometri merupakan salah satu cara pemeriksaan fisik kimia
yang menggunakan peralatan listrik untuk mengukur potensial elektroda,
besarnya potensial elektroda ini tergantung pada kepekatan ion–ion
tertentu dalam larutan, karena itu dengan memakai persamaan Nernst :
E = Eo + K log (c)
Dimana :
E = sel potensial yang diukur
Eo = konstan selama pemberian suhu
C = konsentrasi yang ditentukan

20
K = RT log ( 10 ) / n F
Dimana:
R = gas konstan
T = suhu absolut
F = suhu faraday konstan
N = nomer dari elektron atau diambil dari satu molekul yang ditentukan
Tetapi dalam kenyataan ( n ) tidak diperlukan, itu terjadi jika ( n )
merupakan muatan yang sama dan telah terbentuk menjadi ionic dari yang
telah ditentukan. Sehingga kepekatan ion dalam larutan dapat dihitung
langsung dari harga potensial yang diukur itu.
Potensial suatu elektroda tidak dapat diukur tersendiri, tetapi dapat
ditentukan dengan menggunakan elektroda indikator dengan elektroda
pembanding yang hanya memiliki harga potensial yang tetap selama
pengukuran.
Elektroda pembanding yang diambil sebagai baku international
adalah elektroda hidrogen baku. Harga potensial elektroda ini ditetapkan
nol pada kesadahan baku ( H+ )= 1 M, tekanan gas H2 = 1 atm dan suhu
25o C, sedangkan gaya gerak listrik ( GGL ) pasangan elektroda itu diukur
dengan bantuan potensiometer yang sesuai, dan sering digunakan peralatan
elektronik ( volt meter ).
Prinsip potensiometri didasarkan pada pengukuran potensial listrik
antara elektroda indikator dan elektroda yang dicelupkan pada larutan.
Untuk mengukur potensial pada elektroda indikator harus digunakan
elektroda standar yaitu berfungsi sebagai pembanding yang mempunyai
harga potensial tetap selama pengukuran.

21
E. CONTOH ANALISIS METODE POTENSIOMETRI DI BIDANG
FARMASI

PENGARUH ASAM ASKORBAT, KREATININ, DAN GLUKOSA PADA

ANALISIS ASAM URAT SECARA POTENSIOMETRI
MENGGUNAKAN ELEKTRODA PASTA KARBON TERMODIFIKASI
MOLECULARLY IMPRINTED POLYMER

Asam urat merupakan senyawa yang berada bersama-sama dengan

senyawa lain yang ada pada sampel serum seperti asam askorbat, kreatinin,
dan glukosa, sehingga analisisnya seringkali diganggu oleh senyawa tersebut.
Pada penelitian ini mempelajari pengaruh asam askorbat, kreatinin, dan
glukosa pada analisis asam urat secara potensiometri menggunakan elektroda
pasta karbon termodifikasi MIP. MIP dibuat dengan cara mereaksikan asam
metakrilat, etilen glikol dimetakrilat, asam urat, dan benzoil peroksida dengan
perbandingan mol 1:3:1:1. Metode analisis asam urat secara potensiometri
dilakukan pada larutan dengan pH 5. Pada penelitian ini diperoleh jangkauan
pengukuran antara 10-7-10-4 M dengan faktor Nernst 24,2 mV/dekade,
linieritas kurva kalibrasi 0,9963, dan recovery sebesar 74,4-115,5%. Pada
penelitian ini adanya asam askorbat, kreatinin, dan glukosa dalam larutan
terbukti tidak mengganggu analisis asam urat secara potensiometri
menggunakan elektroda pasta karbon termodifikasi karena nilai koefisien
selektifitasnya kurang dari satu. Sehingga, dapat dijadikan sebagai metode
alternatif untuk analisis asam urat.

22
 BAB IV
COULOMETRI

A. Pengertian
Koulometri adalah suatu metode analisis yang didasarkan
pada prinsip kuantitas kelistrikan (pengukuran coulomb), yang
mempelajari hubungan antara konsentrasi dengan muatan listrik.
Koulometri menunjukkan kepengukuran coloumb yaitu banyaknya
listrik. Dalam kimia analitik, istilah ini bearti suatu pengukuran
coulomb dengan keadaan sedemikian rupa, hingga banyaknya yang
diukur berhubungan dengan suatu reaksi elektrokimia tertentu. Ini
memungkinkan suatu perhitungan yang sederhana, dan yang
menjurus, berdasarkan Hukum Faraday.
Apabila suatu arus 1 ampere lewat selama 1 detik, maka
banyaknya listrik yang tersangkut adalah 1 coulomb.

B. KegunaanAlat
a. Alat Pengukur Arus
Arus yang digunakan padat itrasi koulometri basanya dalam
rentang 1 hingga 50 mA. Arus-arus konstan dapat diperoleh
dengan mudah menggunakan baterai dengan suatu tahanan
pengatur seri. Penyesuaian tahanan seri ini secara berkala
diperlukan untuk menjaga agar arus tetap konstan. Alat yang lebih
teliti dan seksama untuk pengukuran arus adalah dengan
menggunakan potensiometer.
b. Pengukuran Waktu
Sebuah stop-clock listrik dijalankan dengan cara membuka dan
menutup rangkaian elektrolisis, untuk pengendalian secara baik
maka perlu dilengkapi dengan rem magnetic dimana di mulai
berjalan dan berhentinya serempak dengan di mulai dan
dikehendakinya arus. Pengukuran waktu arus listrik.

