ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS: USO EN LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y

APLICADA

15.1 Introducción

Un tema favorito de los escritores de ficción científica es el de un científico malvado o

equivocado que trabaja en un laboratorio secreto en una isla remota cuyos monstruos
genéticamente alterados escapan y causan estragos. Un ejemplo clásico es la gente de la bestia
en la novela de H.G. Wells 1896 La Isla del Doctor Moreau. Otra joya es una película de 1959
llamada Los Asesinos Shrews - gigante, comiendo carne, y ¡venenoso! Compartir los genes entre
las especies y la manipulación genética de organismos una vez parecía nociones escandalosas.
La creación de clones a partir del ADN nuclear de otro individuo también tiene el anillo de la
ficción científica, sobre todo si tiene lugar en un laboratorio de la selva como en la película de
1978 Los chicos de Brasil. De hecho, los organismos transgénicos han sido una realidad desde
1980, las estrategias para transformar el genoma de un organismo a nivel de los cambios
específicos de nucleótidos mediante la orientación de genes se desarrollaron a finales de los
años ochenta y ahora es posible producir clones mediante transferencia nuclear.

Un organismo transgénico es aquel que lleva material genético transferido (es decir, el transgén)
que ha sido insertado en su genoma en un sitio aleatorio. El objetivo del gen - la sustitución o
mutación de un gen particular - proporciona los medios para crear cepas de organismos
"knockout" con mutaciones en prácticamente cualquier gen. El clonaje es la producción de
animales genéticamente idénticos mediante transferencia nuclear desde células somáticas
adultas (cuerpo) a óvulos no fertilizados . La Tabla 15.1 compara y contrasta estos tres métodos
distintos para la manipulación genética de organismos.

En este capítulo se describen varios métodos de manipulación genética en el ratón que han
llevado a avances clave en muchos campos, incluyendo el estudio de la neurobiología, la
enfermedad genética humana, la inmunología, el cáncer y el desarrollo. La capacidad de
introducir genes extraños o alterados en el ratón proporciona un recurso incomparable para el
estudio de la regulación de genes. A diferencia de las investigaciones similares realizadas

In vitro o en células cultivadas, el transgén puede ser estudiado en el contexto de todo el

organismo. Las estrategias transgénicas y de orientación génica pueden utilizarse para
sobreexpresar, modificar o inactivar genes en el ratón. Dicha manipulación genética puede
dirigirse a todos los tejidos del cuerpo, a tipos celulares específicos de etapas específicas en el
desarrollo. Esto permite el estudio de la expresión génica específica del tejido y del desarrollo,
y el análisis de la pérdida y la ganancia de los efectos de los genes.

Aunque el foco de este capítulo está en la investigación básica usando el ratón como organismo
modelo, también se abordan otras aplicaciones de la tecnología transgénica. Esta tecnología
puede usarse potencialmente para incrementar el rendimiento de animales y plantas
comercialmente importantes añadiendo nuevos rasgos o mejorando los existentes. Otra
aplicación potencial importante de la tecnología transgénica es la sobreexpresión de proteínas
extrañas para uso terapéutico.

Por último, la clonación mediante transferencia nuclear se describe en el contexto de su

potencial para proporcionar información sobre los mecanismos de desarrollo, diferenciación
celular, reprogramación nuclear, impronta genómica y envejecimiento. Existen muchas
limitaciones prácticas con la actual metodología de clonación. Sin embargo, se discute el valor
potencial para la preservación de las poblaciones de animales premiados, conservación de la
fauna y usos terapéuticos.

15.2 Ratones transgénicos

En 1980 el primer ratón transgénico se produjo por microinyección de ADN extraño en huevos
fertilizados. La construcción del ADN viral de Arecombinant se integró con éxito en el genoma
del ratón, pero se reorganizó y no se expresó. El primer cambio fenotípico visible en ratones
transgénicos se describió en 1982 por Richard Palmiter y Ralph Brinster. Diseñaron ratones que
integraron con éxito y expresaron la secuencia de codificación del gen de la hormona del
crecimiento. El resultado inesperado y dramático fue que algunos ratones crecieron para ser dos
veces el tamaño de los hermanos normales. Las imágenes de estos "super" ratones capturaron
la atención tanto del público general como de los científicos por igual (Fig. 15.1). Desde
entonces, los transgénicos han sido un campo en rápido crecimiento, con muchos avances y
perfeccionamientos tecnológicos (cuadro 15.1)

Cómo hacer un ratón transgénico

El procedimiento estándar para la fabricación de ratones transgénicos por microinyección de

ADN extraño en huevos fertilizados se muestra en la Fig. 15.2. La microinyección resulta en la
introducción del transgén en los cromosomas del huevo de ratón afertilizado. Si el transgén está
integrado en uno de los cromosomas embrionarios, el ratón nacerá con una copia de esta nueva
información en cada célula. Hay tres etapas principales en el proceso: (i) microinyección de ADN
en el pronúcleo de un óvulo de ratón fertilizado; (Ii) implantación del embrión microinjectado
en una madre de crianza temporal; Y (iii) análisis de cachorros de ratón y generaciones
posteriores para la integración y expresión del transgén.

Microinyección pronuclear

El primer paso en la fabricación de un ratón transgénico es retirar quirúrgicamente los huevos

de un ratón de hembra y fertilizarlos con la esperanza de ratón. El segundo paso es la
microinyección del ADN extraño en el óvulo fecundado. El ratón Atransgenic se diseña
generalmente para overexpress un gene de interés. Representa un modelo de ratón de
"ganancia de función". La construcción transgénica contiene como mínimo un elemento
promotor, ADN complementario (ADNc) para el gen de interés y un signo de poliadenilación. La
secuencia promotora requiere el sitio de unión para la ARN polimerasa y los factores de
transcripción (véase la Sección 11.3). Mediante la elección de un promotor espectacular del
tejido inducible, la expresión del gen extra ~ no puede regularse espacialmente y
temporalmente. Por ejemplo, en el caso de los ratones "super" anterior anteriormente, se
inyectaron los huevos fertilizó con un geneconstruct (vector plasmıdico recombinante) Que
contenía el cDNA de la hormona del crecimiento de rata bajo el control del promotor de la gen
de metalotioneína (MT). El promotor de metalotioneína fue elegido porque es inducible
(activado) por los metales pesados cinc y cadmio. El gen de metalotionina codifica una proteína
de unión de metal pesado que es activa en el hígado. Más recientemente, las estrategias
desarrolladas para la expresión inducible se describen al final de esta sección.

El momento de la microinyección es crítico. El ADN extraño debe integrarse en el genoma del

ratón antes de duplicar el material genético que se produce antes de la primera escisión. Si el
ADN extraño se integra en el genoma del ratón después de la primera escisión, se puede
producir un ratón en mosaico en el que muchas células no poseen el nuevo gen. Por esta razón,
el transgén se introduce en el óvulo fecundado en la etapa más temprana posible; Es decir, el
período pronuclear inmediatamente después de la fecundación. Durante varias horas después
de la entrada del esperma en el óvulo, el núcleo del espermatozoide y el núcleo del huevo -
llamado el pronúcleo masculino y femenino - son microscópicamente visibles como estructuras
individuales. Las inyecciones deben realizarse antes de que los espermóides haploides y los
pronúcleos del huevo se hayan fusionado para formar un núcleo zigótico diploide. Varias copias
del transgén en solución se cargan en una microaguja de vidrio y el ADN se inyecta directamente
en uno de los pronúcleos (figura 15.2). Por lo general, el pronúcleo masculino es microinyectado
ya que es más grande en tamaño y más cerca de la superficie del huevo. El huevo en sí es de sólo
50μm de diámetro, por lo que este procedimiento requiere gran habilidad y paciencia. Las
inyecciones son muy tediosas e incluso el técnico experimentado sólo puede ser capaz de
completar 5-10 inyecciones exitosas en un día.

