Universidad del Zulia

Facultad de Medicina
División de Postgrado
Maestría en Diagnóstico Bacteriológico
Bacteriología I

Instructivo de la Unidad III

Medios de Cultivo

1. Defina medio de cultivo.

Un material nutriente preparado en el laboratorio para soportar el

crecimiento de un microorganismo se denomina Medio de Cultivo.
Estos, son sustancias de origen natural o artificial, sólidos o líquidos que
le proporcionan a los microorganismos las sustancias nutritivas
necesarias para su desarrollo.

2. Evolución histórica de los medios de cultivo

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del

micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en
medios sólidos realizados a base de gelatina.
Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su
menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un
método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un
medio líquido.

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento

rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir
al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió
gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la
observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas.

En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la

microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán
Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas
rojas) como solidificante.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas

de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para
sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que
se usaban hasta entonces.
 Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus
investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de
nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo
de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de
medios de tal forma que su especial composición química favorecía el
crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus
procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su
desarrollo ciertos nutrientes del medio.

3. Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

 Contener los nutrientes esenciales en la proporción adecuada

para soportar el crecimiento de los microorganismos: Fuente de
Energía, de Carbono, de Nitrógeno, Oligoelementos, Factores de
Crecimiento y Agua.
 Poseer aceptable cantidad de sal (generalmente, Cloruro de
Sodio (NaCl), para estabilizar el medio).
 Tener humedad suficiente para permitir la proliferación de las
formas vegetativas de los microorganismos.
 Estar libre de sustancias inhibidoras para el microorganismo a
cultivar.
 Poseer un pH propiamente ajustado para el metabolismo del
microorganismo. La mayoría de las bacterias crecen bien a pH
neutro o cercano a la neutralidad (6.8 – 7.1); pero los hongos
crecen a pH más ácidos.
 El medio, originalmente, debe ser estéril - libre de toda forma de
vida – a fin de garantizar que sólo los microorganismos
inoculados estén presentes en el medio.
 Poseer una consistencia adecuada (sólido, semisólido o líquido).
 Finalmente, debe ser incubado en condiciones apropiadas:
temperatura, atmósfera y tiempo.

a) Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un cultivo adecuado

para la investigación microbiológica ha de contener como
mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fosforo y sales inorgánicas.
En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento. Ciertas bacterias tienen
necesidades nutritivas específicas, por lo que se añade a
muchos medios sustancias como sueros, sangre, etc. Muy a
menudo se añaden ciertos colorantes, bien como indicadores de
ciertas actividades metabólicas o por sus capacidades de ejercer
como inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
b) Consistencia adecuada del medio: partiendo de un medio
líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos
como gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado
 semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen
el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se
desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de
fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de
licuarla.
c) Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: gran
cantidad de bacterias pueden crecer en una atmosfera con
tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno
directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos
anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en
una atmósfera sin oxígeno ambiental. Los organismos
microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
parcialmente anaerobias, mientras los anaerobios facultativos
tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las
citadas condiciones.
d) Condiciones adecuadas de humedad: un nivel mínimo de
humedad, tanto en el medio como en la atmosfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas
microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de
estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37°C
proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la
humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar
así que se deseque el medio.
e) Luz ambiental: la mayoría de los microorganismos crecen
mucho mejor en la oscuridad que en presencia de la luz solar.
Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.
f) pH: la mayoría de los microorganismos se desarrollan mejor en
medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios
más o menos ácidos. La presencia de ácidos o bases en
cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano, pueden sin
embargo, inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos
normales.
g) Temperatura: los microorganismos mesófilos crecen de forma
óptica a temperaturas entre 15 y 43°C. Otros como los psicrófilos
crecen a 0°C y los termófilos a 80°C o incluso temperaturas
superiores (hipertermófilos).