23
 c. Sel Koulometrik
Sel koulometrik terdiri dari electrode generator (electrode
kerja) sebagai tempat dihasilkannya titran secara listrik dan
electrode pembantu. Elektrode kerja yang umum digunakan adalah
dari bahan platinum. Bagian linnya adalah electrode indicator yang
terdiri dari sepasang lembaran tipis platinum atau terdiri dari
sebuah platinum dan lainnya adalah sebuah electrode pembanding
kalmel jenuh.

C. KomponenAlat
a. Submer arus listrik dan jam
Sumber arus listrik dan jam di pasang bersama-sama. Sumber
arus yang digunakan merupakans uatu volta searus searah yang
tinggi dan dihubungkan seri dengan suatu resistor besar, sehingga
perubahan resistans selelektrolisiss elamatitrasi dapat diabaikan
dan arus tetap konstan.
b. Elektroda Generator
Elektroda yang bisa digunakan adalah suatu potongan platina,
yang ditempatkan di dalam larutan yang dianalisis dalam suatu
gelas/kaca frit.
c. Elektroda Indikator
d. Elektroda Pembantu
Diletakkan di dalam ruang yang terpisah dari elektroda
generator, yang dasarnya berupa cakram saringan terbuat dari kaca
masir. Pemisahan elektroda pembantu tersebut bertujuan untuk
mencegah terangkutnya produk elektroda apapun yang tidak di
inginkan ke dalam larutan uji oleh aliran cairan
e. Stirer (pengaduk magnetic)

24
D. MekanismeAlat
a. Elektroda platina ditempatkan langsun gtercelup pada
larutan yanga akan dianalisa dan elektroda pembantu pada
tempat yang terpisah, dengan menggunakan saringan gelas.
Penentuan digunakan untuk mencegah transpor konvektif
dari setiap hasil reaksi dalam elektroda yang tidak di
inginkan masuk ke dalam larutan uji.
b. Lonceng dan sumber arus dihubungkan dengan kawat
bersama-sama menjadi satu saklar untuk menjalankan
keduanya.
c. Sumber arus menyediakan pilihan beberapa harga untuk
arus tetap antara 1 s/d 200 milli ampere kemudian dipilih
sumber arus tetap tertentu, arus yang sesuai maka lonceng
akan memberikan tanda.
d. Titrasi dilaksanakan dengan menghidupkan saklar
(sepertikranburet) sehingga akan terjadi reaksi dari unsur
yang di inginkan. Banyaknya coulomb ditentukan oleh
jumlah waktu yang digunakan pada suatu arus tetap. Untuk
mengetahui titik ekivalen maka digunakan indikator.
Misalnya: Penentuan brom dengan menggunakan fenol
sebagai penitrer dengan menggunakan indikator
indigokarmin.

E. MetodePenggunaan
Metoda coulometri merupakan metode yang sangat efektif
dengan jumlah analit sangat kecil. Ada beberapa metode analisis
dalam koulometri, yaitu koulometri potensial terkendali, titrasi
koulometr.
1. Coulometri Potensial Terkendali
Suatu cara untuk mencegah reaksi elektrode yang tak
diharapkan adalah dengan mengendalikan potensial elektroda.
Dalam coulometri potensial terkendali digunakan elektroda

25
kerja yang berfungsi sebagai acuan untuk mengukur potensial
elektroda test, elektroda pembantu yang berfungsi untuk
menyediakan arus pada larutan elek trolit, dan suatu potensi
ostat yang merupakan pengontrol potensial elektroda test di
nilai yang di inginkan. Dalam pelaksanaan metode koulometri
potensial terkendali, arus akan agak melemah yang
mengakibatkan arus menjadi tidak konstan, sehingga coulomb
total (C) memiliki rumus: C = ∫0i dt dimana integral tersebut
menyatakan luas di bawah kurva arus-waktu.
Coulometri potensial terkendali telah diterapkan dalam
penetapan sejumlah logam seperti tembaga, kadnium, perak,
dan uranium; senyawa organik; ion halida; dan penetapan nilai
–n dalam penyelidikan reaksi elektrokimia baru.

Alat yang digunakan dalam kulometri potensial terkendali,

dapat ditinjau dalam tiga pokok pembahasan:
1. Sel
Pada koulometri potensial tetap, terdapat dua jenis sel yang
digunakan, yaitu: Jenis pertama terdiri dari elektrode kerja
(kasaplatina) dan elektroda pasangan (kawatplatina), yang
dipisahkan dari larutan yang di uji oleh tabung berpori yang
mengandung elektroli telektroda pendukung yang sama seperti
di dalam larutan yang di uji. Pemisahan elektroda dipasang
untuk mencegah hasil reaksi dari gangguan di dalam analisis.
Elektroda pembanding kolomel jenuh dihubungkan dengan
larutan yang di uji dengan bantuan jembatan garam. Jenis
kedua adalah bejana berisiraksa yang digunakan untuk
memisahka nunsur-unsur yang mudah di reduksi sebagai
langkah pendahuluan dalam analisis.
Contoh : tembaga, nikel, kobalt, segera dipisahkan dengan
ion aluminium, logam alkali, dan pospat. Endapan unsure-

