Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Química y Biología

Laboratorio Análisis Instrumental II

LaboratorioNº1: Aplicación de los principios

de florescencia molecular mediante técnicas
analíticas (fluorimetría)

Nombre: Felipe Vilches

Profesor: Mauricio Escudey
Fecha de Entrega: 12/10/18
Muestra Problema: FV-2
 Resumen

En este práctico se aplicarán los principios básicos de la fluorimetría y características de un

espectro de fluorescencia a partir de una molécula altamente fluorescente como los es la
riboflavina (vitamina B), en solución de ácido acético al 5%. Para ello se confeccionara una
curva de calibrado, de distintas concentraciones ( 0 a 1 ppm en intervalos de crecimiento de
0.2), para así poder trabajar una muestra problema, la cual se lograra identifica mediante este
método analítico su concentración.

Introducción

La fluorimetría es un método analítico que principalmente corresponde a la determinación

de concentraciones basado en la medida de la intensidad de la radiación emitida por la
excitación de un material fluorescente, la cual es proporcional a la concentración de dicho
material en una muestra dada. (1)
La fluorescencia molecular es un proceso fotoluminiscente en donde la molécula se éxito por
medio de la absorción de radiación electromagnética (luz), de este modo se produce un salto
de un estado fundamental a un estado de mayor energía, y el electrón es capaz de poblar
niveles energéticos superiores, donde posteriormente esta se relaja llegando nuevamente a su
estado fundamental dando paso a la emisión de fotones produciéndose la fluorescencia.
Esta técnica es particularmente una de las técnicas mayormente utilizadas si la molécula es
altamente fluorescente, ya que su característica más atractiva es el tipo de sensibilidad que
presenta, habitualmente de uno a tres ordenes de magnitud mayore que la espectroscopia de
absorción. [2]
Las transiciones fluorescentes más importantes, son aquellas que presentan las moléculas
orgánicas con sistemas Pi conjugados o grupos funcionales con pares electrónicos libres,
generalmente Nitrógeno, Oxigeno y Azufre .Presentando así transiciones   * para
moléculas con sistemas conjugados pi o n  * para moléculas con grupos funcionales
(O,N,S), las cuales son de más baja energía y las transiciones más probables .
Figura N°1: Diagrama de transiciones energéticas   * y n  * donde se evidencia
que estas transiciones son las menos energéticas.
HO

HO H
HO H
HO H
H H
H3 C N N O

NH
H3 C N
O

Figura N° 2: estructura de la riboflavina, donde podemos evidencias sus sistemas pi

conjugados, y la presencia de grupos funcionales (N y O)
La riboflavina es una molécula altamente fluorescente en solución de ácido acético al 5%, la
cual es posible cuantificar ya que la fluorimetría permite relacionar linealmente la intensidad
de emisión con la concentración del analito en estudio.
Para que se cumpla esto se debe trabajar con soluciones de concentraciones bajas, ya que a
altas concentraciones el comportamiento lineal se ve afectado, esto se debe a que la potencia
de la radiación fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitación que
es absorbido por el sistema.
F = K' (P0 - P) (ec.1)
Con objeto de relacionar F con la concentración c, la ley de Beer se escribe:
P/ P0 = 10-εbc (ec.2)
Sustituyendo:
F = K' P0 (1 - 10-εbc)
Si se desarrolla el término exponencial como una serie;
F = K' P0 [2,303εbc – (2,303 εbc)2/ 2! + (2,303 εbc)3 / 3! - …. ] (ec.3)
Siempre que A = εbc < 0,05 se puede decir que:
F = K'P0 2,303εbc (ec.4)
Al dejar P0 constante:
F = Kc (ec.5)
De esta forma es posible obtener una representación gráfica donde existe una relación lineal
entre la potencia de emisión fluorescente con la concentración de las especies. Cuando la
concentración aumenta lo suficiente como para que la absorbancia sea mayor a 0.05 ( εbc >
0.05) la relación que corresponde a la (ec.5) pierde su linealidad y a esto se le conoce como
absorción primaria.[2]
 Objetivos

 Estudiar los principios de la fluorimetría y las características de un espectro

fotómetro de fluorescencia.
 Analizar y determinar la concentración de una muestra problema de Riboflavina por
el método de curva de calibración.

