Facultad de Medicina División de Postgrado Maestría en Diagnóstico Bacteriológico Bacteriología I
Instructivo de la Unidad III
Medios de Cultivo
1. Defina medio de cultivo.
Un material nutriente preparado en el laboratorio para soportar el
crecimiento de un microorganismo se denomina Medio de Cultivo. Estos, son sustancias de origen natural o artificial, sólidos o líquidos que le proporcionan a los microorganismos las sustancias nutritivas necesarias para su desarrollo.
2. Evolución histórica de los medios de cultivo
La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del
micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.
Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento
rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas.
En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la
microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.
En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas
de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.
3. Condiciones generales para el cultivo de microorganismos
Contener los nutrientes esenciales en la proporción adecuada
para soportar el crecimiento de los microorganismos: Fuente de Energía, de Carbono, de Nitrógeno, Oligoelementos, Factores de Crecimiento y Agua. Poseer aceptable cantidad de sal (generalmente, Cloruro de Sodio (NaCl), para estabilizar el medio). Tener humedad suficiente para permitir la proliferación de las formas vegetativas de los microorganismos. Estar libre de sustancias inhibidoras para el microorganismo a cultivar. Poseer un pH propiamente ajustado para el metabolismo del microorganismo. La mayoría de las bacterias crecen bien a pH neutro o cercano a la neutralidad (6.8 – 7.1); pero los hongos crecen a pH más ácidos. El medio, originalmente, debe ser estéril - libre de toda forma de vida – a fin de garantizar que sólo los microorganismos inoculados estén presentes en el medio. Poseer una consistencia adecuada (sólido, semisólido o líquido). Finalmente, debe ser incubado en condiciones apropiadas: temperatura, atmósfera y tiempo.
a) Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un cultivo adecuado
para la investigación microbiológica ha de contener como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fosforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas, por lo que se añade a muchos medios sustancias como sueros, sangre, etc. Muy a menudo se añaden ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o por sus capacidades de ejercer como inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. b) Consistencia adecuada del medio: partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. c) Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmosfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. Los organismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias, mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. d) Condiciones adecuadas de humedad: un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmosfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37°C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio. e) Luz ambiental: la mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de la luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. f) pH: la mayoría de los microorganismos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. La presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano, pueden sin embargo, inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. g) Temperatura: los microorganismos mesófilos crecen de forma óptica a temperaturas entre 15 y 43°C. Otros como los psicrófilos crecen a 0°C y los termófilos a 80°C o incluso temperaturas superiores (hipertermófilos).
h) Esterilidad del medio: todos los medios de cultivo deben estar
perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento bacteriano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. 4. Clasificación de los medios de cultivo (cite ejemplos) Los medios de cultivo pueden clasificarse atendiendo a diferentes criterios: 1.- ESTADO FÍSICO: Líquidos Semisólidos Sólidos Cuando se desea obtener un medio sólido o semisólido se añade un agente solidificante, como el Agar. Este es un polisacárido natural, complejo, de elevado peso molecular, derivado de un alga marina que ha sido ampliamente utilizado para espesar alimentos (jaleas, sopas y helados). Este polisacárido de galactosa, posee propiedades particularmente importantes que son idóneas para su uso en Microbiología. Un medio líquido se denomina caldo. Ejemplo: Caldo Soya Tripticasa (CST), Caldo Thioglicolato (CT), Aminoácidos, Carbohidratos, etc. Como se mencionó anteriormente, los medios semisólidos contienen agar (<0.5%) y se utilizan para estudiar la motilidad de las bacterias o en pruebas de fermentación-oxidación de carbohidratos. Los medios sólidos, también contienen agar; pero en mayor concentración (1-2%). Ejemplo: Triple Azúcar Hierro (TSI), Agar Sangre Humana (ASH), Mac Conkey (MC), Lisina Hierro Agar (LIA), etc. 2. PROCEDENCIA: Naturales Artificiales Los naturales, como su nombre lo indica, contienen sustancias de origen natural, bien sea: vegetal (Agar o Caldo con jugo de tomate para Lactobacillus) o de origen animal (Suero sanguíneo, sangre, leche). Ejemplo: Amarillo de Huevo Agar, Löeffler, Lowestein-Jensen. Los artificiales son aquellos cuya composición química se conoce exactamente. Son denominados también Sintéticos o químicamente definidos. Son los más utilizados actualmente. 