26
unsur yang larut di dalam raksa, dengan potensial tinggi
hidrogen sedikit dibebaskan akibat kelebihan arus yang tinggi.
2. Potensiostat
Potensiostat adalah alat elek tronik yang menjaga potensial
elektroda kerja tetap dibandingkan dengan elektroda
pembanding. Untuk mengerti kontrol potensial katode yang di
uji dalam system, pertama perhatikan terlebih dahulu cara kerja
sirkuit tanpa penguat.
3. Integrator
Kebanyakan alat - alat koulometri potensial tetap yang
canggih menggunakan integrator yang langsung menunjukan
jumlah koulom yang diperlukan untuk menyelesaikan suatu
elektrolisis.

27
 F. Contoh Penelitian Coulometri

PENGEMBANGAN METODE COULOMETRI BERBASIS RBF NEURAL

NETWORK UNTUK MENDUKUNG PEMANFAATAN BATERAI
TIMBAL ASAM SEBAGAI SUMBER ENERGI MOBIL LISTRIK
Dr. Bambang Sri Kaloko, ST., MT. /NIDN. 0002047105
Suprihadi Prasetyono , ST.,MT. /NIDN. 0004047001
Dibiayai oleh
Daftar Isian Pelaksanaan Anggaran (DIPA) Universitas Jember TA 2015 No. SP DIPA-
042.01.2.400922/2016 tanggal 7 Desember 2015

Pendahuluan
Kebijakan Pemerintah tentang penghematan penggunaan BBM pada
sektor transportasi serta isu pemanasan global pada pertemuan Kyoto
mewajibkan untuk mengurangi emisi gas rumah kaca sehingga perlu
dikembangkan suatu trasportasi yang hemat BBM dan ramah lingkungan.
Salah satu upaya untuk mengurangi ketergantungan pada BBM dan
mengurangi polusi lingkungan hidup adalah dengan membuat mobil listrik
(Kaloko et all, 2011).
Mobil listrik membutuhkan energi listrik dari media yang memiliki
dimensi tidak besar, dapat dipindah tempat, dapat diisi ulang dan dapat didaur
ulang. Baterai yang digunakan untuk mobil listrik harus memiliki daya tinggi,
energi besar, kapasitas besar, memiliki masa pakai dan masa kerja yang panjang
serta dapat didaur ulang dengan harga yang tidak terlalu mahal.
Baterai sebagai sumber energi pada mobil listrik merupakan suatu sel
elektrokimia yang terdiri dari empat komponen dasar yaitu plat positif, plat
negatif, larutan elektrolit, dan separator atau pemisah yang berfungsi sebagai
isolasi antara elektroda positif dan negatif. Reaksi kimia diantara plat-plat dengan
larutan elektrolit akan menghasilkan potensial listrik.
Metode
Secara keseluruhan penelitian baterai pada mobil listrik dikembangkan
dalam dua tahap yaitu yang pertama dengan mengadakan kegiatan studi melalui
pemodelan dan simulasi dengan menggunakan Matlab/Simulink dan tahap

28
kedua dengan implementasi pada percobaan skala laboratorium (micro
laboratory) dengan langkahlangkah sebagai berikut :
 Identifikasi, berupa pengembangan metode Coulometri dan metode
radial basis function neural network dengan menggabungkan kedua
metode tersebut. Langkah selanjutnya dengan mengintegrasikan metode
tersebut pada model mobil listrik beserta komponen-komponen
pendukungnya antara lain switching elektronik, motor induksi tiga fasa
dan kontroler.
 Koordinasi antara konstanta-konstanta parameter pada daya dan energi
baterai melalui kontroler berbasis kecerdasan buatan

29
 BAB V
Spektrofotometer Serapan Atom/
Atomic Absorption -Spectrofotometer (AAS)

A. Spektrofotometer Serapan Atom

Absorbsi (serapan) atom adalah suatu proses penyerapan bagian sinar oleh
atom-atom bebas pada panjang gelombang (λ) tertentu dari atom itu
sendiri sehingga konsentrasi suatu logam dapat ditentukan. Karena absorbansi
sebanding dengan konsentrasi suatu analit, maka metode ini dapat digunakan
untuk sistem pengukuran atau analisis kuantitatif.
Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) dalam kimia analitik dapat
diartikan sebagai alat untuk menganalisa unsur-unsur logam dan semi logam
dalam jumlah renik (trace). Prinsip dasar Spektrofotometri serapan atom
adalah interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan sampel.
Spektrofotometri serapan atom merupakan metode yang sangat tepat untuk
analisis zat pada konsentrasi rendah (Khopkar, 1990).
Cara kerja Spektroskopi Serapan Atom ini adalah berdasarkan atas
penguapan larutan sampel, kemudian logam yang terkandung di dalamnya
diubah menjadi atom bebas. Atom tersebut mengapsorbsi radiasi dari sumber
cahaya yang dipancarkan dari lampu katoda (Hollow Cathode Lamp) yang
mengandung unsur yang akan ditentukan. Banyaknya penyerapan radiasi
kemudian diukur pada panjang gelombang tertentu menurut jenis logamnya
(Darmono,1995). Kegunaan dari alat SSA ini dalam bidang industri adalah
untuk menentukan konsentrasi atau kadar debu atau partikulat yang
mengandung logam-logam berat seperti Pb, Cd, As, Sb, Zn, Cr dan Tl
(Tellurium) yang keluar dari cerobong pabrik.

