Las proteínas quinasas (Cdk) se asocian con distintas ciclinas en las diferentes etapas del ciclo celular,

formando el complejo Cdk-ciclina. La activación de este complejo dispara procesos que conducen a la célula
a través de las distintas fases del ciclo. La degradación de las ciclinas inactiva el complejo.

El control temporal de la sucesión de etapas de ciclo celular depende de una familia de cinasas de
proteínas, que forman complejos con ciclinas, un tipo de proteína que , como su nombre lo indica,
presentan un ciclo temporal de síntesis y degradación: se acumulan en la célula durante la fase G1,
desaparecen hacia el término de la fase S, se sintetizan de nuevo durante la fase G2 y se degradan
al final de la fase M. Así, la actividad de los complejos ciclinas-cinasas (complejos Cdk) se incrementa
y disminuye en varios puntos del ciclo celular, y esta oscilación se relaciona directamente con
cambios en el estado de fosforilación de varias proteínas intracelulares, que inician o regulan los
principales sucesos de la vida celular, entre ellos, la replicación del ADN

Tipos de replicación del ADN

1.- Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las moléculas hijas se conserva una de las
cadenas originales. Cuando Watson y Crick (1953) propusieron el modelo de la Doble Hélice
indicaron que dicho modelo sugería una forma sencilla de replicación. El modelo de replicación
propuesto por Watson y Crick suponía que el ADN doble hélice separa sus dos hebras y cada una
sirve de molde para sintetizar una nueva hebra siguiendo las reglas de complementariadad de las
bases nitrogenadas. Dicho modelo recibió el nombre de Semiconservativo, ya que las dos dobles
hélices recién sintetizadas poseen una hebra vieja (una mitad vieja) y otra hebra nueva (mitad
nueva).Frente al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) se postularon
otros posibles modelos de replicación del ADN, uno de ellos se denominó Modelo Conservativo y
otro Modelo Dispersivo.
2.-Conservadora. Se sintetiza una molécula totalmente nueva, copia de la original. Cuando el ADN
doble hélice se replica se producen dos dobles hélices, una de ellas tienen las dos hebras viejas
(está intacta, se conserva) y la otra doble hélice posee ambas hebras de nueva síntesis. Propone
que cada hebra de la molécula de ADN original (parental) sirve de molde para sintetizar una hebra
hija complementaria. Después que las dos hebras hijas se han sintetizado, estas se unen entre si y
forman la nueva molécula de doble hélice, y se guarda la original.

3.-Dispersora, o dispersante. Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y

fragmentos de la nueva . Cuando el ADN doble hélice se replica se originan dos dobles hélices, cada
una de ellas con hebras que poseen tramos viejos y tramos de nueva síntesis en diferentes
proporciones. Propone que cada cadena de la molécula de ADN se duplica en forma mixta, y al
final las hebras resultantes son una mezcla de fragmentos resultantes de la molécula de ADN y
nuevos fragmentos que se sintetizaron en el proceso.

Enzimas:

-Helicasa: Enzima de desplegamiento del ácido desoxirribonucleico que cataliza el

desenrollamiento de la doble hélice dependiente de energía durante la replicación del ADN.
La proteína de replicación A (RPA, por sus siglas en inglés: Replication protein A) es
una complejo proteico que se une al ADN, especialmente de hebra sencilla. Está implicada en
muchos procesos metabólicos en eucariotas, en especial la replicación del ADN,
su reparación y la recombinación genética. Al unirse al ADN durante la replicación evita que se
pliegue sobre sí mismo para formar estructuras secundarias. Esto mantiene el ADN
desenrollado para que la polimerasa pueda realizar su tarea.
También puede unirse a ADN de cadena doble, aunque con mucha menor afinidad. Se
compone de tres subunidades:

 RPA70, por su peso molecular, 70 kDa.

 RPA32, de 32 kDa.
 RPA14, de 14 kDa. Esta última es la que se sitúa en la zona de unión con el ADN.
Una proteína descubierta recientemente, la hRIP (human RPA interacting protein) es la
encargada en el ser humano de transportar este complejo del citoplasma al núcleo celular y a
la inversa.
Nucleasas y ligasas

Las nucleasas son enzimas que cortan las hebras del ADN mientras se aumenta la velocidad de la
hidrólisis de los enlaces fosfodiéster.