h) Esterilidad del medio: todos los medios de cultivo deben estar

perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida
que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento
bacteriano normal del o de los especímenes inoculados en
dichos medios.
4. Clasificación de los medios de cultivo (cite ejemplos)
Los medios de cultivo pueden clasificarse atendiendo a diferentes
criterios:
1.- ESTADO FÍSICO:
Líquidos
Semisólidos
Sólidos
Cuando se desea obtener un medio sólido o semisólido se añade un
agente solidificante, como el Agar. Este es un polisacárido natural,
complejo, de elevado peso molecular, derivado de un alga marina que
ha sido ampliamente utilizado para espesar alimentos (jaleas, sopas y
helados). Este polisacárido de galactosa, posee propiedades
particularmente importantes que son idóneas para su uso en
Microbiología. Un medio líquido se denomina caldo. Ejemplo: Caldo
Soya Tripticasa (CST), Caldo Thioglicolato (CT), Aminoácidos,
Carbohidratos, etc. Como se mencionó anteriormente, los medios
semisólidos contienen agar (<0.5%) y se utilizan para estudiar la
motilidad de las bacterias o en pruebas de fermentación-oxidación de
carbohidratos. Los medios sólidos, también contienen agar; pero en
mayor concentración (1-2%). Ejemplo: Triple Azúcar Hierro (TSI), Agar
Sangre Humana (ASH), Mac Conkey (MC), Lisina Hierro Agar (LIA), etc.
2. PROCEDENCIA:
Naturales
Artificiales
Los naturales, como su nombre lo indica, contienen sustancias de
origen natural, bien sea: vegetal (Agar o Caldo con jugo de tomate para
Lactobacillus) o de origen animal (Suero sanguíneo, sangre, leche).
Ejemplo: Amarillo de Huevo Agar, Löeffler, Lowestein-Jensen.
Los artificiales son aquellos cuya composición química se conoce
exactamente. Son denominados también Sintéticos o químicamente
definidos. Son los más utilizados actualmente.
3. COMPLEJIDAD DE FÓRMULA:
Simples
Complejos
Los simples son aquellos que contienen únicamente una fuente de
energía y Carbono (Glucosa – Ácido Láctico), una fuente inorgánica de
Nitrógeno y sales inorgánicas.
Los Complejos, incorporan además de los constituyentes anteriores,
aminoácidos. La mayoría de los microorganismos heterótrofos
(bacterias y hongos) son cultivados de rutina, en medios complejos.
Estos se preparan con nutrientes, tales como: extractos de levaduras,
extracto de carne o plantas, digestos de proteínas o de otras fuentes.
4. FINALIDAD BACTERIOLÓGICA:
a) Comunes o Basales: son aquellos que tienden a satisfacer el
desarrollo de la bacteria; pero sin satisfacer ninguna condición especial
de ésta. Ejemplo: Agar Nutritivo (AN), Müeller-Hinton (MH), Caldo Soya
Tripticasa (CST), Caldo MH, etc.
b) Enriquecidos: son los medios preparados para satisfacer los
requerimientos nutricionales de las bacterias más exigentes para crecer,
por medio de la adición de sustancias, tales como: sangre, suero, leche,
líquido ascítico, huevos, vitaminas, etc. Ejemplo: Agar Sangre Humana
(ASH), Gelosa Chocolate (GC), Müeller Hinton Sangre (MHS), Müeller
Hinton Chocolate (MHCH), Agar Sangre Anaerobiosis (ASA), Caldo
Thiglicolato (CT), etc.
c) Selectivos: aquellos que tienen por objeto permitir un crecimiento
más rápido de las bacterias que se desean aislar de una mezcla. Estos
medios contienen sustancias químicas específicas (colorantes, sales
biliares, antibióticos) que actúan como inhibidores de un grupo de
bacterias; pero no afectan el crecimiento del microorganismo que
interesa. Por ejemplo, el cristal violeta, en concentraciones específicas,
previene el crecimiento de las bacterias Gram positivas, sin afectar el
desarrollo de las Gram negativas.
Son medios que generalmente no se autoclavan; ya que son tan
selectivos que difícilmente se contaminan. Ejemplos: Tiosulfato Citrato
Bilis Sucrosa (TCBS) y Bismuto Sulfito Agar (BSA) son medios
altamente selectivos, también denominados de Único Propósito; Xilosa
Lisina Desoxicolato (XLD) es un medio moderadamente selectivo;
Salmonella Shigella Agar (SSA), también es un medio selectivo.
d) Diferenciales: son medios que contienen ciertos reactivos o
sustancias químicas (azúcares, colorantes, indicadores de pH, etc.) que
traen como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano, o de
cambios después de la inoculación e incubación del medio, lo que
permite al observador, diferenciar entre distintos tipos de bacterias. Por
ejemplo: el Mac Conkey (MC) permite diferenciar a los bacilos Gram
negativos en Fermentadores o no de la Lactosa. Otros medios
diferenciales, incluyen: Eosina Azul de Metileno (EMB), Triple Azúcar
Hierro (TSI), Lisina Hierro Agar (LIA), etc.
e) Indicadores son aquellos medios de cultivo que contienen sustancias
que cambian visiblemente como resultado de la actividad metabólica de
los microorganismos. Ejemplo: Caldo para fermentación de
Carbohidratos, Indol, Citrato, Malonato, etc.
f) De Enriquecimiento: como su nombre lo indica, un medio de
enriquecimiento se usa para incrementar el crecimiento de ciertas
especies bacterianas e inhibir el desarrollo de microorganismos no
deseados. En laboratorios, los medios de enriquecimiento se utilizan
con mayor frecuencia para la recuperación de especies de Salmonella y
Shigella de muestras fecales. Estos medios se basan en el principio de
que los microorganismos que forman parte de la flora fecal normal son
mantenidos en fase de latencia prolongada por las sustancias químicas
inhibidoras presentes en el caldo. Las especies de interés, son mucho
menos inhibidas, entran en una fase de crecimiento exponencial y se
 recuperan con mayor facilidad de muestras fecales. Sin embargo,
después de varias horas, los medios de enriquecimiento ya no suprimen
el crecimiento de los organismos entéricos normales y, finalmente,
llenan el cultivo. Por lo que se recomienda que estos caldos sean sub-
cultivados como máximo a las ocho horas. Ejemplos: Caldo Selenito F,
Agua Peptonada Alcalina, Campythio, etc.
g) De Transporte: en esencia, estos medios son una solución buffer, sin
carbohidratos, peptonas y otros nutrientes y factores de crecimiento,
diseñados para conservar la viabilidad de las bacterias durante el
transporte sin una multiplicación significativa de los microorganismos.
Ejemplos: Cary & Blair, Amies & Stuart.