B. Bagian-Bagian Spektrofotometer Serapan Atom

Alat spektrofotometer serapan atom pada intinya terdiri atas lima bagian
utama yaitu :
1. Sumber sinar, bagian untuk menghasilkan sinar yang energinya dapat
diserap oleh atom-atom unsure yang dianalisis. Sumber radiasi yang

30
 digunakan umumnya lampu katoda cekung (hallow chatode lamp). Setiap
pengukuran dengan SSA kita harus menggunakan Hallow Cathode Lamp
khusus misalnya akan menentukan konsentrasi tembaga dari suatu
cuplikan. Hallow Cathode akan memancarkan energi radiasi yang sesuai dengan
energi yang diperlukan untuk transisi elektron atom.
Hallow Cathode Lamp terdiri dari katoda cekung yang silindris
yang terbuat dari unsur yang sama dengan yang akan dianalisis dan anoda
yang terbuat dari tungsten. Dengan pemberian tegangan pada arus
tertentu, logam mulai memijar dan dan atom-atom logam katodanya akan
teruapkan dengan pemercikan. Atom akan tereksitasi kemudian
mengemisikan radiasi pada panjang gelombang tertentu (Khopkar, 1990).
2. Sistem pengatoman (Atomizer),
Sumber atomisasi dibagi menjadi dua yaitu sistem nyala dan sistem
tanpa nyala. Kebanyakan instrumen sumber atomisasinya adalah nyala dan
sampel diintroduksikan dalam bentuk larutan. Sampel masuk ke nyala
dalam bentuk aerosol. Aerosol biasa dihasilkan oleh nebulizer (pengabut)
yang dihubungkan ke nyala oleh ruang penyemprot (chamber spray). Jenis
nyala yang digunakan secara luas untuk pengukuran analitik adalah udara-
asetilen dan nitrous oksida-asetilen.
Nyala udara asetilen, biasanya menjadi pilihan untuk analisis
mengunakan SSA. Temperatur nyalanya yang lebih rendah mendorong
terbentuknya atom netral dan dengan nyala yang kaya bahan bakar
pembentukan oksida dari banyak unsur dapat diminimalkan. Sedangkan
nitrous oksida-asetilen, dianjurkan dipakai untuk penentuan unsur-unsur
yang mudah membentuk oksida dan sulit terurai. Hal ini dikarenakan
temperatur nyala yang dihasilkan relatif tinggi. Unsur-unsur tersebut
adalah: Al, B, Mo, Si, So, Ti, V, dan W.
Prinsip dari SSA, larutan sampel diaspirasikan ke suatu nyala dan
unsur-unsur di dalam sampel diubah menjadi uap atom sehingga nyala
mengandung atom unsur-unsur yang dianalisis. Beberapa diantara atom
akan tereksitasi secara termal oleh nyala, tetapi kebanyakan atom tetap
tinggal sebagai atom netral dalam keadaan dasar (ground state). Atom-

31
 atom ground state ini kemudian menyerap radiasi yang diberikan oleh
sumber radiasi yang terbuat dari unsur-unsur yang bersangkutan. Panjang
gelombang yang dihasilkan oleh sumber radiasi adalah sama dengan
panjang gelombang yang diabsorbsi oleh atom dalam nyala.
3. Monokromator
yaitu alat yang berfungsi untuk memisahkan radiasi yang tidak
diperlukan dari spektrum radiasi lain yang dihasilkan oleh Hallow Cathode
Lamp.
4. Detektor
yaitu alat yang mengubah energi cahaya menjadi energi listrik,
yang memberikan suatu isyarat listrik berhubungan dengan daya radiasi
yang diserap oleh permukaan yang peka.
5. Sistem pengolah
Sistem pengolah berfungsi untuk mengolah kuat arus dari detektor
menjadi besaran daya serap atom transmisi yang selanjutnya diubah
menjadi data dalam sistem pembacaan.
6. Sistem pembacaan
Sistem pembacaan merupakan bagian yang menampilkan suatu
angka atau gambar yang dapat dibaca oleh mata.
Adapun skema alat selengkapnya adalah sebagai berikut:

32
C. Cara Kerja Spektrofotometer Serapan Atom
Mekanisme kerja dari alat spektrofotometer serapan atom (SSA) adalah
sebagai berikut:
1. Sumber sinar yang berupa tabung katoda berongga (Hollow Chatode
Lamp) menghasilkan sinar monokromatis yang mempunyai beberapa garis
resonansi.
2. Sampel diubah fasenya dari larutan menjadi uap atom bebas di dalam
atomizer dengan nyala api yang dihasilkan dari pembakaran bahan bakar
dengan oksigen.
3. Monokromator akan mengisolasi salah satu garis resonansi yang sesuai
dengan sampel dari beberapa garis resonansi yang berasal dari sumber
sinar.
4. Energi sinar dari monokromator akan diubah menjadi energi listrik dalam
detector.
5. Energi listrik dari detektor inilah yang akan menggerakkan jarum dan
mengeluarkan grafik.
6. Sistem pembacaan akan menampilkan data yang dapat dibaca dari grafik.