Las nucleasas que hidrolizan nucleótidos a partir de los extremos de las hebras de ADN se
denominan exonucleasas, mientras que las endonucleasas cortan en el interior de las hebras. Las
nucleasas que se utilizan con mayor frecuencia en biología molecular son las enzimas de
restricción, endonucleasas que cortan el ADN por determinadas secuencias específicas.

Las ligasas son una enzima capas de catalizar la unión de hebras del ADN rotas o cortadas, en
donde se da lugar a un nuevo enlace químico, la ligasas son sumamente importante a la hora de la
duplicación del ADN, ya que unen las hebras del ADN.

Topoisomerasas y helicasas

Las topoisomerasas son enzimas que a la vez actividad nucleasa y ligasa.

Algunas de estas proteínas funcionan cortando las hélices del ADN permitiendo que la misma rote
para reducir el grado de superenrrollamiento. Después de eso las enzimas hacen que se unan de
nuevo los fragmentos del ADN.
Las helicasas son proteínas que pertenecen al grupo de los motores moleculares.Es una enzima
vital de los seres vivos ya que participa en los procesos de replicación, transcripción,
recombinación y la reparación de ADN, y también de la biogenesis.

Polimerasas

Las polimerasas son enzimas que sintetizan cadenas de nucleótidos a partir nucleósidos trifosfato
y es capas de transcribir y duplicar acidos nucleicos.

Endonucleasa

13 de julio de 2015 Publicado por Ramón Contreras

Las endonucleasas son enzimas que son capaces de cortar cadenas de ADN o ARN en puntos
intermedios de la misma mediante la rotura del enlace fosfodiéster. Se denominan también
enzimas de restricción pues son empleados en experimentación para cortar hebras de material
genético en puntos concretos. En contraste las exonucleasas degradan las cadenas de bases
nitrogenadas desde los extremos. Lee más sobre estas últimas aquí (próximamente).

Las endonucleasas unen y cortan cadenas de ADN y ARN.

Las endonucleasas unen y cortan cadenas de ADN y ARN.

Cada endonucleasas es capaz de reconocer una secuencia concreta de la hebra de ARN o ADN,
cuyo número de bases varía con cada endonucleasa desde 4 bases hasta una docena. Algunas de
ellas son muy restrictivas con la secuencia que cortan, mientras que otras permiten variaciones en
la secuencia que recogen. Las secuencias que reconocen son muy variables aunque la mayoría de
ellas son palindrómicas, para que el reconocimiento pueda hacerse igual en cualquiera de las dos
hebras de ADN. Los enzimas de restricción se pueden dividir entre aquellos que producen un corte
recto o romo en la secuencia de ADN y los que dejan el extremo 3’ o 5’ más largo que el otro.

En la naturaleza: todos los seres vivos contienen endonucleasa que actúan como defensas contra
posibles invasiones de ADN o ARN de origen externo (bacteriano o vírico). Los intrones tipo IV son
eliminados de la secuencia de ARN gracias a una endonucleasa que actúa en dianas concretas. Lee
más sobre los intrones tipo IV en su propio artículo aquí (próximamente). Durante la replicación
del ADN es común que ocurran errores a la hora de introducir nuevas bases, cuando esto pasa las
endonucleasas inespecíficas son llevadas por otras proteínas hasta el error para quitar las bases
erróneas y posteriormente añadir con una polimerasa las que tocan.
Existen 3 tipos de endonucleasas: los tipos I y III son capaces, además de cortar de modificar las
bases metilándolas. Las de tipo I cortan en la secuencia que reconocen, mientras que los de tipo III
cortan entre 5 y 10 bases alejadas de la diana de reconocimiento. Además estos grupos necesitan
aporte energético (ATP) para moverse a lo largo de la cadena de ADN mientras reconocen la
secuencia. Por el contrario las endonucleasas tipo II no necesitan ATP, aunque requieren la
presencia del ión magnesio (Mg++) y solo reconocen secuencias muy concretas.

