INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Reporte de la práctica

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE
ENZIMAS PROTEOLÍTICAS.
MÉTODO DE KUNITZ
Alumno:
Hernández Santa Rosa Héctor Gabriel
Grupo:
4IV1
Sección I
Profesor:
RODRIGUEZ PAEZ LORENA IGNACIA
Fecha de entrega:
12-Marzo-2018
OBJETIVO
Utilizar el método de Kunitz para determinar la actividad enzimática de la tripsina, papaína
y bromelaina, así como su actividad específica por medio de curvas de actividad
enzimática.

INTRODUCCIÓN
En esta práctica, se podrá determinar la cantidad de triptófano y tirosina libres que son
producto de la hidrólisis de una proteína llamada caseína, llevada a cabo por 3 proteasas
diferentes (papaína, bromelaina y pepsina), utilizando el método de Kunitz, y así, con un
espectrofotómetro a una longitud de onda de 280 nm, conocer la concentración que hay
de dichos aminoácidos. La reacción que se lleva a cabo es la siguiente:

Las enzimas son biomoléculas que sirven como catalizadores biológicos, mientras que las
enzimas proteolíticas, también llamadas proteasas, son aquellas que hidrolizan (rompen
los enlaces peptídicos por medio de agua) en las proteínas para formar aminoácidos libres
y péptidos grandes y pequeños, por lo que son básicas para la digestión de los alimentos.
Además, las proteasas son ampliamente usadas en la industria alimentaria.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

Tubo Concentración de tripsina A280 corregida

(mg/mL)
1 0.04 0.245
2 0.08 0.365
3 0.12 0.408
4 0.16 0.512
5 0.20 0.523
Tabla 1: Actividad enzimática de la tripsina.
 0.6

0.5

0.4
Absorbancia

y = 1.7575x + 0.1997
0.3
R² = 0.9427
0.2
R = 0.9709

0.1

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Concentración de tripsina (mg/mL)

Gráfica 1: Curva de actividad enzimática de la tripsina.

Para conocer la actividad específica de la muestra de tripsina, se puede utilizar la siguiente

fórmula:

Donde UT son las unidades trípticas, 20 los minutos que permanecieron incubados los
tubos y la pendiente corresponde a la de la línea de tendencia en la gráfica 1.
Sustituyendo:

Por lo tanto, la actividad específica de la muestra de tripsina es de 0.08787 UT por cada

mg.

Para poder realizar la curva de actividad enzimática específica, se necesita saber cuántas
UT hay en cada uno de los tubos. Conociendo la concentración de tripsina (tabla 1), es
posible determinar cuántos mg hay en cada uno de ellos. Por lo tanto:
 0.08787 UT --------- 1 mg de tripsina
X UT --------- cantidad de tripsina en mg

Para el tubo 1:

0.08787 UT --------- 1 mg de tripsina

X UT --------- 0.04 mg de tripsina
X = 0.4552 UT en el tubo 1

Se realizó el mismo procedimiento para cada tubo y se construyó la tabla 2:

Tubo Unidades trípticas A280 corregida

1 0.4552 0.245
2 0.9104 0.365
3 1.3656 0.408
4 1.8208 0.512
5 2.2760 0.523
Tabla 2: Actividad enzimática específica para la digestión de caseína por tripsina.

0.6

0.5

0.4
Absorbancia

y = 1.7575x + 0.1997
0.3
R² = 0.9427
0.2
R = 0.9709

0.1

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Unidades trípticas

Gráfica 2: Curva de actividad enzimática específica para la digestión de caseína por tripsina.

Para conocer la actividad proteolítica de la bromelaina y la papaína, se necesitan los datos

obtenidos experimentalmente mostrados en la tabla 3.
 Tubo Proteasa en solución A280 corregida
I Bromelaina 1:10 0.562
II Bromelaina 1:20 0.375
III Papaína 1:2 0.038
IV Papaína 1:4 0.017
Tabla 3: Actividad enzimática de la papaína y bromelaina.