Gambar skema kerja AAS

D. Metode Penggunaan
1. Menyiapkan alat spektrofotorneter sebagai berikut:
a. Nyalakan alat spektrofotometer serapan atom dengan menekan tombol
on/off.
b. Pasang larnpu katoda cekung sesuai unsur yang akan dianalisis pada
ternpat lampu.
c. Biarkan alat hidup selama 15menit (untuk pemanasan).

33
2. Pemrograman alat spektrofotometer serapan atom dan penentuan kondisi
analisis.
a. Tekan tanda [Param Entry]
untuk rnengatur parameter-parameter yang akan dilakukan dalam analisis,
maka akan keluar tulisan berikut pada papan bacaan, yang menyatakan
rnetode yang ingin dipakai dengan metode yang dipilih atau defaultnya:

Jika diplih Y maka anda harus mengatur sendiri kondisinya, tetapi jika
diplih N maka kondisi defaultnya (kondisi sebelumnya) yang akan dipakai.
Silahkan kelik N kemudian tekan [Enter].
b. Memilih posisi lampu.

Alat ini mempunyai 6 posisi larnpu yang dapat ditempati, maka kita
memilih posisi lampu dengan unsure yang sesuai dengan menekan angka 1
sampai 6 sesuai dengan jenis unsurnya. Misalnya untuk analisis unsure Ca
kita tekan angka 1 kemudian tekan [Enter]. Posisi 2: Me berarti lampu dua
adalah lampu multielement (unsure). Bila memilih posisi 2 rnaka akan
keluar unsure-unsur dalam larnpu tersebut yang diurutkan rnulai nornor 1,
2 dan seterusnya. Kita tingal memilih unsure yang kita inginkan dengan
menekan angka yang sesuai dengan nomor unsure.
c. Waktu integrasi

Waktu integrasi ini adalah waktu integrasi lampu katoda cekung. Waktu
integrasi sudah diprogram 0,10 detik, bila anda ingin mengubah tekan
angka yang anda inginkan. Misalnya anda ingin mengubah waktu integrasi
0,3detik maka tekan [O], [.], [3] kemudian tekan [Enter].

34
d. Pengulangan pembacaan

Data diatas dibaca 1 kali ubah pengulangan menjadi 3 kali dengan menekan
[3] kemudian [Enter].
e. Kurva kalibrasi ditampilkan sebagi berikut:

Sistem telah diprogram dengan kurva kalibrasi non linier. Karena sudah
sesuai dengan cara analisis maka tekan [Enter].
f. Tehnik jenis pengukuran:

Data dibaca dengan sistem hold (ruang yang menyatakan jumlah atom).
Karena pilihan defaultnya adalah data hold maka cukup menekan [Enter].
g. Pengaturan larutan standar :

Ketika konsentrasi larutan standart pertama yang dipakai. Misalnya

standart Pertama 1 ppm maka tekan [1], [.], [0], [0] kemudian tekan
[Enter].
h. Pengaturan larutan standart baku (reslope standar) :

Ketik konsentrasi larutan standart yang dipakai untuk standart patokan

(baku), biasanya larutan standart pertama yang dipakai untuk standart baku.
Misalnya standart pertama 1 ppm maka tekan [1], [.], [0], [0] kemudian
tekan [Enter].
i. Pengaturan waktu pembacaan di layar :

35
 Ini adalah waktu jeda saat kita tekan dengan pemunculan di Jayar. Pada alat
ini sudah terprogram waktu jeda 0,1detik, maka tinggal menekan [enter].
j. Mencetak kondisi kalibrasi dan kurva kalibrasi :

Bila ingin mencetak kondisi-kondisi standart yang tetah dibuat/deprogram

di atas maka kita pilih Y(yes) dan mencetak grafik dengan ukuran tertentu
(1-3), ukuran standart adalah 1, maka jika kita pilih 1 dan menekan [enter]
maka kondisi standart akan tercetak dan grafik akan terecatk setelah kita
memperoleh data serapan sejumlah larutan standar yang digunakan.
k. Pengaturan jenis sampel dan lain-lain.
Sistem umumnya dipakai nilai defaultnya maka beberapa pilihan tinggal
menekan [enter].

E. Teknik – Teknik Analisis

Dalam analisa secara spektrometri teknik yang biasa dipergunakan antara
lain :
1. Metode kurva kalibrasi
Dalam metode kurva kalibrasi ini, dibuat seri larutan standard dengan
berbagai konsentrasi dan absorbansi dari larutan tersebut diukur dengan
SSA. Selanjutnya membuat grafik antara konsentrasi (C) dengan
Absorbansi (A) yang akan merupakan garis lurus melewati titik nol
dengan slope = ε. B atau slope = a.b, konsentrasi larutan sampel diukur
dan diintropolasi ke dalam kurva kalibrasi atau di masukkan ke dalam
persamaan regresi linear pada kurva kalibrasi.
2. Metode standar tunggal
Metode ini sangat praktis karena hanya menggunakan satu larutan
standar yang telah diketahui konsentrasinya (Cstd). Selanjutnya absorbsi
larutan standard (Astd) dan absorbsi larutan sampel (Asmp) diukur dengan
spektrofotometri.