5. Explique cómo pueden incorporarse los nutrientes

(macronutrientes, micronutrientes y factores de crecimiento) en los
medios de cultivo. Cite ejemplos

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de

contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas.
En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias
inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias
adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las
reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de

infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo,
la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo
provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los

medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente
asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos,
que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de
atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno
presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade

a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc.
Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales
como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias
promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como

indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
6. Indique las condiciones de conservación de los medios de cultivo
deshidratados.

Los medios de cultivo deshidratados deben conservarse al abrigo de la

humedad, de la luz y calor que esencialmente son los .agentes de
alteracion mas frecuentes. se suministran en botes de plastico opacos e
impermeables, con un unico tapon roscado sin obturador de, cierre
herrrietico gracias a una pestaña interna. No obstante el cierre estanco
solo se asegura si se rosca a tope y tanto el borde de la boca como las
ranuras del tapon se mantienen limpias de material. Es recomendable
que el frasco se abra en ambientes secos e inmediatamente despues
de su uso s e vueIva a cerrar. No precisan retrigeracion aunque las
bajas temperaturas prolongan su efectividad. Dada la naturaleza de su
envase, los medios de cultivo pueden mantenerse por largos periodos
de tiempo en un lugar fresco y seco. Si los medios se humedecen
quedan apelmazados y duros, perdiendo sus propiedades, e incluso
permitiendo el crecimiento directo de microorganismos en ellos. En
estas condiciones no deben usarse. Sin embargo, y a pesar de que por
10 general su aspecto es seco y pulverulento en algunos casos (MRS,
Bismuto y sulfite, etc.) se pueden presentar como humedecidos y
untosos pero sin apelmazamiento, siendo este su aspecto normal y sin
que ello signifique ninguna alteracion. De cualquier modo, la
conservacion de los medios deshidratados no es indefinida y por ello no
es recomendable el almacenamiento en grandes cantidades, sino que
se aconseja un pequeno "stock" para que de esta forma se pueda
mantener siempre una rotacion de, medios recien fabricados. Es
recomendable fechar los botes de medio cuando se reciben para evitar
que se acumulen los mas antiguos.

7. Indique las posibles fuentes de error en la preparación de los

medios de cultivo.

 Medio Inadecuado: dado que los medios suelen estar dispuestos

por orden alfabético en un estante, es posible seleccionar
inadvertidamente, un frasco equivocado o un suplemento
inadecuado, con lo cual el medio resulta no apto para su uso. Es
siempre importante leer el rótulo, particularmente cuando se
recibe en el laboratorio una nueva partida de medios.
 Agua: se debe medir cuidadosamente la cantidad de agua que se
añade al reconstituir el medio. Dado que las impurezas hacen
que el agua corriente sea inapropiada para la mayoría de los
medios biológicos, los laboratorios deben usar agua destilada,
desionizada o que haya recibido ambos tratamientos.
 Pesaje: emplear balanzas adecuadas para pesar los materiales
secos. Los errores de pesaje alteran significativamente la
composición del pH final.
 Distribución de los Medios: los medios deben repartirse exacta y
asépticamente en placas y tubos. La medición errónea de la
cantidad exacta puede ocasionar, por ejemplo, un medio de agar
con espesor demasiado fino o grueso, siendo ambos
inadecuados para su empleo.
 Esterilización: un error común en la preparación de los medios de
cultivo es el de esterilizarlos a una temperatura demasiado
elevada y/o durante un período demasiado largo. Esto puede
producir el deterioro o descomposición de algunos componentes
de los medios que inutiliza a éstos para los fines intentados.
 Material de Vidrio: se debe tener la precaución de utilizar material
de vidrio limpio; ya que los residuos adheridos al vidrio pueden
inhibir, particularmente, algunos microorganismos exigentes.