Equipos, Materiales y Reactivos

 Fluorímetro y celdas.
 Solución stock de riboflavina de 100 ppm en ácido acético al 5% vol/vol (se debe
mantener en lugar oscuro y fresco).
 Solución de ácido acético al 5%.
 Matraces volumétricos y pipetas.

Procedimiento Experimental
1.-A partir de una solución estándar de 250 ppm de riboflavina, se preparó una solución que
contenga 10 ppm (solución I)
2.-A partir de la solución I se preparó soluciones de riboflavina de 0,2 – 0,4 – 0,6 – 0,8 y 1,0
ppm utilizando ácido acético al 5% como solvente, se preparó también un blanco de ácido
acético.
3.- Se encendió el equipo el cual ya estaba calibrado para realizar las medidas con longitudes
de onda de absorción de 450 nm y emisión de 528nm .
4.- se leyó la intensidad de la fluorescencia tanto para la muestra problema como para los
estándares.
5.- Se graficó la intensidad de emisión vs concentración y se determinó la concentración de
la muestra problema

Resultados

Las mediciones se realizaron en un espectrofotómetro de fluorescencia, el que se ajustó a una

longitud de onda de 450nm, produciéndose una emisión a 528nm. A partir de la solución de
riboflavina de 250 ppm se preparó una solución de 10ppm en ácido acético al 5% de ella, se
prepararon soluciones estándares además de una curva de calibrado que se resumen en las
siguientes tablas con sus respectivas señales.
Tabla N°1: medidas de blanco, obteniendo promedio y desviación estándar
Medidas de blanco (nm)
1.- 6.718
2.- 6.556
3.- 6.722
4.- 6.661
5.- 6.722
6.- 6.744
7.- 6.775
8.- 6.655
9.- 6.667
10.- 6.527
X= 6.680 DE:0.084

Tabla N°2: Concentración e intensidad de emisión (nm) de diferentes soluciones de una

muestra de riboflavina.

Concentración (ppm) Intensidad de emisión (nm)

0,0 6.680
0,2 139.000
0,4 278.485
0,6 414.719
0,8 545.010
1,0 665.603
Gráfico 1: Concentración e intensidad de emisión de diferentes soluciones de una muestra
de riboflavina.

700
intensidad de fluorescencia (nm)

600

500

400

300
Equation y = a + b*x
Adj. R-Square 0.99892
Value Standard Error
200 Intensidad de fluore Intercept 12.645 7.18178
scencia
Intensidad de fluore Slope 659.861 10.82694
scencia
100

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Concentracion (ppm)

Ecuacion de la Recta: y = 659.861x + 12.645

Luego de realizada la curva de calibrado se midió la intensidad de emisión de la muestra

problema, obteniéndose los resultados de la Tabla 3

Tabla N°3: Intensidad de emisión obtenidas para la muestra problema MF-2.

Intensidad de emisión muestra Concentracion (ppm)

problema (nm)
247.137 0.358
252.306 0.364
X = 249.722 0.361
 Tratamiento de datos

Con los valores obtenidos podemos evidenciar de este modo primero los límites de detección
y de cuantificación que el equipo puede entregar, sabiendo que el límite de detección será la
concentración mínima que el equipo puede medir, mientras que el límite de cuantificación
será la concentración mínima de analito que se puede detectar en donde se tendrá:

Señal Límite de detección (LD): X + 3 DE

Señal Límite de cuantificación (LC): X + 10DE

De este modo obtenemos las señales tanto del límite de detección y de cuantificación:

SLD: 6.932 nm

SLC: 7.52 nm

De este modo se tienen las señales mínimas, para luego ser interpoladas en la curva de
calibrado obteniendo así las concentraciones mínimas a las cuales se puede medir (límite de
detección) y la señal mínima a la cual se produce la mayor cantidad de emisión por parte del
equipo (límite de cuantificación).