36
3. Metode adisi standard
Metode ini sering dipakai karena mampu meminimalkan kesalahan
yang disebabkan perbedaan kondisi lingkungan (matriks) sampel dan
standard. Dalam metode ini dua atau lebih sejumlah volume tertentu dari
sampel dipindahkan ke dalam labu takar. Satu larutan diencerkan sampai
volume tertentu, kemudian diukur absorbansinya tanpa ditambah dengan
zat standard, sedangkan larutan yang lain sebelum diukur absorbansinya
ditambah terlebih dulu dengan sejumlah tertentu larutan standard dan
diencerkan seperti pada larutan yang pertama.

37
 F. Contoh Penelitian Menggunaka Alat Spektrofotometer Serapan Atom

PENGUJIAN KANDUNGAN MERKURI DALAM SEDIAAN

KOSMETIK DENGAN SPEKTROFOTOMETRI SERAPAN ATOM
1
Livia Syafnir, 2Arlina Prima Putri
1,2
Program Studi Farmasi, Universitas Islam Bandung, Jl. Purnawarman No. 63 Bandung
40116 E-mail: livia.syafnir@yahoo.com, arlinaprimaputri@gmail.com,

Pendahuluan
Merkuri (Hg) mulai dimanfaatkan dalam bidang kosmetik sebagai salah
satu zat pembuat sediaan kosmetik karena kemampuannya dalam
menghambat pembentukan melanin pada permukaan kulit. Merkuri mampu
menjadikan kulit putih mulus dalam waktu yang relatif singkat, akan tetapi zat
ini memberikan efek negatif bagi kesehatan, karena dapat terakumulasi di bawah
kulit.
Mengingat efek samping yang membahayakan, maka diperlukan
penelitian terhadap sediaan pemutih yang beredar di pasaran untuk mengetahui
apakah masih ada sediaan sediaan kosmeti k kulit yang mengandung senyawa
merkuri sebagai zat aktif. Pada penelitian ini, jumlah sampel yang digunakan
adalah 10 macam sediaan kosmetik yang diambil berdasarkan kecenderungan
pemakaian konsumen yang tinggi terhadap produk tersebut dari beberapa toko
kosmetik yang berlokasi di Bandung.
Metode Penelitian
Analisis Merkuri akan dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif.
Analisis kualitatif dilakukan dengan menggunakan pereaksi warna dan
pembentukan amalgam. Analisis kuantitatif dilakukan dengan metoda
Spektrofotometri Serapan Atom (SSA), metode ini dipilih karena relatif
sederhana dan memerlukan waktu analisis yang singkat serta sangat sensitif.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan dan kadar merkuri
dalam sediaan kosmetik yang diteliti.
Pembahasan
Berdasarkan data hasil analisis kualitatif terhadap hasil destruksi dengan
pereaksi KI, NaOH dan kawat tembaga, keberadaan senyawa merkuri pada

38
seluruh sampel tidak terdeteksi. Analisis merkuri pada sejumlah sampel
secara kualitatif, dilakukan dengan kawat tembaga dan pereaksi yang dibuat
tepat sebelum analisis dilakukan. Berdasarkan hasil yang didapat, keberadaan
senyawa merkuri pada seluruh krim pemutih tidak terdeteksi. Hal ini terjadi
karena analisis kualitatif bersifat kurang sensitif (membutuhkan analit dalam
jumlah besar) dan adanya beberapa faktor yang mempengaruhi seperti adanya
gangguan dari pelarut.
Analisis kandungan merkuri menggunakan metode SSA tanpa nyala, metode
ini dipilih karena sederhana dan memerlukan waktu analisis yang singkat
serta sangat sensitif untuk konsentrasi kecil. Mekanisme kerja dari SSA yaitu
atomisasi ion logam menjadi ion yang tidak bermuatan yang kemudian
mengabsorbsi sinar dari lampu katoda.
Pengukuran seluruh sampel dengan metode SSA tanpa nyala, menunjukkan
adanya senyawa merkuri pada krim pemutih seperti. Dengan kadar masing-
masing, yaitu 51,49; 40,93; 46,44; 42,49; 27,97; 0,43; dan 65,01; 27,37; 23,15;
20,15mg/g. Kadar merkuri terbesar terdapat pada sampel G sedangkan kadar
terkecil terdapat pada sampel F.
Penutup
Analisis keberadaan senyawa merkuri pada krim kosmetik dilakukan
secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif memberikan hasil keberadaan
senyawa merkuri pada seluruh krim kosmetik tidak terdeteksi. Analisis kuantitatif
menggunakan metoda SSA, dengan kondisi analisis menggunakan SSA tanpa
nyala, diatur pada sumber cahaya lampu katoda Hg berongga, lebar celah 0,5
nm, arus lampu 3 mA, pendeteksian pada panjang gelombang 253,7 nm. Hasil
analisis kuantitatif menunjukkan semua krim kosmetik mengandung senyawa
merkuri dengan kadar antar rentang 0,43 – 65,01 mg/g. Kadar merkuri terbesar
terdapat pada sampel G sebesar 65,01 mg/g sedangkan kadar terendah
terdapat pada sampel F sebesar 0,43 mg/g. Akurasi 99,45 %, presisi 99,54 %,
dengan limit deteksi hingga 0,064 ppb.