Considerando la gráfica 2 como una curva estándar general para la determinación de

actividad proteolítica, se tiene la siguiente ecuación de la recta:

y = 1.7575x + 0.1997

Donde “y” representa la A280 corregida y “x” representa las unidades trípticas. Despejando
x se obtiene:

y − 0.1997
𝑥=
1.7575
Sustituyendo la A280 para la solución 1:10 de la bromelaina (tabla 3):

0.562 − 0.1997
𝑥=
1.7575
x = 0.2061

Por lo tanto, las unidades trípticas en la solución 1:10 de bromelaina son 0.2061 UT.

Para conocer la actividad proteolítica específica de la bromelaina, es necesario saber

cuántas UT de esta proteasa hay por cada mg de piña, y para ello, se sabe que la solución
1:10 se preparo con 9 mL de regulador de fosfatos 0.1 M, pH 7.6 y un mL de una mezcla
que contiene el jugo de 25 g de piña en 35 mL totales. Realizando la siguiente relación:

25g de piña ---------- 35 mL totales

x g de piña ---------- 1 mL
x = 0.7142 g de piña por cada mL de mezcla

Al dividir esta cantidad entre los 10 mL totales de la solución 1:10, obtenemos que hay
0.07142 g de piña en ella. Por lo tanto, para la actividad específica de la bromelaina:

71.42 mg de piña ---------- 0.2061 UT

1 mg --------- x UT
-3
x = 2.88x10 UT por cada mg de piña
Preguntas adicionales
a) Defina actividad enzimática y actividad enzimática específica

«La actividad enzimática se expresa habitualmente en micromoles (μmol) de sustrato

convertidas en producto por minuto, en determinadas condiciones de ensayo
especificadas. Una unidad estándar de actividad enzimática (U) es aquella actividad que
cataliza la transformación de 1 μmol min-1 de sustrato. La actividad específica de una
preparación enzimática se define como el número de unidades de enzima por miligramo
de proteína (μmol min-1 mg de proteína-1 o U/mg de proteína)» (Devlin, 2004, p. 421).

b) Escriba la clasificación de las proteasas, en función de su mecanismo de acción y diga

en que grupo se ubican las determinadas en la práctica.

Las endopeptidasas difieren de casi todas las demás enzimas en que su especificidad de
sustrato resulta extremadamente difícil de definir, hecho que llevó a Hartley (1960) a
proponer una clasificación de las mismas basada en las características de sus respectivos
mecanismos catalíticos, constituyendo en la actualidad siete-subgrupos en la clasificación
internacional: endopeptidasas serínicas, endopeptidasas cisteínicas, endopeptidasas
aspárticas, metaloendopeptidasas, endopeptidasas treonínicas, endopeptidasas
glutámicas y endopeptidasas de mecanismo catalítico desconocido.

La tripsina pertenece a las proteasas serínicas, mientras que la papaína y la bromelaina

pertenecen a las proteasas cisteínicas. (Sedici.unlp.edu.ar, 2018a)

c) ¿Para qué se adiciona cisteína en las muestras de piña, y papaína? (ver preparación de
reactivos)

«Al igual que en las proteasas serínicas, la catálisis ocurre a través de la formación de un
intermediario covalente e involucra un residuo cisteína y un residuo histidina. La Cisteína
25 y la Histidina 159 (de acuerdo a la numeración de papaína) juegan el mismo rol de la
Serina 195 y de la Histidina 57, respectivamente. El nucleófilo en este caso no es un grupo
–OH, sino un ion tiolato que es estabilizado a través de la formación de un par iónico con
el grupo vecino imidazol de la Histidina 159. Siendo el nucleófilo atacante el par iónico
tiolato-imidazol en ambas etapas, no se requiere una molécula de agua. La cisteína
catalítica está involucrada en un equilibrio tautomérico entre las formas neutras y dipolar
(zwitterion). Se cree que el sulfuro aniónico está involucrado directamente en un ataque
nucleofílico en el carboxilo del sustrato. La ruptura del mismo implica el ataque del agua
catalizado por la enzima.» (Sedici.unlp.edu.ar, 2018b)