Implantación en madre adoptiva

Para poder convertirse en ratones transgénicos nacidos vivos, los embriones manipulados
deben ser transferidos al tracto productivo de un ratón hembra (Fig. 15.2). Los receptores de
ratón femenino para la transferencia de embriones se preparan por apareamiento con machos
vasectomizados. En cualquier lugar de dos a 15 embriones inyectados con éxito se trasladan
quirúrgicamente al útero del receptor "pseudopregnant" ratón. El embarazo es visible
aproximadamente 2 semanas después de la transferencia del embrión y la basura se entrega
aproximadamente una semana después. Las crías de ratón se destetan y se analizan a las 3-4
semanas de edad.

Implantación en madre adoptiva

Para poder convertirse en ratones transgénicos nacidos vivos, los embriones manipulados
deben ser transferidos al tracto reproductivo de un ratón femenino (Fig. 15.2). Los receptores
de ratón femenino para la transferencia de embriones se preparan acoplándose con machos
vasectomizados. En cualquier lugar de dos a 15 embriones inyectados con éxito se trasladan
quirúrgicamente al útero del receptor "pseudopregnant" ratón. El embarazo es visible
aproximadamente 2 semanas después de la transferencia del embrión y la basura se entrega
aproximadamente una semana después. Las crías de ratón son destetadas y analizadas a las 3-4
semanas de edad.

Análisis de ratones cachorros

Hay dos preguntas importantes que deben ser contestadas una vez que los cachorros de ratón
están listos para el análisis. En primer lugar, ¿existe una integración estable del transgén en el
cromosoma del ratón? En otras palabras, ¿son los ratones, de hecho, transgénicos? En segundo
lugar, si se muestra que el transgén está presente en el genoma del ratón, ¿se expresa
apropiadamente? En este contexto, "apropiado" significa si el gen se expresa en el momento
correcto durante el desarrollo, en el (los) tejido (s) correcto (s) y en la cantidad correcta.

Análisis de la integración estable: Las biopsias de la cola se toman de perritos del ratón para
obtener el ADN para el análisis. El ADN se somete a ensayo para determinar la presencia del
transgén mediante hibridación Southern blot o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (figura
15.2). Un ratón en el que se logró la integración del ADN transgénico se conoce como el fundador
(F0) de un nuevo linaje transgénico. El transgén será heredable y transmitido de generación en
generación como parte del genoma del ratón. La tasa de éxito de la integración estable es de
alrededor del 2,5-6% en ratones.
El acontecimiento de la integración ocurre generalmente por la recombinación
nonomomologous, que da lugar a un sitio al azar de la integración de DNA extranjero en el
genoma embrionario. El mecanismo no está claro, pero la recombinación no homóloga puede
ser provocada por la acción de las enzimas de reparación del ADN (ver Fig. 7.15). Se cree que
estas enzimas son inducidas por extremos libres de ADN exógeno (el transgén) y crean roturas
de doble cadena en el ADN cromosómico. La probabilidad de eventos de integración idénticos
en dos embriones que reciben el mismo transgén es altamente improbable. Además, es
imposible regular exactamente cuántas copias del transgén se introducirán en el embrión y
cuántas se unirán para integrarse (normalmente en un solo sitio) como una única matriz lineal,
llamada concatámero (de una a una 150 copias). El número de copias del transgén que se
integran en el genoma del fundador se conoce como el número de copias. El número de copias
rara vez parece estar correlacionado con el grado de expresión transgénica en el ratón.

La primera generación de ratones transgénicos se denomina "mosaico" o "quimérico". En

general, tienen ADN extraño en algunas, pero no en todas, células germinales y células
somáticas. Los ratones fundadores transgénicos son endogámicos para producir una segunda
generación, llamada la generación F1. Esta generación de ratones también se analiza para la
integración estable del transgén. Si las células germinales del fundador (mosaico o no)
transmiten el transgén de forma estable, entonces todos los descendientes de este ratón son
miembros de este único linaje transgénico. El genotipo del fundador se describe como
hemizígeno para el transgén en lugar de heterocigotos, ya que el nuevo locus transgénico está
presente en sólo un miembro de un par de cromosomas en particular. Un genotipo
homocigótico, en el que los alelos transgénicos están presentes en cada cromosoma en un par,
puede ser producido por el apareamiento de hemiciclos F1 (ver Fig. 15.2). Dado que el sitio de
integración puede ser diferente, los ratones de acoplamiento con transgenes idénticos pero de
diferentes linajes fundadores no darán como resultado un homocigoto verdadero en el que la
segregación independiente de los loci es predecible.

Análisis de la expresión de transgenes: Si se demuestra que el transgén está presente en el

genoma del ratón, la siguiente pregunta es si el transgén está regulado suficientemente bien
para funcionar en su nuevo entorno. Para responder a esta pregunta, se analizan los niveles de
expresión de ARN y proteína. Se puede utilizar una variedad de técnicas para evaluar la actividad
transcripcional del transgén, incluyendo Northern blots, transcripción reversa-PCR (RT-PCR) y
hibridación in situ. Para el análisis de la expresión del transgén al nivel de la traducción, se usan
frecuentemente transferencias de Western e inmunohistoquímica (ver Figuras 9.8 y 9.9).

Muchos estudios han encontrado diferencias dramáticas en la expresión de un transgén

específico dentro de los embriones individuales simplemente debido a diferentes sitios de
integración aleatoria. Como se ha indicado anteriormente, los primeros ratones para expresar
un transgén (el gen de la hormona de crecimiento de rata) eran más del doble del tamaño de
hermanos normales no tratados. Además, las hembras tenían una disminución de la fertilidad y
tanto los hombres como las mujeres murieron prematuramente. La conclusión de los
investigadores fue que había una cantidad no regulada, excesiva de hormona de crecimiento
producida por el cDNA introducido bajo el control del promotor del gen de metalotioneína
inducible. Es más probable que se necesitaran regiones reguladoras específicas de genes
adicionales para lograr una expresión adecuadamente regulada (véase la sección 11.3 y la casilla
de enfoque 11.1).

Además de los problemas con la expresión del propio transgén, frecuentemente el transgén se
inserta aleatoriamente en un gen de ratón endógeno e interfiere con su expresión. Dichas
mutaciones pueden ser intrascendentes o letales, pero también pueden resultar en un ratón
viable con un fenotipo mutante distinto. La identificación del sitio de inserción de transgenes es
de gran valor en tales casos de mutagénesis de inserción porque mapea la localización de un gen
endógeno importante. Estas mutaciones se pueden distinguir del fenotipo transgénico
verdadero porque solamente un solo linaje exhibe el defecto.

15.3 Modelos de ratón orientados por genes

La predicción de la secuencia de aminoácidos para una proteína producida por un gen clonado
y el modelado subsiguiente de la proteína pueden a menudo proporcionar información sobre la
función, especialmente si la proteína de interés comparte la homología de la secuencia con una
proteína bien caracterizada. Pero para una proteína desconocida, o para un gen con múltiples
efectos, el mejor método para determinar qué hace un gen en un organismo es analizar su
función en un organismo modelo. En la Sección 15.2, se describió la producción de ratones
transgénicos por microinyección pronuclear. Los ratones transgénicos diseñados de esta manera
son generalmente mutantes de "ganancia de función" puesto que el transgén está diseñado para
expresar un nuevo producto génico o para poner en cortocircuito un gen normal. Otro medio de
prueba para la función génica in vivo es por genética knockout en la que un gen particular se
interrumpe deliberadamente. Los ratones transgénicos elaborados por este método se
denominan mutantes de "pérdida de función" (cuadro 15.2).

La habilidad de crear un ratón de cualquier genotipo deseado fue trasladada de la ciencia a la

realidad por la visión y perseverancia de Mario Capecchi. En 1980, Capecchi pidió fondos a los
Institutos Nacionales de Salud (NIH) para probar la factibilidad de lo que llamó "orientación
génica". Propuso alterar con precisión los genes endógenos en células madre embrionarias de
ratón (ES) por recombinación homóloga con una secuencia de ADN extraño. Su propuesta fue
rechazada porque los revisores pensaron que obtener una repetición homóloga era casi
imposible. Capecchi utilizó fondos de otro proyecto para llevar a cabo experimentos exitosos y
adquirió datos que demuestran que la orientación de genes era, de hecho, posible. En 1984, él
sometió una segunda petición al NIH para la financiación que era acertada. Según Capecchi en
un artículo científico-americano que escribió en 1994, "La crítica de esta propuesta se abrió con
la declaración:" Nos alegramos de que no sigas nuestro consejo".