39
 BAB VI
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

A. Pengertian
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut
dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan
metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk :
menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino,
asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menetukan
kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis,
atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.

B. Komponen

Diagram di atas menunjukkan komponen utama yang terdapat pada

HPLC. Larutan sampel diinjeksikan melalui injektor (3) dan terbawa oleh
fase gerak (1) melewati fase diam pada kolom (5), kemudian hasilnya
dibaca oleh detektor (6) dan ditampilkan pada pengolah data (7) sebagai
kromatogram.
Berbeda dengan kromatografi kolom tradisional yang memanfaatkan
gravitasi agar fase gerak dapat melalui fase diam, HPLC menggunakan
pompa bertekanan tinggi (2) untuk mengalirkan fase gerak menuju kolom
fase diam.

40
C. Sistem Peralatan
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak,
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator
atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1) Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah
pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai
wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak
antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri
atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam
lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase
diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun
dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan
harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel
kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain

41
 terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase
gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase
gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman
suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk
meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel
mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak yang paling sering
digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.
Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan
pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis
alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding
dengan fase terbalik.

2) Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa
harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk
pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa
yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000
psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3
mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2
jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan
aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

42
3) Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke
dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat
dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.

4) Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat
fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama
dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih
kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100
μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat
kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer
massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih
pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah
sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini
tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk
analisis rutin.3]

43
 Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan
reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase
diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan
senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun
tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk
solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril)
lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika
yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang
bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5) Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks
bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut:
 Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan
reprodusibel.
 Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu
mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
 Stabil dalam pengopersiannya.
 Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu
meminimalkan pelebaran pita.

44
  Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi
solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
 Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir
fase gerak.

6) Pengolah Data
Pengolah data menampilkan output visual hasil analisis yang
terbaca oleh detektor dalam bentuk kromatogram. Kromatogram
menggambarkan jumlah komponen pada sampel dilihat dari jumlah
puncak (peak) yang dihasilkan. Konsentrasi komponen yang hendak
dianalisis dapat dihitung dengan membandingkan luas area peak
komponen dengan luas area peak serta konsentrasi standar.

D. Mekanisme
Sesuai namanya, prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi
untuk mengukur sampel. Dalam kromatografi, analisis dilakukan dengan
cara memisahkan molekul berdasarkan perbedaan struktur ataupun
komposisinya. Pemisahan tersebut terjadi saat sampel bergerak melewati
fase diam (dapat berupa zat padat atau cair) karena terbawa oleh fase gerak

45
 (dapat berupa zat cair atau gas).
Beragam komponen dalam sampel akan terpisah berdasarkan
perbedaan afinitasnya terhadap fase diam. Komponen yang dapat
berinteraksi secara kuat dengan fase diam akan bergerak lebih lambat
sehingga dapat terpisah dari komponen lain dengan interaksi yang lemah.
Ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom
maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-
senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil
pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang
gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya
dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan
integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung
online dengan alat HPLC tersebut.

E. Metode Penggunaan
1) Metode Penggunaan Alat
Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-
mula sampel diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke
injection hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC
dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT
dalam tekanan tinggi.
Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan
fase diam yaitu biasanya H2SO4 0,05 N dan CH3OH berdasarkan
afinitas elektron. Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan
matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini
memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan
di bawah peak untuk mengetahui kadar analit.
Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang
diplotkan dengan least square. Sesuai dengan pengerjaan least square,
maka sebelum menggunakan HPLC untuk analit, kita harus membuat
kurva standar terlebih dahulu dengan menggunakan larutan standar.

46
 Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa
gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi
Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa
yang tertahan kuat pada kolom.

2) Metode Melihat Seluruh Proses Diagram Alir HPLC

 Injeksi sample
Proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan
kromatografi gas.
 Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui
kolom menuju detektor Waktu retensi diukur berdasarkan waktu
dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian
puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang
berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.

 Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati
kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu
penggunaan serapan ultra-violet.

 Interpretasi output dari detector

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana
masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang
melalui detektor dan menyerap sinar UV. Area yang berada dibawah
puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area
ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area
dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat
sederhana).Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan
berkurang meskipun waktu retensi akan sama.