3. COMPLEJIDAD DE FÓRMULA: Simples Complejos Los simples son aquellos que contienen únicamente una fuente de energía y Carbono (Glucosa – Ácido Láctico), una fuente inorgánica de Nitrógeno y sales inorgánicas. Los Complejos, incorporan además de los constituyentes anteriores, aminoácidos. La mayoría de los microorganismos heterótrofos (bacterias y hongos) son cultivados de rutina, en medios complejos. Estos se preparan con nutrientes, tales como: extractos de levaduras, extracto de carne o plantas, digestos de proteínas o de otras fuentes. 4. FINALIDAD BACTERIOLÓGICA: a) Comunes o Basales: son aquellos que tienden a satisfacer el desarrollo de la bacteria; pero sin satisfacer ninguna condición especial de ésta. Ejemplo: Agar Nutritivo (AN), Müeller-Hinton (MH), Caldo Soya Tripticasa (CST), Caldo MH, etc. b) Enriquecidos: son los medios preparados para satisfacer los requerimientos nutricionales de las bacterias más exigentes para crecer, por medio de la adición de sustancias, tales como: sangre, suero, leche, líquido ascítico, huevos, vitaminas, etc. Ejemplo: Agar Sangre Humana (ASH), Gelosa Chocolate (GC), Müeller Hinton Sangre (MHS), Müeller Hinton Chocolate (MHCH), Agar Sangre Anaerobiosis (ASA), Caldo Thiglicolato (CT), etc. c) Selectivos: aquellos que tienen por objeto permitir un crecimiento más rápido de las bacterias que se desean aislar de una mezcla. Estos medios contienen sustancias químicas específicas (colorantes, sales biliares, antibióticos) que actúan como inhibidores de un grupo de bacterias; pero no afectan el crecimiento del microorganismo que interesa. Por ejemplo, el cristal violeta, en concentraciones específicas, previene el crecimiento de las bacterias Gram positivas, sin afectar el desarrollo de las Gram negativas. Son medios que generalmente no se autoclavan; ya que son tan selectivos que difícilmente se contaminan. Ejemplos: Tiosulfato Citrato Bilis Sucrosa (TCBS) y Bismuto Sulfito Agar (BSA) son medios altamente selectivos, también denominados de Único Propósito; Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) es un medio moderadamente selectivo; Salmonella Shigella Agar (SSA), también es un medio selectivo. d) Diferenciales: son medios que contienen ciertos reactivos o sustancias químicas (azúcares, colorantes, indicadores de pH, etc.) que traen como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano, o de cambios después de la inoculación e incubación del medio, lo que permite al observador, diferenciar entre distintos tipos de bacterias. Por ejemplo: el Mac Conkey (MC) permite diferenciar a los bacilos Gram negativos en Fermentadores o no de la Lactosa. Otros medios diferenciales, incluyen: Eosina Azul de Metileno (EMB), Triple Azúcar Hierro (TSI), Lisina Hierro Agar (LIA), etc. e) Indicadores son aquellos medios de cultivo que contienen sustancias que cambian visiblemente como resultado de la actividad metabólica de los microorganismos. Ejemplo: Caldo para fermentación de Carbohidratos, Indol, Citrato, Malonato, etc. f) De Enriquecimiento: como su nombre lo indica, un medio de enriquecimiento se usa para incrementar el crecimiento de ciertas especies bacterianas e inhibir el desarrollo de microorganismos no deseados. En laboratorios, los medios de enriquecimiento se utilizan con mayor frecuencia para la recuperación de especies de Salmonella y Shigella de muestras fecales. Estos medios se basan en el principio de que los microorganismos que forman parte de la flora fecal normal son mantenidos en fase de latencia prolongada por las sustancias químicas inhibidoras presentes en el caldo. Las especies de interés, son mucho menos inhibidas, entran en una fase de crecimiento exponencial y se recuperan con mayor facilidad de muestras fecales. Sin embargo, después de varias horas, los medios de enriquecimiento ya no suprimen el crecimiento de los organismos entéricos normales y, finalmente, llenan el cultivo. Por lo que se recomienda que estos caldos sean sub- cultivados como máximo a las ocho horas. Ejemplos: Caldo Selenito F, Agua Peptonada Alcalina, Campythio, etc. g) De Transporte: en esencia, estos medios son una solución buffer, sin carbohidratos, peptonas y otros nutrientes y factores de crecimiento, diseñados para conservar la viabilidad de las bacterias durante el transporte sin una multiplicación significativa de los microorganismos. Ejemplos: Cary & Blair, Amies & Stuart.