La captura del primer ratón "knockout" utilizando este método de direccionamiento génico fue
reportada por Capecchi en 1990. Los ratones homocigóticos para la pérdida del proto-oncogén
int-1 mostraron anomalías graves en el desarrollo del mesencéfalo y cerebelo. Desde entonces,
se han desarrollado muchas variaciones de esta técnica. Por ejemplo, los ratones knockin y
knockdown han sido manipulados donde la expresión del gen anendógeno está alterada, pero
no necesariamente inactivada. Los cambios dirigidos se introducen en la secuencia de la región
codificadora o elementos reguladores aguas arriba del gen. Además, se han diseñado sistemas
de expresión inducibles y condicionales para modelos de ratón dirigidos a genes.

Ratones knockout

La fabricación de ratones knockout requiere un conocimiento exacto de la secuencia de ADN

completa del gen de interés, o al menos una parte significativa de la misma. Esto significa que
no es una técnica de cribado para inprocesses hallazgo genes implicados sino más bien un medio
de la asignación de funciones a genes conocidos con método roles.The mal entendido
desconocida o desarrollados por Capecchi para hacer ratones knockout implica cinco etapas
principales: (i) construcciónde la focalización vector; (Ii) la orientación génica en células madre
(ES) derivadas de embriones; (Iii) selección de células dirigidas a genes; (Iv) introducción de
células ES específicas en embriones de ratón e implantación en una madre de crianza temporal;
Y (v) análisis de ratones quiméricos y endogamia (Fig. 15.4). El foco de esta sección está en los
ratones transgénicos, la tecnología butknockout no se limita a este organismo modelo. Se han
creado huellas genéticas de peces cebra, moscas de fruta y muchos otros sistemas eucarióticos
usando métodos similares. Más recientemente, se diseñaron células madre embrionarias
humanas dirigidas por genes, aunque en este caso los experimentos terminaron con las células
madre.

Construcción del vector de orientación

Una molécula de ADN recombinante llamada "vector de orientación" es construida en el

laboratorio por los investigadores (Fig. 15.4). El gen clonado de interés se interrumpe
típicamente mediante la inserción del gen neor, que codifica la enzima neomicina
fosfotransferasa. Sirve como un marcador para indicar que el ADN del vector se integró en un
cromosoma de ratón. El inserto neor es flanqueado por secuencias de ADN de los dos extremos
del gen de interés. Estas regiones especıficas del gen proporcionan la región de homología para
la recombinación con el gen endógeno endógeno correspondiente. El vector diana también se
diseña para llevar un segundo marcador en un extremo: el gen de la timidina quinasa del
herpesvirus (tk). Estos marcadores son estándar, pero otros podrían ser utilizados en su lugar.

La orientación génica en células ES

El siguiente paso en la creación de un ratón knockout es obtener células ES de un embrión de

ratón temprano. Las células ES se utilizan por dos razones principales. Primero, se pueden
cultivar en el laboratorio indefinidamente. En segundo lugar, son pluripotentes, es decir, son
capaces de dar origen a todos los tipos de células porque aún no están especializados. Los
investigadores consideran conveniente usar el color de la capa de futuros cachorros de ratón
recién nacidos como una guía visual para saber si las células ES han sobrevivido en el embrión.
En el ejemplo mostrado en la Fig. 15.4, las células ES se obtienen a partir de un ratón con una
capa abrown y se implantan en un embrión de una cepa negra de ratones. Las células ES llevan
dos copias del gen agouti. Este gen produce coloración marrón dirigiendo el pigmento amarillo
que se deposita junto al pigmento negro en el cabello. La producción de los pigmentos amarillo
y negro está bajo el control de otros genes. El gen agouti es dominante y genera una capa parda
incluso cuando está presente en las células como una copia única. Alternativamente, las células
ES se pueden obtener de un ratón con una capa negra Dominante) y se implantó en el anembryo
de una cepa albina (recesiva) de ratones.

Las células ES se transfectan con el vector diana, ya sea por transfección química o por
electroporación. Pueden tener lugar tres eventos: ninguna recombinación, recombinación
homóloga o recombinación no homóloga. La recombinación homóloga es un evento muy raro
en células de mamíferos, que ocurre en el mejor de los casos en solo una de 1000 células. La
recombinación no homóloga es un evento más común e implica una integración aleatoria.

Selección de células ES segmentadas por genes

La tercera etapa en la creación de un ratón knockout es seleccionar para la rara célula ES en la

que ha tenido lugar la recombinación homóloga. La célula o células objetivo se selecciona
mediante un procedimiento prolongado de cribado y enriquecimiento (figura 15.4). Este es un
paso que requiere mucho tiempo - un montón de células y un montón de ensayos son necesarios
para obtener un cultivo puro de las células ES objetivo.
Introducción de células ES en un embrión de ratón e implantación en una madre adoptiva

Los embriones de ratón en la etapa de blastocisto (4,5 días de edad) aún no se han unido al útero
de la madre y pueden manipularse en una placa de Petri. Cuando se obtiene una población pura
de células ES objetivo, las células son inyectadas en la cavidad blastocélica de un blastocisto de
una cepa negra de ratones (Fig. 15.4). Estos receptores blastocistos carecen del gen agouti que
está presente en las células ES objetivo. En ausencia de las células ES, el embrión adquiriría una
capa totalmente negra. El embrión alterado se implanta en el útero de una madre de crianza
mediante procedimientos quirúrgicos y se le permite crecer hasta el término.

Análisis de ratones quiméricos y endogamia

Cuando los cachorros de ratón nacen varias semanas más tarde, los investigadores examinan las
capas de los recién nacidos. El color negro sólido indica que las células ES no sobrevivieron al
procedimiento. Si los cachorros tienen un pardo pardo y una capa negra, esto indica que las
células ES han sobrevivido y proliferado, contribuyendo a la formación de la mayoría de los
tejidos de parto (Fig. 15.4). Estos ratones se llaman "quimeras" porque contienen células
derivadas de cepas diferentes de ratones. Algunas de las células germinales se derivarán de las
células ES dirigidas y otras se alojarán del blastocisto receptor. Conseguir las células ES
específicas en la línea germinal es estrictamente una cuestión de azar. Por lo tanto, muchos
ratones quiméricos pueden tener que ser creados y criados antes de que los investigadores
tengan éxito al pasar la mutación dirigida a la siguiente generación.

Para obtener un linaje puro, los machos quiméricos se acoplan a hembras negras (no agouti)
(Fig. 15.4). Cualquier descendiente negro se descarta, ya que representan ratones que surgen
de esperma sin el gen knockout. La presencia de una capa marrón indica que los ratones son
heterocigotos para el knockout del gen dirigido: el onechromosoma tiene el gen de interés
interrumpido, mientras que el otro cromosoma en el par tiene un gen intacto. Los machos y las
hembras que llevan el knockout del gen dirigido son entonces acoplados a cada uno Otro para
producir eventualmente ratones homocigóticos, en los que ambos cromosomas en el par tienen
el gen de interés interrumpido. Estos ratones se identifican mediante el análisis directo de su
ADN, bien por transferencia de Southern o PCR (ver cuadros de herramientas 8.3 y 8.7). A
continuación, los investigadores confirman que los ratones realmente carecen del producto de
genes objetivo en todos los tejidos del cuerpo. Se analizan mediante técnicas tales como
Northern blotting o RT-PCR para ARN, y Western blotting para proteínas (ver Figuras 9.8 y 9.9).
Finalmente, los ratones son examinados cuidadosamente para detectar cualquier signo de
anormalidades morfológicas o de comportamiento. El fenotipo del ratón muestra el impacto del
gen particular sobre el desarrollo del ratón y la fisiología (Fig. 15.5).

