Facultad de Medicina. Escuela de Tecnología Médica. Sede Santiago. Asignatura de Infectología 2018.

Prof TM
Marco Silva G.

MORFOLOGÍA BACTERIANA Y TINCIONES

MÉTODOS DE OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

1.- Observación directa sin tinción o preparación al fresco:

Permite obtener información rápida, para la búsqueda de bacterias y hongos. Además, informa acerca de la movilidad
bacteriana y es un examen de gran utilidad en la observación de sedimentos urinarios y secreciones vaginales.
Técnica: Observación al fresco entre lámina (portaobjetos) y laminilla (cubreobjetos):
a) Colocar una gota de suspensión bacteriana o muestra sobre una lámina (portaobjetos) y cubrir con una laminilla
(cubreobjetos).

b) Observar al microscopio con aumento mayor (40X)

2.- Observación con tinción o coloración: Corresponde a la observación de bacterias fijadas y es la base para la realización
de cualquier proceso de tinción, permite el estudio en detalle de la morfología de las bacterias.

2.1.- Preparación de frotis

- Limpiar un portaobjetos y pasarlo rápidamente por la llama del mechero, enfriar.

- Esterilizar un asa de cultivo hasta que se ponga al rojo vivo, enfriar.
- Colocar una gota de suero fisiológico o agua destilada sobre el portaobjetos.
- Tomar parte de una colonia en medio sólido con asa y emulsionarla con la gota de suero fisiológico.
- Expandir la emulsión sobre la superficie del portaobjetos.
- Sostener el portaobjetos con una pinza a unos 40 cms. sobre la llama del mechero, para secar la película formada
sobre él, o bien secar a temperatura ambiente.
- Una vez seco, fijar la muestra pasando 2 a 3 veces el portaobjetos (con el lado de la preparación hacia arriba) por
la llama del mechero.

Una vez fijadas las muestras se puede proceder a efectuar la tinción.

En bacteriología se utilizan fundamentalmente tres tipos de tinciones:

2.2.- Tinción simple: Estas tinciones se denominan simples ya que sólo permiten definir forma y agrupación. Usan un solo
colorante (azul de metileno, fucsina) y permiten observar muy bien la presencia de microorganismos intracelulares
como Neisseria.

2.3.- Tinciones dobles:

a) Tinción de Gram: Descrita y desarrollada por Christian Gram en 1884, esta tinción es la más importante en
Microbiología, pues permite diferenciar a las bacterias en base a su afinidad tintorial: Gram positivas y Gram
negativas, morfología; Cocáceas, Bacilos, Cocobacilos, Vibrios, Espirilos, Espiroquetas y visualizar su agrupación:

Cocáceas en diplo: Diplococos

Cocáceas en cadena: Streptococcus
Cocáceas en tétrada: Micrococcus
Cocáceas en octógena: Sarcina
Cocáceas en racimo: Staphylococcus

Esta tinción es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana. Tiene gran utilidad
clínica al revisar al microscopio el Gram de la muestra en estudio, ya que orienta sobre las posibles bacterias que
están causando la infección.

Marzo 2018
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Marco Silva G.

Fundamento: El cristal violeta es un colorante que penetra la pared celular de bacterias Gram positivas y negativas.
Posteriormente se agrega el lugol, que es un mordiente o fijador y que forma un complejo con el cristal violeta.
Durante el proceso de descoloración con alcoholacetona, la gruesa pared de los Gram positivos impide la salida del
colorante manteniendo la coloración violeta. En cambio, por el alto contenido lipídico de la pared de los Gram
negativos, el alcoholacetona genera poros, por los cuales, escapa el cristal violeta, la bacteria se descolora y se tiñe
de color rojo con el colorante de contraste (safranina o fucsina).

Técnica:
1. Preparar los frotis bacterianos.
2. Teñir con cristal violeta 1 min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1 min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Descolorar con alcohol-acetona hasta que la preparación deje de perder color (15 seg).
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
8. Teñir con safranina 30 seg.
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparación.
11. Observar al microscopio, con objetivo de inmersión (100X)

b) Tinción de Zielh-Neelsen: Es de gran importancia en Microbiología, ya que permite evidenciar la presencia de

bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR), como Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis
humana. También se utiliza para el diagnóstico de Criptosporidium spp. e Isospora belli que son coccidios
patógenos que producen diarreas agudas.

Fundamento: La fucsina, que es un colorante básico, forma un complejo con los ácidos micólicos de la pared de las
micobacterias. Este complejo es resistente a la descoloración con alcohol-ácido (alcohol clorhídrico),
permaneciendo de color fucsina a diferencia de las otras bacterias que se descoloran. El azul de metileno se usa
como tinción de contraste.