Utilidad en el laboratorio: algunas endonucleasas son utilizadas para cortar hebras de ADN con
muy diferentes finalidades. Entre ellas destacamos la recombinación mediante el corte de dos
ADN por la misma enzima para después poder ligar una con otra con otra enzima la ligasa. Existen
enormes listas de enzimas de restricción denominadas por las iniciales de la especie, normalmente
bacteriana de la que se extrae y luego un número en dígitos romanos, que hace referencia a
cuantas endonucleasas diferentes se pueden obtener de esa misma especie. Algunas de las más
comunes con EcoI o EcoV, que provienen de la bacteria Escherichia coli. Por ejemplo HindIII se
sintetiza a partir de la bacteria Haemophilus influenzae, aunque debido a la baja producción de
esta bacteria es más frecuente introducir el gen en E. coli para que este sintetice la enzima, para
su posterior purificación.

Replicación del ADN

Experimento Meselson y Stahl (1958)

El experimento de Meselson y Stahl en 1958 permitió demostrar que el mecanismo real se ajusta a
la hipótesis de replicación semiconservadora. Para ello se hicieron crecer células de Escherichia
coli en presencia de nitrógeno-15, un isótopo del nitrógeno más pesado de lo habitual. En
consecuencia, el isótopo se incorporó a las cadenas de ADN que se iban sintetizando, haciéndolas
más pesadas.

Una vez conseguido el primer objetivo, las células fueron transferidas a un medio que contenía
nitrógeno-14, es decir, un medio más ligero, donde continuaron su crecimiento (división celular,
que requiere la replicación del ADN). Se purificó el ADN y se analizó mediante una centrifugación
en gradiente de cloruro de cesio, en donde hay más densidad en el fondo del tubo que en la parte
media del mismo.En la primera generación se obtuvo una única banda de ADN con densidad
intermedia. En la segunda generación se obtuvieron dos bandas, una con densidad ligera y otra
con densidad intermedia o híbrida. En la tercera generación se obtuvieron dos bandas, una ligera
con una abundancia del 75%) y otra intermedia (con el 25% restante).La banda intermedia o
híbrida representa una molécula de ADN que contiene una cadena pesada (original) y otra ligera
(recién sintetizada). Las cadenas ligeras representan una molécula de ADN en la que las dos
cadenas han sido sintetizadas (no existían aun cuando las células se pusieron en presencia de
nitrógeno-15.
El hecho de que cada vez haya más moléculas ligeras y se mantenga el número de moléculas
intermedias demuestra que la replicación del ADN es semiconservadora. Si fuera conservadora,
aparecería siempre una banda pesada y el resto ligeras. Si fuera dispersante sólo aparecerían
bandas híbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.

La replicación avanza en forma de horquilla

Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble hélice de ADN se duplican al mismo tiempo,
éstas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la síntesis de una nueva
cadena. Por eso, la replicación avanza con una estructura en forma de horquilla formándose una
burbuja u ojo de replicación (también llamada estructura θ cuando el ADN es circular debido a la
similaridad entre la letra griega y la forma que adopta el cromosoma bacteriano en estados
intermedios de replicación, no obstante pudiendo aparecer estructuras alternativas), que avanza
en dirección a la región de ADN no duplicado dejando atrás los dos moldes de ADN de cadena
simple donde se está produciendo la replicación.

Bidireccionalidad

El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayoría de los casos, es decir, a partir de un

punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayoría de los
organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de
replicación que tienen lugar dependen de la propia estructura de su material hereditario (si el ADN
es circular, lineal, bicatenario o monocatenario). Así, en casos particulares como el ADN
mitocondrial, algunos plásmidos y algunos genomas monocatenarios de fagos pequeños, la
replicación se da unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orígenes de replicación.

Semidiscontinua

la replicación siempre se produce en sentido 5' → 3', siendo el extremo 3'-OH libre el punto a
partir del cual se produce la elongación del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas
tienen que crecer simultáneamente a pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena
tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas
debería ser sintetizada en dirección 3' → 5'.

Etapas de la replicación del ADN

1ª etapa. Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice.Intervienen un grupo de enzimas y

proteínas, a cuyo conjunto se denomina replisoma.

Primero: Intervienen las helicasas que facilitan el desenrrollamiento.