Ratones knockin

Dependiendo de la pregunta de investigación, un experimentador puede estar interesado en

expresar transgenes a partir de elementos reguladores conocidos, o para modificar en lugar de
simplemente inactivar el gen diana. Tal expresión de las secuencias de ADN introducidas puede
lograrse generando un ratón knockin. El método es esencialmente el mismo que para generar
ratones knockout - un vector diana con un inserto de ADN extraño se introduce en un locus
especıfico mediante recombinación homóloga en células ES. El método knockin se utiliza a
menudo para la mutagénesis dirigida in vivo (véase la figura 9.7). Pueden crearse sustituciones
o deleciones de una sola base para estudiar la correlación de estructura y función del producto
génico en el animal completo. El alelo knockin reemplaza la región codificante del alelo
endógeno, manteniendo intactos los elementos reguladores endógenos aguas arriba. El alelo
knockin se expresa generalmente precisamente como el gen endógeno habría sido expresado.

Ratones knockdown

Las estrategias de orientación génica también pueden aplicarse para inactivar o modificar los
niveles de expresión de un gen, modificando los elementos reguladores cis (por ejemplo, la
región promotora u otras secuencias reguladoras aguas arriba, véase la Sección 11.3). La
fabricación de un ratón "knockdown" es análoga a "promotor bashing" (véase la Sección 9.4 y la
Figura 9.7), pero con la ventaja de analizar los efectos sobre la expresión génica endógena en
todo el animal. Se pueden crear sustituciones o supresiones de una sola base para estudiar los
elementos reguladores Requerido, por ejemplo, para impulsar la expresión genética especıfica
de la fase especıfica del tejido o del desarrollo. El knockdown targeting secuenciado interrumpe
los elementos reguladores endógenos aguas arriba, manteniendo intacta la región de
codificación endógena. El efecto de la mutación dirigida sobre la transcripción de genes se
analiza entonces en los ratones knockdown.

Kockout condicional y knockin ratones

Gen knockouts a menudo dan lugar a la letalidad embrionaria. Para que sea posible estudiar el
papel de un gen en el desarrollo posterior o en el ratón adulto, es útil diseñar una mutación
condicional del gen diana. Los interruptores genéticos pueden diseñarse para dirigir la expresión
o la interrupción de cualquier gen (para el que se dispone de información de secuencia básica)
a cualquier tejido en cualquier momento definido. Uno de estos conmutadores genéticos es el
sistema Cre / lox. Este sistema se basa en el uso de la recombinación de ADN específica del sitio
(Fig. 15.6).

Sistema Cre / lox para la recombinación específica del sitio

Se conocen recombinaciones de ADN especıficas de sitio desde los primeros tiempos de la

biología molecular. El primer miembro de la familia "Int" de recombinasas especıficas de sitio se
descubrió a través del estudio de mutantes (int-) defectuosos de integración del bacteriófago
lambda (λ). Estos mutantes eran defectuosos en la integración y escisión del ADN del fago λ
dentro y fuera del cromosoma de la célula huésped (véase la figura 8.1). Desde la década de
1960, la familia Int ha crecido a más de 100 miembros. Uno de los miembros más conocidos de
la familia es la recombinación Cre (recombi- nación de ciclación) del bacteriófago P1. Tener un
conocimiento detallado de las propiedades y la función de Cre permitió a los científicos
desarrollar un método elegante y preciso para controlar la expresión génica en ratones.
Reconoce específicamente un sitio de 34 pb en el genoma del bacteriófago P1 llamado lox (locus
de X-over) y cataliza la recombinación recíproca entre pares De sitios lox (Fig. 15.6). A diferencia
de muchas recombinasas de la familia Int, no se requieren factores accesorios del huésped para
la recombinación mediada por Cre. Esta característica hace muy útil para la manipulación
genética en células eucariotas. La Figura 15.6 muestra un ejemplo de activación de la expresión
de transgenes por recombinación especıfica de sitio. Para los mutantes condicionales de ratones
knockout, es posible modificar el gen diana por recombinación homóloga en células ES de modo
que se flanquea por sitios lox. El micróforo que contiene este gen modificado se atraviesa
entonces con ratones que expresan Cre en el tejido diana deseado. La excisión mediada por Cre
da lugar a un knockout de genes específicos de tejidos (Fig. 15.7).
15.4 Otras aplicaciones de la tecnología de animales transgénicos

El enfoque de este capítulo hasta ahora ha sido principalmente en la investigación básica

utilizando ratones transgénicos o de genes. La tecnología transgénica se ha aplicado a muchos
otros animales con éxito variable, incluyendo animales de granja, monos y peces cebra. Los
animales transgénicos han sido explorados como herramientas para propósitos aplicados, que
van desde el trabajo en el hogar (Focus box 15.3) hasta los productos farmacéuticos.

Primates transgénicos

Los ratones no siempre proporcionan un modelo preciso de fisiología humana y patología de la

enfermedad. Por ejemplo, un modelo de ratón para el síndrome de Lesch-Nyhan no imita los
síntomas clásicos de la enfermedad.Lesch-Nyhan es una rara enfermedad ligada a X en los seres
humanos debido a la pérdida de actividad de HPRT (hypoxanthine-
guaninephosphoribosyltransferase), una enzima que juega un papel Papel importante en el
metabolismo de las purinas. Esta deficiencia resulta en profundas anomalías conductuales,
motrices e intelectuales en los niños, incluidas las conductas auto-mutilantes, como el picoteo
de los labios y los dedos y / o el golpear la cabeza. Los ratones tienen vías alternativas para el
purinemetbolismo que no están presentes en los seres humanos, por lo que aunque la
deficiencia enzimática puede ser reproducida por desbloqueo del gen HPRT, los ratones
knockout sólo muestran cambios neuroquímicos o funcionales menores.

Debido a estos problemas en el desarrollo de modelos de ratón, ha habido cierto interés en

extender estudios de genes y de genes dirigidos a primates no humanos. Dado que el desarrollo
de los primates está mucho más cerca del desarrollo humano que el de los ratones, pueden
ofrecer oportunidades para una mejor comprensión y tratamiento de las enfermedades
genéticas humanas. Sin embargo, los beneficios potenciales del uso de primates en la medicina
experimental tienen que ser sopesados contra los costos éticos y fi nancieros.

En enero de 2001, el primer primate transgénico - un mono rhesus - fue manipulado usando una
aproximación alternativa para lograr la transferencia génica. El método estándar de
transferencia de genes, la microinyección pronuclear, que es ampliamente utilizado en la
producción de ratones transgénicos, sólo ha tenido un éxito limitado en la producción de
animales transgénicos de especies más grandes. En su lugar, los investigadores usaron un vector
de retrovirus modificado genéticamente (ver Cuadro de enfoque 17.3) para introducir el gen
GFP en huevos de monos rhesus no fertilizados. Cuando es exitoso, la transferencia de genes
mediada por vector de retrovirus da como resultado la integración aleatoria del gen extraño en
los cromosomas del huevo. Los huevos fueron fertilizados por inyección intracitoplasmática de
espermatozoides unas horas más tarde - un método desarrollado previamente en el ganado
vacuno. Luego se implantaron embriones fertilizados en un mono rhesus hembra. A partir de
intentos múltiples (224), una tal fecundación dio como resultado el nacimiento vivo de un
lactante que portaba el transgén GFP y que expresaba el ARNm a niveles relativamente bajos.
Este mono transgénico fue llamado ANDi, para "DNA insertado" (en la "dirección transcrita
inversa"). Sin embargo, por razones desconocidas, ANDi no brilló verde en ningún tejido
accesible. Queda por determinar si los primates transgénicos resultarán útiles en la medicina
experimental.

Ganado transgénico

La tecnología transgénica ha sido de interés en la agricultura debido a su potencial para ser

utilizado para aumentar el rendimiento de animales comercialmente importantes añadiendo
nuevos rasgos (por ejemplo, una tasa de crecimiento más rápida, resistencia a la enfermedad,
disminución de la grasa corporal) o mejorando los existentes Carne y leche). Se han hecho
intentos de usar microinyección pronuclear para producir ganado transgénico como cerdos,
cabras, ovejas y ganado con un éxito limitado. Menos del 1% de los descendientes son
transgénicos.

