Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Métodos de Análisis

Estudio de algunos factores que afectan el

establecimiento de un método
espectrofotométrico

Profesora! "uillermina #osas $ando%al

Alumno! Miranda &nofre 'osé Manuel

"rupo! (I)*

+ec,a de entrega! ** de abril de -.*/

Estudio de algunos factores que afectan el
establecimiento de un método espectrofotométrico.
Fundamento.
La espectrometr0a es un método qu0mico que se utili1a para cuanti2car la
concentración de analitos utili1ando la lu1 A los métodos que se au3ilian con la
lu1 para lle%ar a cabo un análisis cuantitati%o se le conoce como métodos
espectrofotométricos4 estos pueden tener una sub5clasi2cación dependiendo

de la longitud
están! de onda que
espectrometr0a de utilicen para%isible
absorción el análisis entre los más
6colorimetr0a74 conocidos e
ultra%ioleta
infrarro8o
Para considerar a un método espectrofotométrico como cuantitati%o primero
debe de cumplir ciertas reglas como!

• El método seleccionado deber ser espec02co para cuanti2car un analito

de nuestro interés
• 9ue el método esté libre de todas las interferencias posibles al momento
de ,acer la determinación o en su defecto tratar de controlar lo más
posible estas interferencias
• :ebe de tener alta precisión ; alta e3actitud
• El método debe tener una alta sensibilidad ; además el l0mite de
detección debe de corresponder a una concentración ba8a

E3perimentalmente para el establecimiento de un método espectrofotométrico4

después de optimi1ar las condiciones qu0micas del sistema 6p<4 temperatura4
control de interferentes4 concentración adecuada de reacti%os4 sol%ente
apropiado4 protección a la lu1 para e%itar reacciones fotoqu0micas4 etc7 que
garanticen que se tiene la especie de interés en condiciones adecuadas para la
medida4 se establecen los siguientes parámetros!
Longitud de onda anal0tica4 inter%alo óptimo de concentraciones4 cur%a de
calibración4 sensibilidad del método anal0tico ; l0mite de detección

Objetivos.
• $eleccionar tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas
para el espectrofotómetro
• Mane8ar algunos de los parámetros que inter%ienen en el
establecimiento de un método espectrofotométrico
•
Establecer las condiciones óptimas de los parámetros probados para la
aplicación del método

Datos e informe experimental.

Resultados de la selección de tubos.
Para la selección de los tubos con paredes ópticamente equi%alentes se
tomaron -= tubos4 se llenaron = mL de agua ; se midió su transmitancia a (..
nm4 se seleccionaron *= tubos que estu%ieran entre el inter%alo de >?5>@ dé
 ; que al rotarlos esta no cambiara de manera considerable
A los *= tubos seleccionados se les midió su  a (.. nm con Ni$& (
abla * $elección de tubos comunes para usarlos como celdas

Tubo
No %T
!!
"Ni#O  $
 -*
& -*?
' -*=
 -*=
( --/
) --
* --(
+ --?
, -*/
! -*/
 -*?
& -*@
' --=
 --(
( -*/

El diámetro interno equi%alente ,ace referencia a que los tubos deben de tener

la misma medida
%ariaciones en deresultados4
los diámetro ; super2cies
a lo largo del tuboequi%alentes
ópticamente para e%itar
se
re2ere a que en la super2cie del tubo debe de ser de tal manera que la lu1
pase de manera ,omogénea a tra%és de él4 ; del resto de los tubos
Curva de calibración.
abla - Cur%a de calibración de +e?D por el método del N< ($CN
1 ajustada por
'-
TuboNo Fe " g/m0$ 1+! regresi2n
lineal.
 .4**/?(?@= .4.*@@-@@ .4.@?((?
& .4?(>.?*-= .4.=>(?=- .4*.==?*(*
' .4/>./-= .4**(/?@ .4*=?//--
 *4*/?(?@= .4*>?*(*>@ .4-*@?.?
( *4@(=*=/-= .4?===/*(* .4->.=@.=
) -4?-/@= .4?@(/@== .4?@-@/./
* -4>.=>?@= .4(=@*@(=@ .4(=(>=.
+ ?4(>.?*-= .4=@/@=(*? .4=?@*(.>
, (4.@-.?*-= .4/@?//(*( .4/*>??**
! (4/=?@= .4@*>///? .4/>>*=-*?
 =4*@*@= .4>.?.>>> .4=>=>.*/
& 4*((./-= *4-*(/@.*/ *4*.(//--
 ' *-4@>@*-= *4@((@-@(> *4---*?(