Segundo: Actúan las girasas y topoisomerasas que eliminan la tensión generada por la torsión en
el desenrrollamiento.

Tercero: Actúan las proteínas SSBP que se unen a las hebras molde para que no vuelva a
enrollarse.
2ª etapa. Síntesis de dos nuevas hebras de ADN

Actúan las ADN polimerasas para sintetizar las nuevas hebras en sentido 5´-3´, ya que la lectura se
hace en el sentido 3´-5´.

Intervienen las ADN polimerasa I y III, que se encargan de la replicación y corrección de errores. La
que lleva la mayor parte del trabajo es la ADN polimerasa III Actúa la ADN polimerasa II,
corrigiendo daños causados por agentes físicos.

La cadena 3´-5´es leída por la ADN polimerasa III sin ningún tipo de problemas (cadena
conductora).

3ª etapa. Corrección de errores

El enzima principal en esta fase es la ADN polimerasa III, que corrige todos los errores cometidos
en la replicación o duplicación. También intervienen otros enzimas como:

Endonucleasas que cortan el segmento erróneo.

ADN polimerasas I que rellenan correctamente el hueco.

ADN ligasas que unen los extremos corregidos.

Las Polimerasas de los eucariontes se denominan Polimerasa alfa, beta y gamma. La alfa es la
responsable de la elongación de la cadena. La beta esta implicada en los procesos de reparación.
La gamma es mitocondrial.

En procariontes el proceso de síntesis de histonas ocurre concomitantemente con la síntesis de

ADN.

Componentes del complejo de duplicación:

Polimerasa del ADN

Actualmente se conocen tres tipos de polimerasas de ADN, caracterizadas en E. coli, denominadas

I, II y III, según el orden en que fueron descubiertas. Las de tipo I y II funcionan sobre todo en los
procesos de reparación del ADN, en tanto que la de tipo III es la encargada de catalizar la
elongación de la cadena del ADN durante el proceso de repliación. Esta proteína es de estructura
compleja; está formada de varias subunidades, que juntas constituye una molécula de 600 kDa
aproximadamente. Las subunidades α, ε y θ forman el núcleo de la enzima, que contiene las
actividades de polimerización 5' → 3' y de exonucleasa 3' → 5', que le permiten agregar
nucleótidos trifosfatados a la cadena en crecimiento y retirar en el momento cualquier nucleótido
que se haya insertado de manera equivocada (corrección de lectura). La subunidad β es un
homodímero con estructura en forma de aro, que tiene la capacidad de abrirse y cerrarse
alrededor del ADN, y luego deslizarse por toda la longitud de la molécula, con el centro enzimático
de la enzima unida a ella. A esta capacidad de mantenerse sobre la cadena molde se le llama
procesividad. Las subunidades γ, δ, δ’, χ y ψ forman en conjunto el complejo γ, cuya función es
abrir y ubicar a la subunidad β sobre el dúplex de ADN, en una reacción que requiere ATP y
descargarla cuando se ha completado el proceso de replicación.Por último, la subunidad τ (tau)
tiene la función de mantener unidos dos núcleos de polimerasa en una sola moléculas.
En conjunto, todas estas subunidades forman un complejo enzimático que trabaja con un grado de
eficiencia y rapidez sumamente notable: tiene la capacidad de unir 500 nucleótidos por segundo
en las bacterias y 50 nucléotidos por segundo en los mamíferos, con una tasa de equivocaciones
de apenas un nucleótido por cada 109 nucleótidos agregados. A pesar de ser una enzima eficiente,
la polimerasa de ADN no tiene la capacidad de iniciar la síntesis de ADN de novo y siempre
requiere la presencia de una pequeña molécula de ARN llamada cebador (primer), que le
proporciona un extremo 3' para iniciar la síntesis.

Helicasas

Son proteínas que utilizan la energía de los enlaces del ATP para catalizar el desenrollamiento
parcial y transitorio de ácidos nucleicos de doble hebra. Para realizar su función, las helicasas por
lo general se reúnen en estructuras hexaméricas que adquieren una forma tridimensional de
anillo. El hexámero contiene un dominio de unió al origen, que reconoce el sitio de origen de
replicación y le permite ensamblarse a él. Este ensamble produce la distorsión y separación de la
doble hebra de ADN, en presencia de ATP y iones Mg++. Una vez sobre el ADN, las helicasas
pueden desplazarse a lo largo de cada una de las hebras en dirección 5' → 3'. A medida que se
desplazan, utilizan energía química que proviene de la hidrólisis del ATP para romper los puentes
de hidrógeno entre las bases, produciendo así la abertura de la molécula.