Una técnica recientemente desarrollada mejora en gran medida la eficiencia de producción de

grandes animales transgénicos. El método se llama transferencia de genes mediada por
espermatozoides (LB-SMGT). La proteína enlazadora, el anticuerpo amonoclonal (mAbC) es una
proteína básica que se une al ADN a través de una interacción iónica permitiendo que el ADN
exógeno se conecte específicamente al esperma. MAbC es reactivo a un antígeno de superficie
en espermatozoides de todas las especies probadas, incluyendo cerdo, ratón, pollo, vaca, cabra,
oveja y humanos. En un estudio con cerdos, el transgén se integró con éxito en el genoma con
transferencia de la línea germinal a la generación F1 a una tasa altamente eficiente del 37,5%
(Figura 15.8).

Gene pharming

Otra aplicación de la tecnología de animales transgénicos es "pharming pharming" - convirtiendo

a los animales en biorreactores farmacéuticos para terapias humanas basadas en proteínas. Por
ejemplo, un fl ujo de ovejas transgénicas fue manipulado por una compañía farmacéutica para
producir α1-antitripsina (AAT). Esta enzima se utiliza en el tratamiento del enfisema hereditario
y la fibrosis quística. Sin embargo, debido a las preguntas sobre la pureza del AAT producido en
la leche de oveja, los ensayos humanos en gran escala y la producción se han puesto en
suspenso.

Una estrategia alternativa que se está explorando es el uso de pollo transgénico como
biorreactores. En este enfoque, el gen humano de interés está unido al promotor de una
proteína de clara de huevo de pollo. Después de establecer una línea de pollos transgénicos, los
pollos se utilizarían entonces para fabricar cantidades comerciales de proteínas humanas
recombinantes más puras en los blancos de los huevos que ponían. Los huevos, aunque no
transgénicos, ya se utilizan como biorreactores para la producción de vacunas (incluso contra la
influenza). La dificultad hasta la fecha ha sido la creación del pollo transgénico en el primer lugar.
El uso del método de inyección pronuclear estándar es particularmente difícil debido al tamaño
del huevo, la presencia de una cáscara, la gran cantidad de yema de huevo y la dificultad de
recolectar un huevo antes de que comience a crecer. Hasta ahora, los pollos han sido
manipulados que producen la proteína reportera β-galactosidasa en sus huevos. Otros
investigadores han utilizado técnicas de transferencia génica de esperma de gallo para producir
pollos transgénicos que expresan GFP (proteína fluorescente verde) unida al promotor del gen
lisozima en la clara de huevo. En este método, se utilizó un anticuerpo amonoclonal que se une
específicamente a la superficie del esperma (mAbC, véase la sección anterior). Esto permite que
el ADN ligado al anticuerpo entre en la célula espermática y se incorpore en el espermogénoma.

15.5 Clonación por transferencia nuclear

Los clones son individuos genéticamente idénticos. Los gemelos idénticos son clones naturales,
pero también es posible producir clones artificiales mediante transferencia nuclear. En este
método, el núcleo se retira de la célula asomática (cuerpo) y se coloca en un huevo cuyo núcleo
se ha eliminado. Los primeros experimentos de clonación de animales se llevaron a cabo en la
década de 1950 cuando los biólogos de desarrollo Robert Briggs y Thomas King desarrollaron un
método para el trasplante nuclear en la rana leopardo, Rana pipiens. Su razón para la clonación
no era con el propósito de producir muchas ranas. En cambio, estaban interesados en probar
directamente la cuestión de la equivalencia genética de los núcleos de células somáticas en el
desarrollo y la diferenciación celular. En otras palabras, ¿la diferenciación celular depende de
cambios en la expresión génica o cambios en el contenido de la genoma? Esta ha sido una
pregunta de larga data en biología del desarrollo.

Equivalencia genética de núcleos de células somáticas: experimentos de clonación de ranas

En 1893, August Weismann propuso que a medida que las células se diferencian, los genes que
ya no se requieren para otros tipos de células especializadas se pierden o permanentemente se
inactivan. Hans Spemann realizó experimentos en 1914 que parecían enfurecer esta propuesta.
Sus resultados sugieren que el genoma completo se reproduce durante la división celular, al
menos durante la escisión temprana. Sin embargo, los experimentos de fi nitivos fueron
realizados por Briggs y King casi cuatro décadas después. Ellos mostraron que un renacuajo
normal rayado de R. pipiens puede obtenerse trasplantando el núcleo de una célula blástula
(embrión muy temprano) en un óvulo enucleado. A medida que las células se diferenciaban en
embriones más antiguos, la capacidad para desarrollarse en una rana se redujo drásticamente
(Fig. 15.9A). En la década de 1960, John Gurdon y colaboradores llevaron a cabo experimentos
de trasplante nuclear similares utilizando Xenopus laevis, la rana con garras del sur de África. Se
utilizaron núcleos de células epiteliales intestinales de renacuajos y aproximadamente el 1% de
los embriones se convirtieron en ranas adultas fértiles normales (Fig. 15.9B).

Los resultados de Gurdon y sus colaboradores confirmaron la conclusión de Briggs y King de que
la capacidad de un núcleo trasplantado para promover el desarrollo normal disminuye a medida
que la célula se hace más diferenciada. Sin embargo, su excitante y novedosa conclusión fue que
algunas ranas adultas normales podrían desarrollarse a partir de núcleos Incluso de las células
más diferenciadas. Estos hallazgos establecen el principio básico de que el proceso de
diferenciación celular no requiere necesariamente ningún cambio estable en la composición
genética de una célula. La celdiferenciación depende de los cambios en la expresión no del
contenido del genoma. La confirminación de estas propiedades en células de mamíferos tardó
otros 30 años.

Clonación de mamíferos mediante transferencia nuclear

Un desafío importante en la realización de transferencia nuclear de células somáticas en

mamíferos es el tamaño pequeño del huevo de mamífero. El huevo de mamífero (en la segunda
metafase meiótica) es menos del 0,1% del volumen de un frogegg. Las técnicas de
micromanipulación, enucleación y fusión de un óvulo con una sola célula somática se
desarrollaron a finales de los años sesenta y principios de los setenta. Aun así, las transferencias
de núcleos de embriones muy tempranos en huevos de ovejas enterrados no se llevaron a cabo
con éxito hasta 1986. Este éxito fue seguido por la clonación de conejos, cerdos, ratones, vacas
y monos utilizando núcleos donantes de embriones muy tempranos (Tabla 15.2, 15.10). Los
intentos de clonación de primates no humanos han resultado difíciles; Neti y Ditto son los únicos
monos rhesus con éxito clonados hasta la fecha. En 1996, Keith Campbell e Ian Wilmut
desarrollaron esta técnica y realizaron la transferencia de núcleos de una línea de células madre
embrionarias establecida a ovocitos enucleados. Estas transferencias nucleares dieron como
resultado dos ovejas clonadas saludables denominadas Megan y Morag.

"Breakthough of the year": la clonación de Dolly

Durante una década, los clones de mamíferos sólo recibieron un poco más de atención que las
ranas clonadas (que fuera de los círculos de biología del desarrollo era limitada). Luego, con el
nacimiento de Dolly en 1997, un fl ujo de mediación puso la clonación en el centro de atención.
La portada de Science (19 de diciembre de 1997) llamó a Dolly "Breakthrough of the year". La
oveja Dolly fue clonada de la célula de ubre de una oveja adulta en Escocia por Wilmut, Campbell
y compañeros de trabajo. Hasta este momento, la clonación en mamíferos sólo era posible
utilizando el nucleo obtenido de embriones muy tempranos. Dolly fue el primer mamífero
clonado de una célula adulta. Sin embargo, hubo someducado sobre si Dolly se generó a partir
de una célula mamaria completamente diferenciada o una célula madre, ya que las células
mamarias contienen una variedad de tipos celulares y diferentes etapas en el proceso de
especialización.

No es de extrañar que el uso de células somáticas adultas estimuló al público en general, a

científicos, novelistas, periodistas, cineastas, políticos, teólogos y éticos a pensar en la aplicación
de la clonación a los seres humanos.