LD: 8.6 x 10 -3 ppm

LC : 7.7 x 10-3 ppm

Luego de tener este intervalo de confianza se procede a realizar los cálculos pertinentes para
la obtención de la concentración de una muestra problema, a través de la curva de calibrado
que se realizó, utilizando nuestra ecuación de la recta y los datos recogidos de la muestra
problema se tiene que:

Ecuación de la Recta: y = 659.861x + 12.645

De este modo cuantificamos a través de la ecuación de la recta por medio de las señales
obtenidas de nuestra muestra problema, en donde tendremos las concentraciones
mencionadas en la tabla N°3 , las cuales a través de tratamientos matemáticos se obtiene la
concentración real la cual esta descrita en el apéndice
 Discusión

En base a los datos obtenidos podemos presenciar que las leyes para esta espectroscopia se
cumplen, ya que se trabajó a concentraciones pequeñas para así poder obtener una
linealidad al momento de graficar como podemos ver en la grafica N°1 esto se cumple ya
que la potencia de la radiación fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz
de excitación que es absorbido por el sistema, evidenciándose por el desarrollo de las
ecuaciones 1 a 5 mencionadas en la introducción, también se debe destacar que la molécula
era altamente fluorescente, de tal modo que a concentración bajas era posible cuantificarla,
esto debido a su estructura y la composición que presentaba la cual esta descrita en la
introducción, siendo de apoyo la figura N°2.

Conclusiones
Se cuantificó la concentración del analito en la muestra por comparación de la señal obtenida
con la de los estándares mediante la interpolación en la curva de calibrado. Siendo la
concentración de la muestra problema de 1.8 ppm.

El método de la fluorimetría desarrollado es rápido, sensible y preciso, el cual conlleva una

óptima medición para la cuantificación de riboflavina en la muestra.

Se logro un óptimo aprendizaje de esta técnica, comprobando la teoría menciona en la

bibliografía

Bibliografía

 (1) J.M Costa.”Diccionario de Química Física.” Editorial Universidad de Barcelona y

Díaz de Santos. Primera Edición año 2005

 (2)Skoog, West Holler, fundamento de química analitica, quinta edición, p.841 y 846.
 Apéndice

I. Calculo los límites de detección y cuantificación:

Sabemos por las expresión de señales de limites de detección y de cuantificacion a través

de nuestra señales de blanco:
Señal Límite de detección (LD): X + 3 DE

Señal Límite de cuantificación (LC): X + 10DE

De este modo se calcula a través de los datos de nuestra curva de calibrado las señales:
SLD: 6.932 nm

SLC: 7.52 nm

Luego estas son interpoladas en nuestra ecuación de la recta:

6.932 nm = 659.861x + 12.645 ( LD) = | 8.6 x 10 -3 ppm |

7.52 nm = 659.861x + 12.645 ( LC) = | 7.7 x 10-3 ppm |

De esta manera es posible ver que las concentraciones mínimas para medir y las
concentraciones mínimas donde se producen las primera señales son del orden de ppb.

II. Calculo concentración de la muestra problema:

Una de las señales obtenidas de la muestra problema MF-2 es 247.137 nm.

Según la ecuación de la recta: y = mx + b; reemplazando se obtiene:

247.137 nm = 659.861x + 12.645

x = 0,36

debido a que la muestra problema fue diluida en un factor de 5, se procede a realizar los
cálculos para obtener la concentración real de riboflavina.

C1 x V1 = C2 x V2

0.36 ppm X 25 mL = C2 x 5 mL

C2 = 1.8 ppm
x = [riboflavina]= 1.8 ppm (concentración real de la muestra problema MF- 2 )