Primasas

Las primasas son enzimas que catalizan la formación de pequeños segmentos de ARN, de unos 11
nucleótidos de longitud,llamados cebadores o primers y que son absolutamente indispensable
para que la polimerasa de ADN funcione, ya que ésta, como se mencionó, requiere la presencia de
un extremo 3' libre preexistente para iniciar la síntesis de ADN.

Primers (o cebadores)

Los “primers” o cebadores son pequeños segmentos de ARN que se utilizan para iniciar la síntesis
de ADN.Para crecer la cadena de ADN, la ADN polimerasa requiere del extremo 3´-OH terminar de
un nucleótido, pero ¿cómo se inicia la síntesis de ADN?

El estudio cuidadoso de los fragmentos de Okazaki, revela que su extremo 5’ consiste de

segmentos de ARN que constan de 1 a 60 nucleótidos (lo cual depende de la especie) que son
complementarios con la hebra de ADN.

En Escherichia coli dos enzimas catalizan este proceso, la ARN polimerasa (es la enzima encargada
de la transcripción) y la primasa (monómero de 60 kD) que fabrica los fragmentos de Okazaki. La
ARN polimerasa es inhibida por rifampicina (inhibe la síntesis de la hebra líder). In vivo las enzimas
son sinergísticas.
Proteínas ssb

llamadas de este modo por las siglas en inglés de "proteína estabilizadora de la hebra simple"
(single strain binding protein), son moléculas que se unen cooperativamente a la hebra abierta del
ADN, impidiendo que tome su configuración de hebra doble. Se presentan en forma de
homotetrámeros, cada uno de los cuales abarca alrededor de 35 nucleótidos, a los que se unen sin
nigún tipo de especificidad.

Ligasas

Son enzimas que catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos de dos hebras
de ácidos nucleicos. Hay dos clases, según la fuente de energía que prefieren: las que utilizan
NAD+ como cofactor y que existen en las bacterias y las que usan ATP como cofactor, específicas
de los eucariontes. Su mecanismo de acción requiere tres pasos:

a) Formación de un enlace covalente entre la enzima y su cofactor. Esto produce la liberación de

una molécula de PPi.

b) La transferencia del nucleótido del AMP al fosfato del extremo 5' del ADN que se va a sellar.

c) Formación de un enlace fosfodiéster con la liberación de AMP.

dNTP’s y ddNTP’s

Los dNTPs son dATP, dTTP, dGTP ADN dCTP. Para la secuenciación de ADN, se necesitan una
mezcla de dNTPs y ddNTPs (nucleótidos didesoxi). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos
modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxiribosa. Estos
nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente. Pero no es posible que se una a
ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucleótido
didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.

Topoisomerasas
Son enzimas que cortan y ligan el ADN camviando su topología, sea induciendo la formación de
giros o relajando superenrollamientos. El corte se hace a nivel del enlace fosfodiéster,
transfiriéndolo a un residuo de tirosina de la enzima, en un proceso que requiere la presencia de
iones magnesio. Según el efecto que tienen las topoisomerasas sobre la molécula de ADN, se han
clasificado como sigue:

Tipo I: interaccionan de preferencia con ADN superenrollado, induciendo un corte en una de las
hebras, pasando la otra hebra por el corte, y volviendo a sellar, relajando de este modo la
molécula. No requier ATP para funcionar.

Tipo II: al contrario del tipo I, éstas se unen a ADN relajado, induciendo superenrollamientos. Sin
embargo, en presencia de ADN superenrollado negativamente, inducen corte y ligamiento de la
doble hebra, produciendo su relajación, en un proceso que requiere la presencia de ATP. en las
bacterias, las enzimas girasas son topoisomerasas de este tipo.