En una nota más fundamental, la clonación de Dolly con fi rmó los dos principios clave de la
equivalencia genética. Primero, las células animales diferenciadas por sí mismas no pueden
desarrollarse en animales completos, pero los núcleos de las células más diferenciadas
conservan toda la información genética necesaria. En segundo lugar, la transferencia de un
núcleo de una célula diferenciada al ambiente del huevo enucleado reprograma el núcleo (hace
olvidar su historia) y permite el desarrollo completo de un animal viable que sea genéticamente
idéntico al donante de la célula somática.

Desde Dolly, muchos otros mamíferos han sido clonados exitosamente a partir de núcleos de
células donantes adultas. Estos incluyen vacas, cerdos, ratones, gatos domésticos, caballos e
incluso una mula (Tabla 15.2, Fig. 15.10). Este último clon era particularmente novedoso porque
una mula es un híbrido estéril que resulta de la cría de un burro macho con caballo a la vez. La
eficiencia de los experimentos de transferencia nuclear de mamíferos es muy similar a la
obtenida de las ranas. Menos del 1% de todas las transferencias nucleares de células adultas
diferenciadas dan como resultado descendencia normal.

Método de clonación mediante transferencia nuclear

La técnica básica para la clonación mediante transferencia nuclear o "clonación reproductiva"

se muestra en la Fig. 15.11, usingheep como ejemplo. La clonación comprende cuatro pasos
principales: (i) preparación de células donantes; (Ii) enucleación de huevos no fertilizados; (Iii)
transferencia nuclear por fusión celular; Y (iv) implantación del embrión en una madre sustituta
y análisis de clones.

Preparación de células donantes

La fuente de células donantes para la transferencia nuclear puede ser células madre
embrionarias totipotentes o células somáticas diferenciadas. Un aspecto clave del éxito de la
transferencia nuclear es tener el núcleo del donante y el huevo en la misma fase del ciclo celular.
Antes de la fecundación, el núcleo del huevo es bastante inactivo. El núcleo de la célula donante
también debe hacerse inactivo, de lo contrario no se reprogramará y el desarrollo puede fallar.
Para lograr la inactivación, las células donantes se cultivan y después se mueren de hambre para
ciertos nutrientes esenciales. Esto los coloca en un estado no dividido en el ciclo celular en el
que no hay expresión génica (fase G0) (Fig. 15.11). Este estado quiescente es compatible con la
transferencia nuclear.
Enucleación de huevos no fertilizados

Los cromosomas de un óvulo no fertilizado, también denominado ovocito (célula de huevo

detenida en la metafase II de meiosis) se eliminan usando un micropipet (Fig. 15.11).
Recientemente, algunos investigadores han comenzado a usar el procedimiento del agente.
Retirar el núcleo usando un micropipet puede dañar la maquinaria de la proteína que controla
la división celular. Un método más reciente consiste en cortar un pequeño agujero en la
membrana del huevo y exprimir suavemente el núcleo.

Transferencia nuclear

Después de la enucleación, se utiliza un micropipeta para inyectar una célula donante intacta en
la cavidad entre la membrana plasmática del huevo y la membrana no celular que rodea al óvulo
(Fig. 15.11). Las dos células se suelen fundir por electrofusión. El óvulo y la célula donadora
reciben un pulso eléctrico que provoca rupturas en las membranas celulares de las dos células,
permitiendo que el contenido de cada una se mezcle antes de la cicatrización de la membrana.
El paso de transferencia nuclear proporciona el huevo no fertilizado con un conjunto diploide
de cromosomas por lo que no hay necesidad de esperma. La descarga eléctrica puede activar
algunos huevos para someterse a escisión. En la mayoría de los casos, sin embargo, se requiere
tratamiento adicional (tal como un pulso eléctrico adicional). Alternativamente, en algunos
experimentos con ratones, se pueden inyectar núcleos aislados en huevos que luego se activan.

Implantación y análisis de clones

Después de aproximadamente 7 días en una placa de petri, el embrión en la fase de blastocisto

se implanta en el útero de la madre asurrogada. Si el embarazo tiene éxito, los descendientes
clonados resultantes son genéticamente idénticos al núcleo donante original (Fig. 15.11). Para
confirmar esto, los investigadores usan las técnicas de tipificación de ADN para comparar los loci
específicos de repetición tándem (STR) específicos entre la descendencia y el animal donante
original (ver Sección 16.2 para los métodos).

Fuente de mtDNA en clones

Cuando se utiliza el método de fusión celular, el embrión reconstruido contendrá citoplasma de

huevo y el núcleo donante con su citoplasma acompañante. Por lo tanto, el embrión contendrá
mitocondrias de ambas fuentes; Será heteroplasmático para el ADN mitocondrial (ADNmt) (Fig.
15.11). Las mitocondrias heredadas del huevo receptor podrían tener una in fl uencia
importante sobre funciones tales como el desarrollo muscular y la fisiología que dependen de la
expresión génica mitocondrial. Por tanto, un clon no es realmente genéticamente idéntico si se
tiene en cuenta el ADNt. La excepción sería si se hace un clon utilizando un núcleo donante de
la célula somática de una hembra adulta y uno de sus huevos se utiliza como receptor.

¿Por qué es ineficiente la clonación por transferencia nuclear?

Todavía no se ha demostrado que el procedimiento de clonación carezca de riesgo.

Actualmente, la tecnología tiene una eficiencia real, menos del 1-10% de los embriones de
mamíferos clonados dan como resultado descendencia. Por ejemplo, para crear Dolly, se
necesitaron 277 ensayos; Es decir, se crearon 276 embriones que no sobrevivieron al
procedimiento. Además, el deseo de una descendencia anormal es muy alto. Los éxitos y
fracasos de la clonación han generado controversia en muchos países, sobre todo porque
algunos científicos han sugerido la clonación de seres humanos. Muchos argumentan que la
clonación reproductiva humana debe hacerse ilegal, si no por otra razón debido a los muchos
defectos observados después del nacimiento en mamíferos clonados.

Se pueden encontrar múltiples defectos genéticos en ratones clonados. Cuando se

seleccionaron 10.000 genes, se demostró que el 4% funcionaba incorrectamente. Los animales
clonados sufren de anomalías en el desarrollo, incluyendo gestación extendida, gran peso al
nacer, formación inadecuada de la placenta y defectos histológicos en la mayoría de los órganos,
incluyendo el riñón, el cerebro, el sistema cardiovascular y el músculo. Hay una tendencia a la
obesidad, insuficiencia hepática, neumonía y muerte prematura. En algunas especies ensayadas
hasta el momento (ratones y cerdos), estos fenotipos anormales no se transfirieron a
descendientes posteriores.

Estos efectos, al menos en los clones de primera generación, pueden deberse a una
reprogramación inefectiva; Es decir, el núcleo no es capaz de olvidar su "historia". La
reprogramación nuclear es la inversión del patrón de expresión génica de una célula
diferenciada a una que es totipotente y capaz de dirigir el desarrollo normal. Además, puede
haber efectos del envejecimiento celular, debido a la edad del núcleo del donante. Finalmente,
los defectos genéticos pueden surgir de una segregación inadecuada de los cromosomas
durante las divisiones de células embrionarias. Se ha demostrado que los monosembrones de
Rhesus generados por transferencia nuclear carecen de componentes importantes del eje
mitótico (Fig. 15.12).