"rá2ca * Cur%a de calibración

f637  .*(3 D ../

#F  .>>

Para el a8uste de la absorbancia por regresión lineal?Dse utili1a la ecuación

obtenida con cada una de las concentraciones de +e 
9ue nos diera como resultado una l0nea recta nos indica que se cumple con la
le; de Bouger ; Beer ;a que se obser%a que la cantidad de lu1 absorbida es
directamente proporcional a la concentración de la muestra por
medio de la ecuación
Método de Ringbom para determinar el %Ep.
abla ? :atos para aplicar el método de #ingbom en la determinación de +e ?D
por el método del $CN 5

Fe'- 1bsortan
Tubo No 0og 3Fe'-4 1+! %T
"g/m0$ cia
5
.4**/?(?@ .4.*@@-@
 .4>?(-=/> >/ (
= ( @
5
.4?(>.?*- .4.=>(?=
& .4(=@*?=/ @4- *-4
= -
>
5
.4**(/?@
' .4/>./-= .4*=/*.=/ @/4 -?4-

>
 .4./=@(?. .4*>?*(*>
 *4*/?(?@= /(4* ?=4>
= @
*4@(=*=/- .4-(*?(? .4?===/*(
( ((4* ==4>
= *@ *
.4?//@@?. .4?@(/@=
) -4?-/@= (-4- =@4
=( =
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= /@ @
.4=(-/(? .4=@/@=(*
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(4.@-.?*- *?
.4/.>*** ?
.4/@?//(*
, -*4- @4
= .- (
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! (4/=?@= *>4* .4>
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.4@/(@*?. .4>.?.>>
 =4*@*@= *-4= @4=
/- >
.4>*.(*. *4-*(/@.*
& 4*((./-= /4* >?4>
> /
*-4@>@*- *4*.@*?=@ *4@((@-@(
' *4 >4-
= (? >

"rá2ca - "rá2ca de #ingbom

El inter%alo de concentración elegido se basa en la parte de la grá2ca donde se

puede obser%ar un comportamiento lineal el cual es desde *4*/?(?@= a
(4.@-.?*-= GgHmL Estas concentraciones corresponden a los %alores de A de
.4*>?*(*>@ a .4/@?//(*(
Para el porcenta8e de error fotométrico 6Ep7 se utili1ó la siguiente formula!
 230.3
%Ep =

pendiente

:onde la pendiente corresponde al tramo donde la cur%a presenta un

comportamiento lineal
$ustitu;endo nos da el siguiente %alor!
230.3
%Ep = 3.11
=

73.908

Efecto del tiempo en la estabilidad del color.

abla ( Estabilidad del color respecto del tiempo
Tiemp"omin$ 1+!
! .==.
'! .(-
)! .(=/
,! .(-?
&! .?>>

"rá2ca ? Estabilidad del color respecto del tiempo

Como se puede obser%ar el color no es estable a lo largo del tiempo por lo que
las lecturas se deben ,acer inmediatamente después de ,aber agregado el
N<($CN
Efecto de la concentración del cromógeno.
abla = Efecto de la concentración de $CN 5 en la determinación de +e?D
 TuboNo #5N 6 Fe'- "g/m0$ #5N6/Fe'- 1+!
"g/m0$
 ->.4(*- (4*?@= />4??@/?.> .4-(.??-*/
& @*4-?/ (4*?@= -.4.*->? .4(..**/>?
' ->.(4*- (4*?@= />?4?@/?.> .4=(=*==*(
 =.4-( (4*?@= *?/4@=-/- .4/-=-=*/=
( @*-4?/ (4*?@= -..4*->? .4/==/.@@?
) **/*/4( (4*?@= -@@?4=.=-( .4/>-=.?>/
* *(=-.4/ (4*?@= ?(//4*== .4@((@-@(>

"rá2ca ( Concentración del cromógeno

En este caso como se puede %er en la grá2ca falta un poco más para alcan1ar
el punto de saturación pero la me8or concentración que se puede usar segn la
grá2ca es *(=-.4/ GgHmL
Efecto del pH en el desarrollo de la reacción entre el Fe3+ el !C" # .
abla / Efecto del p<

TuN
bo p7 1+!
 * .>-
& - .>-/
' ? .>*>
 @ ..-/
( > ..?@
 "rá2ca = Efecto del p<

Como se puede obser%ar a p< alcalino la reacción pierde color ; registra

absorbancias ba8as
Efecto de algunos aniones sobre la absorbancia absoluta.
abla @ Efecto de algunos aniones en la reacción +e ?D 5 $CN5

1ni2n 1+!inicial 1+!8nal 91+!