5. Explique cómo pueden incorporarse los nutrientes
(macronutrientes, micronutrientes y factores de crecimiento) en los medios de cultivo. Cite ejemplos
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de
contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de
infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los
medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade
a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 6. Indique las condiciones de conservación de los medios de cultivo deshidratados.
Los medios de cultivo deshidratados deben conservarse al abrigo de la
humedad, de la luz y calor que esencialmente son los .agentes de alteracion mas frecuentes. se suministran en botes de plastico opacos e impermeables, con un unico tapon roscado sin obturador de, cierre herrrietico gracias a una pestaña interna. No obstante el cierre estanco solo se asegura si se rosca a tope y tanto el borde de la boca como las ranuras del tapon se mantienen limpias de material. Es recomendable que el frasco se abra en ambientes secos e inmediatamente despues de su uso s e vueIva a cerrar. No precisan retrigeracion aunque las bajas temperaturas prolongan su efectividad. Dada la naturaleza de su envase, los medios de cultivo pueden mantenerse por largos periodos de tiempo en un lugar fresco y seco. Si los medios se humedecen quedan apelmazados y duros, perdiendo sus propiedades, e incluso permitiendo el crecimiento directo de microorganismos en ellos. En estas condiciones no deben usarse. Sin embargo, y a pesar de que por 10 general su aspecto es seco y pulverulento en algunos casos (MRS, Bismuto y sulfite, etc.) se pueden presentar como humedecidos y untosos pero sin apelmazamiento, siendo este su aspecto normal y sin que ello signifique ninguna alteracion. De cualquier modo, la conservacion de los medios deshidratados no es indefinida y por ello no es recomendable el almacenamiento en grandes cantidades, sino que se aconseja un pequeno "stock" para que de esta forma se pueda mantener siempre una rotacion de, medios recien fabricados. Es recomendable fechar los botes de medio cuando se reciben para evitar que se acumulen los mas antiguos.
7. Indique las posibles fuentes de error en la preparación de los
medios de cultivo.
Medio Inadecuado: dado que los medios suelen estar dispuestos
por orden alfabético en un estante, es posible seleccionar inadvertidamente, un frasco equivocado o un suplemento inadecuado, con lo cual el medio resulta no apto para su uso. Es siempre importante leer el rótulo, particularmente cuando se recibe en el laboratorio una nueva partida de medios. Agua: se debe medir cuidadosamente la cantidad de agua que se añade al reconstituir el medio. Dado que las impurezas hacen que el agua corriente sea inapropiada para la mayoría de los medios biológicos, los laboratorios deben usar agua destilada, desionizada o que haya recibido ambos tratamientos. Pesaje: emplear balanzas adecuadas para pesar los materiales secos. Los errores de pesaje alteran significativamente la composición del pH final. Distribución de los Medios: los medios deben repartirse exacta y asépticamente en placas y tubos. La medición errónea de la cantidad exacta puede ocasionar, por ejemplo, un medio de agar con espesor demasiado fino o grueso, siendo ambos inadecuados para su empleo. Esterilización: un error común en la preparación de los medios de cultivo es el de esterilizarlos a una temperatura demasiado elevada y/o durante un período demasiado largo. Esto puede producir el deterioro o descomposición de algunos componentes de los medios que inutiliza a éstos para los fines intentados. Material de Vidrio: se debe tener la precaución de utilizar material de vidrio limpio; ya que los residuos adheridos al vidrio pueden inhibir, particularmente, algunos microorganismos exigentes.