Reprogramar el genoma

Muy pronto en el desarrollo de un embrión las células son "totipotentes" - es decir, son capaces
de formar cualquier tipo de célula y si se separan del embrión puede convertirse en individuos
completos. Las células embrionarias posteriores se vuelven "pluripotentes", es decir, son
capaces de desarrollarse en varios tipos celulares diferentes. A medida que avanza el proceso,
las células se diferencian (se especializan) hacia funciones específicas. Esta restricción en el
potencial de desarrollo se asocia con la expresión génica diferencial. Los genes específicos del
tejido se activan sólo en tipos de células particulares. En contraste, algunos genes, llamados
genes de "limpieza", son tipos de células más íntimas porque son necesarios para funciones
básicas como la síntesis de proteínas o el mantenimiento del citoesqueleto. En una célula
diferenciada, un número relativamente pequeño de genes -estimados en menos del 10% de
todos los genes en el genoma- se expresan en altos niveles, y una fracción relativamente grande
de genes son silenciados. Una cuestión importante es si y cómo estas células Son reprogramados
genéticamente para adoptar un destino diferente durante la clonación. La clonación exitosa
mediante transferencia nuclear de células somáticas requiere la reprogramación de los núcleos
donantes de células diferenciadas a un estado indiferenciado, de manera que las células son
capaces de soportar el desarrollo de todos los diferentes tipos celulares necesarios para
construir un animal. La clonación es ineficaz, en parte, porque el silenciamiento genético es
difícil de revertir en los embriones clonados. Una vez que las células se han diferenciado en tipos
especıficos, la secuenciación de la expresión génica no deseada se controla muy estrechamente.
Por ejemplo, en embriones de ratones clonados, la activación de genes que son silenciosos en
la mayoría de los tejidos adultos pero que son necesarios para el desarrollo temprano -los
llamados "genes de pluripotencia" - parece ser defectuosa (Fig. 15.13). Algunas formas de
silenciamiento de genes parecen ser más fácilmente invertidas que otras. La inactivación de los
cromosomas X es eficientemente invertida y aleatorizada en el embrión, como se ilustra en el
color de la capa naranja y negro de un gato calicó clonado (cuadro 15.4). En contraste, el
resultado es menos claro para la metilación del ADN y la impronta génica. La modificación del
ADN con metil-grupos (metilación) se asocia comúnmente con el silenciamiento génico (ver
Sección 12.2), así como la metilación de las proteínas histonas que compactan el ADN en
cromatina (ver Sección 11.6). La impresión es un proceso que ocurre naturalmente durante la
gametogénesis (la diferenciación de los espermatozoides y los huevos) y el desarrollo temprano,
y controla si ciertos genes se expresan a partir de los cromosomas maternos o paternos (ver
Sección 12.3).

Una exploración más profunda de los mecanismos implicados en la reprogramación debe

proporcionar ideas sobre cómo se mantiene la diferenciación. Esto es de interés tanto en la
investigación básica como en la comprensión de la biología del cáncer, y podría abrir el camino
a la clonación de células madre con fines terapéuticos (véase más adelante).

Efectos del envejecimiento celular

Otra cuestión que ha surgido de la clonación con células adultas, es si hay efectos secundarios a
partir de la edad de la célula donante. Por ejemplo, se reactiva la telomerasa para restaurar la
longitud de los telómeros (ver sección 6.9) Investigaciones recientes sugieren que los animales
producidos por la clonación de células adultas pueden envejecer prematuramente, pero es
necesaria una investigación adicional. Cuando Dolly, la oveja clonada tenía sólo 2 años, comenzó
a mostrar signos de desgaste más típicos de un animal más viejo, y desarrolló artritis a la edad
relativamente joven de 5,5 años. Dolly fue eutanasiada el 14 de febrero de 2003 a los 6 años,
porque De complicaciones de un lungcancer viral inducido comúnmente encontrado en ovejas
más viejas guardadas adentro. Las células de Dolly mostraron una pérdida de telómeros del 20%.
Se cree que la edad del núcleo donante (la célula del útero era de una oveja de 6 años) y se cree
que la proliferación en la cultura antes de la transferencia contribuyó a la pérdida de telómeros.

La edad del núcleo donante puede no ser una consideración en algunas especies. Como ejemplo,
la longitud del telómero se reconstruye en el ganado clonado. Cuando se utilizaron núcleos
donantes de células adultas cultivadas o células fetales, en ambos casos la actividad de la
telomerasa se reprogra- mó en la etapa de blastocisto, dando como resultado telómeros de
longitud similar a los controles pareados por edad.

Aplicaciones de la clonación por transferencia nuclear

El ímpetu detrás de la clonación, al igual que otros desarrollos en la ciencia básica, fue buscar
nuevos conocimientos fundamentales, no hacer legiones de clones. Sin embargo, hay una serie
de intereses comerciales y médicos en la clonación por transferencia nuclear. Estos incluyen la
clonación de animales transgénicos, la clonación de animales de granja o caballos de carreras,
la clonación de mascotas (Focus box 15.4) y especies en peligro de extinción, y la clonación de
células madre.

Clonación de animales transgénicos

Un interés en la clonación por transferencia nuclear es una extensión del "pharming de genes".
La clonación podría utilizarse de manera torpe para producir manadas de animales de granja
transgénicos o dirigidos a genes que producen proteínas humanas valiosas. En julio de 1997, la
oveja "Polly" fue clonada mediante transferencia nuclear. La diferencia entre "Dolly" y "Polly"
fue que el núcleo donante utilizado para crear Polly procedía de células de fibroblastos de oveja
transfectadas de manera estable (transgénicas). El transgén transportado en el núcleo donante
fue diseñado para expresar el factor IX de coagulación humano en leche de oveja. La hemofilia
B de la enfermedad es causada por niveles bajos o una ausencia completa de esta proteína de
la sangre, que es esencial para la coagulación. Los constructos de expresión se componían de las
secuencias codificantes para la resistencia a la neomicina (neor) y el factor IX de coagulación
humano colocado bajo control de la secuencia promotora de β-lactoglobina ovina.

Neor se incluyó para la selección de células con el transgen integrado de forma estable en su
genoma. La secuencia promotora dirige la expresión especıfica del tejido en la glándula
mamaria. Como se señaló en la Sección 15.4, las preguntas acerca de la pureza de las proteínas
humanas producidas en la leche de oveja han detenido los ensayos y la producción humana.

Otros investigadores están interesados en la clonación de animales de importancia agrícola que

son transgénicos para un rasgo particular de interés. Un ejemplo notable es un grupo de
investigadores en Corea del Sur que tienen el objetivo de crear una manada de vacas clonadas
y modificadas genéticamente que sean resistentes a la espongiformencefalopatía bovina
("enfermedad de las vacas locas". Otra aplicación es el xenotrasplante - la utilización de cerdos
modificados genéticamente como fuente de órganos adecuados para su transferencia a seres
humanos.

Clonación de animales premiados

La clonación de animales tiene el potencial de superar las limitaciones del ciclo de reproducción
normal. Los criadores de animales tienen un interés en mantener y propagar rápidamente
rebaños de élite de animales con rasgos superiores, tales como leche con alta producción de
leche o un caballo de carreras campeón. Por lo general, un animal premiado no se identifica
hasta que se produce, por lo que deben utilizarse células adultas diferenciadas para la clonación.
Muchos caballos de carreras masculinos son castrados (castrados) "para mantener su mente en
el juego y no pensar en el sexo opuesto." La clonación permitiría a estos campeones de carreras
de gatos contribuir con su genotipo a las generaciones futuras. En la actualidad, el
Thoroughbreds 'Jockey Club y la American Quarter Horse Association no registrarán clones, por
lo que puede no ser una aplicación práctica de la clonación. En términos de investigación básica,
sin embargo, la clonación de caballos de carreras proporcionaría la oportunidad de probar la
reproducibilidad de rasgos como el carácter y el rendimiento deportivo. Sin embargo, la
naturaleza heteroplásmica del mtDNA en el clon necesitaría ser tomada en cuenta. Como se
observó en una sección anterior, las mitocondrias heredadas del huevo receptor podrían tener
una influencia importante sobre aspectos críticos del rendimiento deportivo, como el desarrollo
muscular.

Conservacion de vida salvaje

La clonación es una de varias maneras de aumentar el número de individuos dentro de una

población cuando la población está en declive. Las poblaciones con un bajo número de
individuos han perdido cierta diversidad genética.