Fragmentos de Okazaki

Las micrografías electrónicas del ADN antiparalelo de doble hebra en replicación sugieren que el
proceso se lleva a cabo en un (o dos) horquillas de replicación. Se sabía que la ADN polimerasa
sólo puede extender las hélices en dirección 5´- 3´ Entonces ¿cómo se replica la cadena?

En 1968, Reiji Okazaki realizó el siguiente experimento:

Colocó células de Escherichia coli durante 30 segundos en un medio que contenía [3H] Timina;
posteriormente, centrifugó las células en un medio básico y obtuvo fragmentos de ácidos
nucleicos de 7 y 11S (Svedvergs, unidades de densidad), lo que significaba que contenían entre 1 x
103 y 2 x 103 nucleótidos. Después verifico el efecto del tiempo en la incubación y encontró que el
tamaño de los fragmentos era proporcional al tiempo, a estos fragmentos se les denomina
fragmentos de Okazaki.

Okazaki interpretó la presencia de estos fragmentos en términos de la replicación

semidiscontinua.

Dado que las cadenas del ADN son antiparalelas, y que la replicación procede solo en la dirección
5' a 3' en ambas cadenas, numerosos experimentos mostraron que, una cadena formará una copia
continua, mientras que en la otra se formarán una serie de fragmentos cortos conocidos como
fragmentos de Okazaki.

La cadena que se sintetiza de manera continua se conoce como cadena conductora y, la que se
sintetiza en fragmentos, cadena retrasada.

Los procariontes (al igual que los eucariontes) replican su ADN de forma continua en la hebra 5' -
3' (conductora) y de forma discontinua en la hebra 3' - 5' (retrasada).
Enzimas auxiliares en procesos que involucran DNA superenrrollado

Dentro de las enzimas que participan en procesos que requieren el desenrollamiento y separación
de las cadenas de un dúplex se encuentran las helicasas, las proteínas de unión al DNA de hebra
única (SSB) y las topoisomerasas. Muchas de estas proteínas colaboran con las DNA polimerasas y
otras enzimas que actúan en la transcripción y la recombinación en muchas ocasiones sus
actividades están asociadas a diferentes subunidades de las propias enzimas. Una característica de
muchas enzimas que actúan sobre los ácidos nucleicos es la procesatividad. Esta es la tendencia de
la enzima a permanecer unida al molde, en lugar de disociarse y reasociarse. Se puede definir
como “Número de nucleótidos incorporados por evento de unión entre enzimas y DNA” . Este
término será útil y aplicado en varias ocasiones.

Helicasas

Son enzimas que usan la energía de la hidrólisis de un NTP para romper los puentes de hidrogeno
que mantienen unidas las hebras del Dna de doble cadena, proporcionando DNAsc como molde
para las polimerasas siendo así esenciales para el progreso de la horquilla de replicación. Estas
enzimas desenrollan el DNA de doble cadena al comienzo de una horquilla de replicación, en un
momento específico de la recombinación homóloga o la reparación, pueden ayudar a liberar el
DNA del RNA en la Transcripción. Estas enzimas son proteínas multiméricas que usan la energía de
hidrólisis del ATP para provocar cambios conformacionales que impulsan a las helicasas
unidireccionalmente a lo largo del DNA. Pueden ser más o menos procesativas. Una vez que las
enzimas se unen al DNA se mueven en una dirección específica, acoplando su movimiento con la
hidrólisis del ATP y el desenrollamento de la cadena. Existen 2 tipos de acuerdo a la polaridad del
desenrollamiento:

(1) helicasas 3’ → 5’ (ej.: Rep, UvrD, PriA)

(2) helicasas 5’ → 3’ (ej: DnaB, RuvABC y Rho)

Otras como RecBCD poseen ambas polaridades en su actividad de desenrollamiento. Como

ejemplo estudiamos el mecanismo de la helicasa Rep de E. coli. Las células de E. Coli contienen ~6
helicasas diferentes. Las helicasas pueden ser estimuladas por otras proteínas como SSB, DnaC y
primasa.