Técnica:

1. Preparar el frotis.
-
2. Cubrir completamente la preparación con carbolfucsina.
-
3. Calentar la preparación cuidadosamente en un mechero Bunsen durante 5
- min, sin que hierva la muestra.
Nota: añadir más carbofucsina conforme ésta se evapora; la preparación no
debe quedar seca en ningún momento.

4. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

-
5. Descolorar con la solución ácido-alcohol hasta que la muestra adopte un color
- rosa claro (unos 30 seg)
6. Lavar con agua para detener la descoloración.
-
7. Teñir con azul de metileno 1 min.
-
8. Lavar con agua el exceso de colorante.
-
9. Secar la preparación.
-

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SEMINARIO

1. ¿Cuáles son las diferencias en la estructura de la pared entre una bacteria Gram positiva y Gram negativa?
Gram (+): Gruesa capa de peptidoglican (pared celular), ácidos teicoicos y lipoteicoicos (une pared con membrana), se tiñe
color violeta-azul, proteínas como la A y la Z

Gram (-): Doble membrana, entre estas está espacio periplasmático donde hay capa delgada de peptidoglican. En membrana
externa hay porinas (paso de moléculas hidrofílicas), lipoproteínas (fijan el peptidoglicano) y lipopolisacáridos formado por
antígeno O y lípido A (virulencia, endotoxina). Se tiñen rosado

2. ¿Qué funciones cumple la pared celular?

Se encuentra fuera de la membrana, otorga rigidez y resistencia osmótica, está formada por peptidoglican (polisacárido unido
por enlaces peptídicos, acetilglucosamida + acetilmuramico) principalmente y clasifica a las bacterias

3. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram y cuál de sus reactivos la hace una tinción diferencial?
Colorante cristal violeta penetra la pared celular de bacterias Gram positivas y negativas. Se agrega el lugol (fijador). Durante
el proceso de descoloración con alcoholacetona, la gruesa pared de los Gram positivos impide la salida del colorante
manteniendo la coloración violeta. En cambio, por el alto contenido lipídico de la pared de los Gram negativos, el
alcoholacetona genera poros, por los cuales, escapa el cristal violeta, la bacteria se descolora y se tiñe de color rojo con el
colorante de contraste (safranina o fucsina).

4. ¿Cómo es la estructura de la pared celular de las micobacterias y que propiedades le confiere a esta célula? ¿Se
tiñen con el método de Gram?
No presentan la membrana fosfolipídica de las GRAM negativas, rica en lípidos, además está formada por un complejo
macromolecular de ácidos micólicos (exclusivos de este grupo y usados como carácter taxonómico), peptidoglucano,
lipoarabinomanano que se une al arabinogalactano (polisacárido) por enlaces fosfodiester. Son acido alcohol resistentes.
No, se utiliza Tinción de Zielh-Neelsen

5. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Ziehl Neelsen y para que se utiliza?

usada para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR). Las paredes celulares de ciertas bacterias
contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con
alcohol-ácido. requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al enfriar con
agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante no sale

6. ¿Qué son los PAMs y que funciones cumplen? Mencione 3 PAMPs como ejemplo.
Son pequeñas secuencias de moléculas encontradas en patógenos. reconocidos por los receptores tipo peaje y por
otros receptores de reconocimiento de patrón. son esenciales para el reconocimiento de los microorganismos por parte de las
células de la inmunidad adaptativa. Lipopolisacárido bacteriano, ácido lipoteicoicos, peptidoglucano, DNA bacteriano

7. ¿Mencione antibióticos que afecten la estructura y síntesis de la pared bacteriana?

Antibióticos beta lactamicos que rompen los puentes peptídicos entre el acetilglucosamida y el acetilmuramico del
peptidoglicano, por lo que se destruye la pared celular bacteriana

8. Mencione antibióticos que afecten la estructura y síntesis de la pared de las micobacterias? ¿Para el tratamiento de
qué enfermedad se utilizan?
Isoniazida: En penicilina y sus derivados. Inhibe la biosíntesis de ácidos micólicos, constituyentes de importancia de la pared
de la célula micobacteriana. Mycobacterium tuberculosis que provoca tuberculosis en humanos
Dapsona: antibiótico que actúa en la síntesis de folatos, claritromicina, rifampicina, clofazimine, etionamida, estreptomicina.
Contra micobacterias atípicas. Debido al desarrollo de resistencias bacterianas, es preciso asociar varios medicamentos

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