Si los individuos son clonados, en teoría, esto mejoraría la capacidad a largo plazo de las especies
a través de la diversidad genética. Dado que las tasas actuales de éxito con la clonación por
transferencia nuclear son muy bajas, es posible que se necesiten centenares de transferencias
nucleares para obtener un único descendiente. Esto plantea un problema para las especies en
peligro de extinción donde podría no ser posible obtener huevos en tan alto número. Por
ejemplo, el panda gigante sólo ovula uno o dos oocitos al año.
Algunas especies en peligro de extinción han sido clonadas en un intento de preservar la especie;
Sin embargo, dado que estos usaron la "trans-especie" la clonación son realmente híbridos
genéticos (Fig. 15.14). Los animales resultantes de la especie trans-especies son valiosos
cientificamente, pero no son directamente útiles para apoyar a las poblaciones en peligro de
extinción. Uno de los primeros ejemplos de clonación de especies trans es un gaur (Bos gaurus)
producido por científicos de Advanced CellTechnology en Worcester, Massachusetts. El gaur es
un nativo del buey salvaje al sureste de Asia. Desafortunadamente, el clone, creado usando una
célula de la piel de un macho adulto gaur, murió de disentería 2 días después del nacimiento. En
otro esfuerzo, los científicos clonaron un banteng (Bos javanicus), un mamífero silvestre de
pezuña de Java, usando células de la piel nucleifrom de tejido congelado de un banteng que
murió en 1980. El becerro banteng parecía saludable. En ambos casos, el citoplasma del huevo
que se utiliza para crear los embriones se derivó de una vaca domesticada común (Bostaurus).
Así, el embrión contenía mitocondrias de ambas especies, formando un tipo inusual de híbrido.
Si una tal hembra clonada se reprodujera naturalmente con un macho que compartiera su
genoma nuclear, la progenie seguiría teniendo mitocondrias derivadas del donante original y del
óvulo de vaca, ya que el ADNmt se hereda a través del citoplasma materno. Sin embargo, los
clones machos de edad reproductora no transferirían las mitocondrias híbridas a la próxima
generación, por lo que el genoma nuclear de una línea genética masculina de valor particular
podría ser restaurado.

Clonación de células madre

Desde el nacimiento de Dolly las ovejas clonadas en 1997 y el aislamiento de células ES humanas
en 1998, los científicos han esperado combinar las dos técnicas. Su objetivo es crear células ES
con genes que coinciden con un paciente, un enfoque denominado alternativamente "clonación
terapéutica", "clonación para células madre" o "clonación de células". La clonación de células
madre es el término más preciso en este punto, Ya que el uso terapéutico está en el futuro
distante (si es que existe). Todos estos estilos están diseñados para hacer una distinción clara
entre este enfoque, en el cual no hay intento de producir otro humano vivo, y la llamada
"clonación reproductiva" en la que el objetivo final es producir otro organismo vivo.

La clonación de células madre implicaría la creación de un embrión mediante la transferencia

del núcleo de la célula de un paciente en un óvulo humano despojado de su propio núcleo. Se
permitiría que las células clonadas se desarrollaran hasta la fase de blastocisto (30 - 150 células).
Entonces las células serían removidas de la masa celular interna y cultivadas para producir
células madre (Fig. 15.15). La esperanza es desarrollar técnicas de cultivo de células ES en células
específicas para tratar enfermedades tales como la enfermedad de Parkinson, la diabetes o la
lesión de la médula espinal. En teoría, no habría ningún problema con el rechazo inmune en el
uso de injertos derivados de estas células para reparar tejidos enfermos o dañados, ya que se
originaron en las propias células del paciente.

Existe un debate acalorado sobre cómo debería regularse esa investigación; La opinión varía
alrededor del mundo. Actualmente, este tipo de investigación de la célula de vástago no es
apoyada por fondos federales en los EEUU. La principal objeción ética a la clonación de células
madre es la creación de un embrión humano de 30-150 células que se dispersa posteriormente
en un cultivo celular. Algunas personas ven el blastocisto como un ser humano potencial que no
debe ser comercializado y utilizado para "recambios". Otros ven el embrión como simplemente
una colección de células que no tiene posibilidad de convertirse en un ser humano en ausencia
de implantación. Otra limitación a la clonación de células madre puede ser la obtención de un
suministro suficiente de huevos receptores humanos.
Un objetivo subyacente de los investigadores en el campo de la transferencia nuclear es
identificar los componentes moleculares que median la actividad de reprogramación del huevo.
Cuando este notable proceso se entienda mejor, algún día será posible reprogramar las células
somáticas humanas adultas in vitro y cultivarlas en la cultura. Si estas células diferenciadas
pudieran ser devueltas a un estado embrionario "totipotente" sin el paso de clonación, se
resolverían muchas objeciones éticas a la terapia de reemplazo celular.

15.6 Plantas transgénicas

La tecnología transgénica puede usarse potencialmente para aumentar el rendimiento de

plantas comercialmente importantes añadiendo nuevos rasgos (por ejemplo, resistencia a
herbicidas y plagas) o mejorando las existentes (por ejemplo, rendimiento o calidad de frutos y
granos). Sin embargo, la introducción de cultivos genéticamente modificados (GM) en la cadena
alimentaria es fuente de controversia y de preocupación pública, particularmente en Europa.
Algunos problemas de salud humana con GMcrops son su potencial para expresar nuevas
proteínas antigénicas que causan una reacción alérgica en las personas que comen los alimentos
GM, el potencial de otros efectos no deseados o tóxicos, y el potencial de cambios perjudiciales
composición innutrient. Al menos hasta ahora, las evidencias científicas sugieren que los
alimentos GM son tan seguros y nutritivos como las contrapartes convencionales (Focus box
15.5).

La ruta para producir plantas dicotiledóneas transgénicas es relativamente simple por varias
razones. En primer lugar, puede utilizarse el sistema de liberación génica basado en el plásmido
Ti de origen natural y altamente eficiente (véase más adelante). En segundo lugar, a diferencia
de las células animales, las células vegetales diferenciadas son totipotentes, es decir, todavía
tienen la capacidad de producir todos los tipos celulares. En tercer lugar, al menos en algunas
especies, las células vegetales diferenciadas se regenerarán en plantas enteras en condiciones
apropiadas. Las dicotiledóneas (o dicotiledóneas) son una clase de plantas florecientes que
tienen un embrión con dos cotiledones (hojas de semilla). Incluyen plantas familiares como
tomates, patatas, frijoles y guisantes, y la planta modelo Arabidopsis (ver Sección 9.11). Dado
que no se dispone de un sistema de suministro de genes natural similar para plantas
monocotiledóneas, se han desarrollado técnicas alternativas. Las monocotiledóneas
(monocotiledóneas) son una clase de plantas florecientes que tienen un embrión con un
cotiledón, como narcisos, lirios, cereales y hierbas.

Entrega génica mediada por T-ADN

Las plantas vivas y las células de las plantas en cultivo pueden transformarse mediante
transferencia de ADN (T-DNA) extirpado del plásmido Ti (inductor de tumores) Agrobacterium
tumefaciens. A. tumefaciens es una bacteria Gram-negativa del suelo que causa la enfermedad
de la ampolla de la corona en muchas plantas dicotiledóneas. Por lo tanto, el ADN-T
recombinante es un vector de transferencia génica altamente eficaz para plantas dicotiledóneas.
La región T-DNA normalmente lleva genes que codifican las hormonas de plantas y las enzimas
de síntesis opina (aminoácidos modificados). La enfermedad de la gallina de la corona resulta de
la transformación del genoma de la planta con esta parte del plásmido Ti en un proceso análogo
a la conjugación bacteriana. Esta porción inductora de tumores del plásmido puede ser
reemplazada por genes extraños y todavía se transfiere al genoma del huésped.

La estrategia general es cortar los discos foliares (causando lesión celular) y luego incubar con
Agrobacterium transportando los vectores desarmados de Ti (Fig. 15.16). Los discos pueden
entonces ser transferidos al medio inductor de brotes y seleccionados simultáneamente para
marcadores llevados en el ADN-T. Después de unas semanas, los discos son transferidos al medio
inductor de la raíz, y después de otras pocas semanas las plántulas pueden ser transferidas al
suelo.

Electroporación y microbalística

Para la manipulación de otras plantas (incluyendo las principales especies de cereales, arroz,
trigo, maíz y maíz), se han desarrollado técnicas alternativas (ver Tabla 9.2). La electroporación
de protoplastos es adecuada para algunas especies, aunque no todas pueden regenerarse a
partir de células individuales. La técnica más aplicable es la transfección microbalística, que se
ha utilizado para transformar una amplia variedad de dicotiledóneas y monocotiledóneas.