47
F. Contoh Analisa
HPLC kerap digunakan dalam industri farmasi atau laboratorium
farmasi sebagai metode analisis sampel. Namun HPLC juga memiliki
kegunaan dalam bidang lain seperti pada industri makanan dan minuman,
analisis lingkungan, forensik, serta pada tes klinis.
Dalam bidang farmasi, HPLC dapat digunakan untuk menguji
stabilitas obat, uji disolusi, serta quality control. Sedangkan pada industri
makanan dan minuman, HPLC dapat digunakan pada beragam analisis
seperti untuk analisis keberadaan senyawa polisiklik, analisis kadar gula dan
pengawet, atau pengukuran kualitas minuman ringan dan air. Pada bidang
lain, HPLC dapat pula digunakan untuk analisis antibiotik dalam darah,
analisis kokain pada urin, dan sebagainya.
Contoh analisa penggunaa HPLC dapat dilihat pada jurnal yang
berjudul “Validasi Metode HPLC untuk Penetapan Aspirin dan Asam
Salisilat dalam Plasma Kelinci (Lepus curpaeums) secara Simultan” pada
halaman selanjutnya.

48
 Validasi Metode HPLC untuk Penetapan Aspirin dan Asam Salisilat dalam
Plasma Kelinci (Lepus curpaeums) secara Simultan
Agus Siswanto1, Achmad Fudholi2, Akhmad Kharis Nugroho2, Sudibyo Martono2
1
Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto, Dukuh Waluh, Purwokerto,
Indonesia2 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Sekip Utara, Jogjakarta, Indonesia*E-mail:
gus_ump@yahoo.com

Pendahuluan
Aspirin merupakan obat analgesik, antiinflamasi dan antipiretik yang
sangat luas penggunaannya. Dalam dosis rendah, aspirin digunakan sebagai zat
antitrombosis untuk mencegah agregasi platelet melalui penghambatan enzim
siklooksigenase.
Aspirin diabsorpsi secara cepat di saluran pencernaan bagian atas,
terutama di bagian pertama duodenum. Setelah pemberian secara oral, aspirin
terhidrolisis secara cepat di dalam tubuh menghasilkan asam salisilat sebagai
metabolit utama. Bioavailabilitas aspirin rendah akibat first pass effect
metabolism dan hidrolisis menjadi salisilat di dinding usus.
Banyak penelitian melaporkan bioavailabilitas aspirin dalam bentuk
asam salisilat. Oleh karena itu, pemantauan asam salisilat sebagai metabolit
utama dalam darah bersama-sama aspirin sangat diperlukan untuk
menentukan profil farmakokinetik aspirin.
Metode Penelitian
metode analisis kadar obat dalam sampel hayati merupakan kunci utama
kesahihan data. Metode analisis HPLC untuk menetapkan aspirin dan asam
salisilat dalam plasma telah dikembangkan. Beberapa penelitian menggunakan
metode HPLC untuk menetapkan aspirin sebagai senyawa tunggal atau
penetapan aspirin bersama dengan asam salisilat. Penelitian ini bertujuan
untuk menentukan beberapa parameter validasi penentuan kadar aspirin dan
asam salisilat dengan metode HPLC serta kemanfaatannya pada uji
farmakokinetik aspirin setelah diberikan secara intravena.

49
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan meliputi asam benzoat, asam salisilat, etanol
absolut, KH2PO4, HPO3, asam perklorat 60 %, dan kalium oksalat (derajat
analisa, Merck). Asetonitril LiChrosolv dan metanol LiChrosolv (pro HPLC,
Merck). Aspirin, N2cair, kelinci jantan (Lepus curpaeums) dengan bobot 3-
3,5 kg sebanyak 3 ekor, dietil eter dan akuabides.
Alat yang digunakan meliputi HPLC Shimadzu (LC-10ATVP, SPD-10A
VP, SCL-10A VP), kolom HPLC (LiChroCART 250×4,6 mm Purospher Star
RP18 Endcapped 5 µm, Merck), mikropipet 10-100 µL, mikropipet 1001000
µL, neraca analitik, pH meter,eppendorf centrifuge 5418, jarum suntik 1 mL,
mikrotube, autovortex SA5, sonikator, Haier Deep freezer.
Pembahasan
Metode HPLC dalam penelitian ini merupakan hasil pengembangan dari
metode-metode yang telah ada dengan berbagai modifikasi dan penyesuaian.
Asam benzoat digunakan sebagai standar internal dalam proses ekstraksi
sampel plasma. Oleh karena itu, diperlukan uji validitas metode analisis
aspirin dan asam salisilat dalam plasma dengan beberapa tahapan untuk
mendapatkan metode analisis yang sesuai,antara lain: pemilihan komposisi fase
gerak dan kolom yang sesuai, metode ekstraksi yang tepat, dan validasi
metode analisis yang diusulkan.
Penggunaan standar internal dalam preparasi sampel yang rumit dan
panjang diperlukan untuk untuk mengkoreksi sampel yang hilang selama
preparasi. Dengan memperhatikan polaritas analit aspirin dan asam salisilat
maka kebanyakan peneliti menggunakan senyawa asam sebagai standar internal
seperti asam p-toluat, asam benzoat dan senyawa analognya.
Dalam proses ekstraksi ini dipilih asam benzoat sebagai standar
internal. Penggunaan asam benzoat sebagai standar internal memberikan hasil
yang memuaskan karena: kromatogram terpisah sempurna dari peak aspirin
dan asam salisilat (Rs > 2), TR asam benzoat (6,86 menit) dekat dengan
aspirin (5,85 menit) dan asam salisilat (8,53 menit), dapat me-mimic analit pada
tiap tahap preparasi sampel.

50