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Manual de prácticas del laboratorio de

MICROBIOLOGÍA GENERAL

Autores:

Diana Marı́a Echeverry Arango


Olga Inés Montoya Campuzano

Universidad Nacional de Colombia


Biologı́a y Zooctenia
Medellı́n, Colombia
2013
Índice general

LISTA DE FIGURAS III

LISTA DE TABLAS IV

4. COLORACIÓN DE GRAM 1
4.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
4.2. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
4.3. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
4.4. Procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
4.5. Cuestionario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

BIBLIOGRAFÍA 6
LISTA DE FIGURAS

4-1. Coloración de Gram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3


LISTA DE TABLAS

4-1. REPORTE DE PRÁCTICA No 3. Coloración de gram . . . . . . . . . . . . 5


4 COLORACIÓN DE GRAM

4.1. Introducción

La coloración de Gram, es una técnica diferencial que utiliza dos colorantes básicos un mor-
diente y un decolorante, propuesta por el medico Danés Christian Gram en 1884; es la más
importante y utilizada en microbiologı́a. Se caracteriza por no teñir de forma homogénea a
todas las especies bacterianas; clasificando las bacterias en dos grandes grupos Gram positi-
vas y Gram negativas, según retengan o no el colorante primario usado en la tinción.

Permitiendo agrupar las bacterias en Gram Negativas y Gram Positivas, se diferencian entre
sı́ por la composición quı́mica de la pared celular y su permeabilidad. La pared de las Gram
negativas es más delgada y presenta un contenido lipı́dico diez veces mayor que el de las
Gram positivas, lo cual dificulta la tinción y la retención del colorante en el citoplasma.

Algunas bacterias se clasifican como Gram variables, porque simultáneamente presenta co-
loración Gram positiva y Gram negativa, aún bajo condiciones óptimas de cultivo. Sin em-
bargo, su estructura posee una pared Gram positiva, aunque la capa de peptidoglicano es
más delgada que la mayorı́a de las bacterias Gram positivas.

El cristal violeta y la safranina, actúan como colorante primario y secundario respectivamen-


te y requieren de un mordiente llamado Lugol, que fija el cristal violeta a la pared celular
para evitar ser decolorado con el alcohol acetona; donde ambos grupos bacterianos se obser-
van de un azul más fuerte. El Alcohol Acetona, actúa como decolorante al eliminar la capa
externa lipı́dica de la pared celular de las Gram Negativas y como esta presenta solo una
monocapa de Peptidoglicano, se generan grandes poros por donde se elimina el cristal viole-
ta; en cambio las Gram Positivas, no se ven afectadas por la acción del decolorante, debido
a que no presentan la capa externa lipı́dica, pero si varias capas de Peptidoglicano, el cual
se deshidrata formando poros pequeños evitando la salida del colorante. En consecuencia
las Gram Negativas se decoloran y las Gram Positivas retienen el colorante. La safranina,
colorante secundario tendrá la función de hacer el contraste al teñir las bacterias Gram Ne-
gativas decoloradas en el paso anterior.
2 4 COLORACIÓN DE GRAM

4.2. Objetivos
Clasificar Algunas especies bacterianas, en Gram positivas o en Gram negativas.

Diferenciar las bacterias Gram positivas, de las Gram negativas.

Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.

4.3. Materiales
Cultivos de bacterias Gram positivas y Gram negativas de 24 horas de inóculados

Mecheros de alcohol y asa de aro

Portaobjetos y Aceite de inmersión

Puente de coloración

Colorantes: Cristal violeta y Safranina

Reactivos: Lugol y Alcohol acetona

4.4. Procedimiento
Hacer un frotis de las colonias bacterianas a estudiar

Fijar el frotis por calor deslizando el portaobjetos sobre la llama del mechero

Cubrir el frotis con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto

Quitar el exceso de colorante con agua, con ayuda del frasco lavador

Cubrir el frotis con lugol y dejarlo actuar por un minuto

Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante

Cubrir el frotis con alcohol-acetona, durante 20 segundos

Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante

Cubrir el frotis con safranina y dejarlo actuar por un minuto

Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante (Figura 4-1)

Dejar secar al aire

Observar la muestra con los objetivos de 40X y 100X


4.4 Procedimiento 3

Figura 4-1: Coloración de Gram


4 4 COLORACIÓN DE GRAM

4.5. Cuestionario
1. ¿Qué importancia tiene la coloración de Gram, en la identificación bacteriana?

2. Explica las causas que alteran los resultados en la coloración de Gram.

3. Describa las caracterı́sticas morfológicas presentes en una bacteria Gram negativa y


Gram positiva y esquematice.

4. Mencione otra técnica de coloración diferencial y explique su fundamento.


4.5 Cuestionario 5

Tabla 4-1: REPORTE DE PRÁCTICA No 3. Coloración de gram

COLORACIÓN DE GRAM
N ◦ del medio de cultivo
Reacción Gram...

Observar su forma y su agrupación.


Comentar e indicar en el esquema.
N ◦ del medio de cultivo
Reacción Gram...

Observar su forma y su agrupación.


Comentar e indicar en el esquema.
N ◦ del medio de cultivo
Reacción Gram...

Observar su forma y su agrupación.


Comentar e indicar en el esquema.
BIBLIOGRAFIA
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Antioquia, 1990.

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de Colombia, Sede Palmira, 1996.

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BRADSHAW I, Jack. Microbiologı́a de laboratorio. El Manual Moderno. México,


1976.

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CEPERO DE GARCIA, Marı́s Caridad...[et ál.]. Biologia de hongos. 1era ed. Co-
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MONTOYA, C Olga Inés. Manual de microbiologı́a.Universidad Nacional de Co-


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vier. Edic.4ta.Madrid.1996.pag.262