Fluoruro .>> .?*@ .=-
Oxalato .>> .*?. .@/>
Tartrato .>> ./@ ..?-
Fosfato .>> .(( ..==

Lo que se puede obser%ar es una competencia entre algunos aniones4 como el

Juoruro o el o3alato por el ,ierro Ka que el Juoruro al ser mu; electronegati%o
se %e atra0do por las cargas positi%as del ,ierro4 ; el o3alato tiende a formar un
nue%o comple8o de tres moléculas de o3alato por un catión férrico
$armetros obtenidos para el método sulfocianuro de amonio para determinar
&erro férrico.

:ar;metro <aloroptimo
p7 -
Tiempo Inmediatamente después de agregar
el cromógeno
5oncentraci2n de #5N6 *(=-.4/ GgHmL
0=mites de concentraci2n con *4*/?(?@= a (4.@-.?*-= GgHmL ;
%Ep m=nimo 3.11
 1niones que inter8eren "orden artrato4 +osfato4 +luoruro ; &3alato
creciente$
0=mite de detecci2n del método *.- GgHmL
"0DD$

Calculo de l0mite de detección del método

El l0mite de detección del analito se puede de2nir como la concentración de
analito que proporciona una seal igual a la seal del blanco más tres %eces la
des%iación estándar del blanco Esto nos sir%e para calcular la
concentración m0nima de analito que puede detectar nuestro método
espectrofotométrico
3 Sb
LDD =

:onde $b es la des%iación estándar del blanco ; m es la pendiente de la cur%a

tipo
2
y − yi ¿
^

¿
¿
∑¿
i
¿
=¿
Sb
(
3 0.04729 ) μg
LDD = = 1.0288
0.1379 mL

Discusi2n.
Como se puede obser%ar ,a; di%ersos factores que se deben tomar en cuenta
para la implementación de un método espectrofotométrico4 lo primero es la
selección de las celdas que como ;a %imos4 deben ser ópticamente
equi%alentes ; de diámetro interno equi%alente ;a que si no cumplen con estos
requisitos puede pro%ocarse lu1 parasita lo que afectar0a en las lecturas de
absorbancia ; transmitancia
&tro factor que afecta en este tipo de métodos es el tiempo de duración del

producto colorido4
producir es estableporque no se sabe
en un periodo condee3actitud
largo si elelreacti%o
tiempo4 en caso se que se %a a
la reacción
que se lle%ó a cabo nos pudimos dar cuenta que esta es mu; poco estable por
lo que a los pocos minutos el color de la reacción comen1ara a decaer
dándonos falsos negati%os por lo que se debe reali1ar la lectura
inmediatamente después de comen1ar la reacción
La concentración del cromógeno es otro factor que también ,a; que tomar en
cuenta ;a que de este depende que ,a;a una má3ima absorbancia4 además de
que si se agrega mas esta absorbancia no cambiara por lo cual se estar0a
desperdiciando reacti%o :ebido a esto es importante saber el punto de
saturación
El p< también afecta a la reacción por lo cual ,a; que saber en cual se
desempea me8or la reacción4 en nuestro caso pudimos darnos cuenta que la
reacción se debe lle%ar a cabo en un p< acido de alrededor de - porque en p<
alcalino el cromógeno 6$CN 57 se neutrali1a e%itando la reacción con el ion +e ?D
,aciendo que no ,a;a desarrollo de color ; por lo tanto nos de falsos
negati%os
K por ltimo pudimos notar que la presencia de cierto aniones en la reacción
,acen que esta se modi2que e inter%enga con el desarrollo de color4 en este
caso se usó tartrato de sodio4 Juoruro de sodio4 o3alato de sodio ; fosfato de
potasio Lo que se pudo obser%ar es que el tartrato ; el fosfato casi no
inter2eren en la reacción pero el Juoruro ; el o3alato si4 esto es porque el
,ierro es mas a 2n con el Juoruro debido a su alta electronegati%idad ; al
o3alato porque forma compuestos de coordinación lo cual ,ace que ,a;a una
competencia entre los iones ; el $CN 5 para unirse con el ,ierro

5onclusi2n.
Para un buen establecimiento de un método espectrofotométrico es necesario
elegir inicialmente tubos con super2cies ópticas equi%alentes ; diámetros
similares4 al igual que controlar %ariables como p<4 tiempo4 concentración de
analitos ; presencia de interferencias Además de que debe reali1arse un
amplio estudio del elemento a anali1ar ; %er si este método es el me8or para él

>ibliograf=a.
:A $oog4 '' Lear;4 *>>(4 Análisis InstrumentalO4 Mc"ra5<ill4 (ta Edición4
Apéndice *
orres Cartas $agrario4 "óme1 Benito Carmen écnicas instrumentales
Manual de LaboratorioO Editorial Qni%ersidad Politécnica de )alencia pp /.5
/*