Proteinas de unión al DNA de hebra única (SSB, single strand binding)

Se definen como proteínas que se unen al DNA, prefieren DNA a RNA y DNA de simple cadena
(scDNA) a DNA dúplex. Su unión es fuerte y cooperativa y no tiene actividades asociadas. Su
unión depende de la fusión transiente del dúplex. Se necesitan en forma estequiométrica en la
horquilla de replicación. Las SSB de E. coli retienen su forma tetramérica y función después de
calentarse a 100 °C, algunas de otras fuentes son monómeros o dímeros.
Topoisomerasas

Son un grupo de enzimas que convierten (isomerizan) una versión topológica del DNA en otra.
Ellas lo hacen por cambios en el número de uniones, número de veces que 2 cadenas se enrollan
alrededor una de otra. Todas las células bacterianas y eucarióticas poseen estas enzimas, cuya
funciones son introducir o eliminar superenrollamientos, algunas hacen ambas cosas.

Existen 2 tipos altamente conservadas, que se diferencian sobre la base de sus propiedades
mecanísticas y físicas:

Tipo I (Topo I)

Tipo II (Topo II)

Rompen una cadena y varían el número de superenrollamiento topológico (W) en una unidad.
Rompen ambas cadenas del DNA y varían el número de superenrollamientos topológicos
en 2 unidades.

Son monoméricas Son multisubunitarias

No necesitan cofactor de alta energía Requieren ATP

Alteran la superhelicidad a través de una mella transiente en una cadena Modula la

topología, pasando una hélice intacta a través de una rotura en las 2 cadenas

Generalmente relajan la hélice Regulan super y subarrollamientos, generalmente relajan

superhélices + y –, pero algunas como la DNA girasa introducen superhélices –. Resuelven
catenanos (que son DNAs concatenados inmediatamente después de la replicación).

En general se puede representar la acción de estas enzimas de la forma siguiente:

El mecanismo general de acción de una topo I se representa a continuación, estas enzimas se unen
a un terminal 3' ó 5' del DNA vía enlace fosfotirosil, este enlace conserva la energía necesaria para
el proceso, se cree que esta es la base del hecho de que estas enzimas no necesiten cofactor de
alta energía:

Como un ejemplo del mecanismo de acción de las topo II, expliquemos la DNA girasa de E. Coli,
esta enzima es un tetrámero de 2 tipos de subunidades. El DNA sustrato se enlaza alrededor de la
enzima, esta unión protege 140 pb del DNA de la digestión con nucleasa micrococal:

Cuando el DNA se enlaza a la enzima se crea una configuración que es equivalente a una súper
hélice +, lo que induce una súper hélice – en el DNA no enlazado. Entonces la enzima rompe la
doble cadena en la zona del cruzamiento con ella, pasa la otra parte de la doble cadena a través de
ella y sella la mella. Cuando la enzima libera el DNA su conformación cambia y para que inicie otro
ciclo debe ser restablecida la conformación original, Se piensa que la fuerza que dirige este
restablecimiento es la hidrólisis de ATP.
Las cantidades relativas de estas 2 enzimas en la célula están balanceadas, tendiendo a crear
cantidades equitativas de superarrollamiento (+) y (–). Mutaciones que bajan el número de
moléculas de topo I son viables si el número de moléculas de topo II también desaparece. Ambas
enzimas trabajan catalizando el rompimiento y unión de las cadenas fosfodiéster. A diferencia de
otras enzimas, su acción no conduce a un nuevo patrón de enlace covalente, sino más bien su
papel es crear aberturas temporales en la cadena polinucleótidica.

El hecho de que los extremos resultantes del corte queden unidos a la enzima, impide la rotación
libre de los mismos y por tanto la enzima limita su acción solo al completo relajamiento de la
doble hélice. En ambos tipos de topoisomerasas la característica crítica es el evento de paso de la
cadena en el DNA. Se paga un alto precio, se están generando rupturas en el material genético,
estas rupturas son intermediarios catalíticamente efímeros y están presentes en bajas
concentraciones por lo que son tolerados por las células. Cualquier condición que aumente la
concentración fisiológica o vida media de estas mellas produce muchos efectos colaterales
adversos, que incluyen mutaciones, inserciones, deleciones y aberraciones cromosomales, por ello
se dice que son duales en naturaleza, catalizan reacciones esenciales para la célula e infringen gran
daño al genoma.