Dado que estas enzimas son inactivadas por reactivos bloqueantes de los grupos
sulfhidrilo por conversión en puentes disulfuro y tienen la capacidad de reactivarse en
presencia de agentes reductores, se las denominó “tiolproteinasas” (Hartley, 1960).
Considerando que el único aminoácido que posee un grupo sulfhidrilo (tiol) en la cadena
lateral es la cisteína, se sugirió sustituir el término “tiolproteinasas” por el de “proteinasas
cisteínicas”

c) ¿Cuál es la especificidad del enlace de la tripsina?

La especificidad del sustrato de la tripsina son la lisina y la arginina.

Discusión
Durante la preparación de los tubos usados en esta práctica (tabla 1), el orden en que se
añadían los reactivos fue muy importante; para los tubos problema, la primer substancia
agregada fue la solución de enzima, seguida de la solución de caseína. En este punto, la
proteasa actuó durante 20 minutos a 35°C, siendo esta la temperatura óptima para la
hidrólisis, para posteriormente ser interrumpida con ácido tricloroacético (TCA), el cual
precipita a los péptidos grandes y a las proteínas.

En el caso de los tubos testigo, primero se agrego la solución de enzima y después el TCA,
con lo cual la proteasa se precipitaría en la mezcla impidiéndole actuar sobre la caseína
que fue posteriormente agregada. A pesar de que en los tubos testigo no se llevo a cabo la
hidrólisis de la proteína, todos ellos presentaron una lectura de absorbancia positiva en el
espectrofotómetro debido a contenían triptófano y tirosina libres. La presencia de estos
aminoácidos en el jugo de frutas es muy normal, mientras que en la tripsina se debe a la
pureza de la misma. Es debido a la lectura positiva de los tubos testigo, que su
absorbancia se resto a la de los tubos problema y de esta manera no se tomó en cuenta a
los aminoácidos libres no hidrolizados por las enzimas.

Para calibrar el espectrofotómetro, no se usaron los tubos problema, se usó un blanco.

Este blanco se componía de TCA y agua destilada para así poder despreciar cualquier
absorbancia que presenten estas substancias y evitar un posible error en los cálculos.

Algo muy importante a destacar, es que la absorbancia presentada por la solución de

papaína (tabla 3) fue muy baja, impidiendo que su actividad enzimática fuera calculada.
De haberlo hecho, se hubieran obtenido cantidades negativas, representando un
resultado inverosímil. Las lecturas tan bajas en la absorbancia se pueden explicar por el
grado de madurez de la papaya, ya que las papayas verdes son más ricas en papaína en
comparación con las maduras. (Mejor con Salud, 2018)

Conclusión
Se pudo determinar satisfactoriamente la actividad enzimática específica de la tripsina y la
bromelaina, pero no la de la papaína.
Referencias
Devlin, T. (2004). Bioquímica, libro de texto con aplicaciones clínicas. 4ª ed. Barcelona:
Reverté, S. A., p.421.
Hartley, B.S. (1960). “Proteolytic enzymes”. Ann. Rev. Biochem., 29:45-72.
Mejor con Salud. (2018). Papaya verde o madura: ¿Cómo es más saludable comerla? -
Mejor con Salud. [En línea] Disponible en: https://mejorconsalud.com/papaya-verde-
madura-como-es-mas-saludable/ [Consultado 11 Mar. 2018].
Sedici.unlp.edu.ar. (2018). [En línea] Disponible en:
http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2249/Introducci%C3%B3n_al_mun
do_de_las_proteasas.pdf?sequence=5 [Consultado 11 Mar. 2018].